1、食品中蠟樣芽孢桿菌檢驗 1.1生物學特性 (1）形態特征屬是一大群需氧的革蘭氏陽性桿菌，菌體桿狀，大小為（0-1.3)um×(3-5)um；有一個或數菌體為球狀，不形成絲狀體，形成內生孢子。以側生鞭毛或周生鞭毛運動，或不運動。兼性需氧能形成不突出菌體的芽孢。菌體兩端較平整，多數呈鏈狀羅列，與炭疽桿菌相像。周生鞭毛，能運動，無莢膜。 (2）培養特性蠟樣芽孢桿菌生長溫度為25.37，最適生長溫度30-32 , 10以下停止繁殖。在肉湯培養基中生長，渾濁，有菌膜或壁環，振搖易乳化。在一般瓊脂上生成的菌落較大，直徑3-10mm，灰白色、不透亮，表面粗糙似毛玻璃狀或熔蠟狀，邊緣常呈擴展狀；偶有

2、產生黃綠色色素，在血瓊脂平板上呈草綠色溶血；在甘露醇卵黃多黏菌素(myp)平板上，呈伊紅粉色菌落。 蠟桿芽孢桿菌耐熱性較強，其37 16h的肉湯培養物的d80值（在80時使細菌數削減90所需的時光）為10-15min; 50時不生長。其繁殖體不耐熱，在100下加熱20min可破壞這類菌。游離芽孢能耐受100 30min，而千熱120經60min才干殺死。 (3）生化反應特性在葡萄糖肉湯中厭氧培養產酸，從、不產酸，分解糖類不產氣。大多數菌株還原硝酸鹽，50時不生長。 1.2致病性 引起食物中毒是因為該菌產生腸毒素。它產生兩種性質不同的代謝物，包括腹瀉毒素（dt）與嘔吐毒素（vt）兩種。dt是該菌

3、在對數生長久合成并釋放的胞外毒素，為多組分蛋白質，分子質量為38-40kda，對熱不穩定，45處理30min或56處理5 min就可以導致其失活，對鏈霉蛋白酶與胰酶敏感，但ph小于4或大于11時不穩定，抗原性較強可以產生特異性抗體，主要導致腹瀉、腹痛，但不發熱。由多組分蛋白質構成；而vt被認為是某些菌株在芽孢形成時產生的小分子多肽，分子質量普通小于5kda，熱穩定性好，120處理90min仍很穩定，且對胃酶與胰酶有抗尸性，在ph 2-11范圍內穩定，無抗原性，主要癥狀為惡心、嘔吐、偶有腹痛，也不發熱。蠟樣芽孢桿菌除了產生上述兩種腸毒素外，還產生溶血素等細菌毒素。 嘔吐型的埋伏期為0.5-6h；

4、中毒癥狀以惡心、嘔吐為主，間或有腹痙攣或腹瀉等癥狀，病程不超過24h。腹瀉型的埋伏期為6-15h，癥狀以水瀉、腹痙攣、腹痛為主，有時會有惡心等癥狀，病程約24h。 廣泛存在于塵埃、土壤、空氣、水體、動植物體表，以及各種裸露于空氣中的肉制品、乳制品、水果、干果、乳粉、奶油、生菜、炒米飯以及各種甜點等中，而且因為該菌能產生耐熱的芽孢，所以當食物被該菌污染而又加熱不足時簡單導致該菌繁殖，并產生細菌毒素，從而引起攝食者中毒。引起蠟狀芽孢桿菌食物中毒的食品大多數無腐敗變質現象，除米飯有時微黏、入口不爽或稍帶異味外，大多數食品感官正常。 二、常用檢驗培養基及檢測原理 常用蠟樣芽孢桿菌的挑選分別培養基為甘露

5、醇卵黃多黏菌素瓊脂培養基（myp）,myp中蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、維生素和生長因子；d-甘露醇為可發酵糖類；氯化鈉維持均衡的滲透壓；瓊脂是培養基的凝固劑；酚紅為ph指示劑；卵黃含有卵磷脂，蠟樣芽孢桿菌產生卵，在菌落周圍產生沉淀環；并不發酵d-產酸使菌落顯紅色；多黏菌素b可抑制雜菌的生長。 三、國家標準蠟樣芽孢桿菌檢測辦法 gb 4789. 14-2014食品平安國家標準食品微生物學檢驗蠟樣芽孢桿菌檢驗（第一法）平板計數法。 3.1檢驗程序 蠟樣芽孢桿菌的檢驗程序4-36所示。 3.2操作步驟 (1)樣品的制備取待檢樣品，用無菌剪刀將樣品剪碎，稱取樣品25g，放入盛有225ml無菌磷酸鹽緩沖

6、稀釋液（或無菌生理鹽水）無菌均質杯中，用旋轉刀片式均質儀以18000 - 20000r/min均質12min，或拍擊式均質器拍擊1-2min。若樣品為液態，吸取25ml樣品至盛有225ml pbs或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內可預置適當數量的無菌玻璃珠）中，振蕩混勻，作為1：10的樣品勻液。取1：10稀釋液1ml加到含有9ml無菌磷酸鹽緩沖液（或無菌生理鹽水）的稀釋瓶中，充分混勻制成1: 100的稀釋液。據對樣品污染情況的估量，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1ml無菌吸管或吸頭，普通狀況稀釋到10-6。 (2）樣品接種按照對樣品污染情況的估量，挑選2-3個

7、相宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），以0.3ml, 0.3ml, 0.4ml接種量分離移入三塊myp瓊脂平板，然后用無菌l棒涂布囫圇平板，注重不要觸及平板邊緣。用法前，如myp瓊脂平板表面有水珠，可放在25-50的培養箱里干燥，直到平板表面的水珠消逝。 (3）分別、培養在通常狀況下，涂布后，將平板靜置10min。如樣液不易汲取，可將平板放在培養箱30±1培養1h，等樣品勻液汲取后翻轉平皿，倒置于培養箱，30±1培養24h±2h。假如菌落不典型，可繼續培養24h±2h再觀看。在myp瓊脂平板上，典型菌落為微粉紅色（表示不發酵），周圍有白色至粉紅色沉

8、淀環（表示產卵磷脂酶）。 從符合計數要求每個平板中挑取起碼5個典型菌落（小于5個全選），分離劃線接種于養分瓊脂平板做純培養，30±1培養24h±2h，舉行確證明驗。在養分瓊脂平板上，典型菌落為灰白色，偶有黃綠色，不透亮，表面粗糙似毛玻璃狀或熔蠟狀，邊緣常呈擴展狀，直徑為4-10mm。 (4)確定鑒定 染色鏡檢：挑取純培養的單個菌落，革蘭氏染色鏡檢。蠟樣芽孢桿菌為革蘭氏陽性芽孢桿菌，大小為(l-1.3)um×(3-5)um，芽孢呈橢圓形，位于菌體中心或偏端，不膨大于菌體，菌體兩端較平整，多呈短鏈或長鏈狀羅列。 生化鑒定：挑取純培養的單個菌落，舉行過氧化氫酶實驗、動力

9、實驗、硝酸鹽還原實驗、酪蛋白分解實驗、耐性實驗、vp實驗、利用（厭氧）實驗、根狀生長實驗、溶血實驗、蛋白質毒素結晶實驗。蠟樣芽孢桿菌生化特征與其他芽孢桿菌的區分見表4-23。 注：“+”表示90 %-100的菌株陽性；“一”表示90 %-100的菌株陰性；“十一”表示大多數的菌株陽性；“一”表示大多數的菌株陰性。 a動力實驗：用接種針挑取培養物穿刺接種于動力培養基中，30培養24h。有動力的蠟樣芽孢桿菌應沿穿刺線呈蔓延生長，而覃狀芽孢桿菌常呈“絨毛狀”生長。也可用懸滴法檢查。 b溶血實驗：挑取培養物接種于胰酪胨大豆羊血瓊脂平板上，30±1培養24h±2h。蠟樣芽孢桿菌菌落為

10、淺灰色，不透亮，似白色毛玻璃狀，有草綠色溶血環或徹低溶血環。蘇云金芽孢桿菌和覃狀芽孢桿菌展現弱的溶血現象，而多數炭疽芽孢桿菌為不溶血，巨大芽孢桿菌為不溶血。 c根狀生長實驗：挑取單個可疑菌落按間隔2-3cm距離劃平行直線于經室溫干燥1-2d的養分瓊脂平板上，30±10c培養24-48h，不能超過72h。用蠟樣芽孢桿菌和覃狀芽孢桿菌標準株作為對比舉行同步實驗。覃狀芽孢桿菌呈根狀生長的特征。蠟樣芽孢桿菌菌株呈粗糙山谷狀生長的特征。 d溶菌酶耐性實驗：用接種環取純菌懸液一環，接種于溶菌酶肉湯中，36±1培養24h。蠟樣芽孢桿菌在本培養基（含0.001溶菌酶）中能生長。如浮現陰性反

11、應，應繼續培養24h。巨大芽孢桿菌不生長。 e蛋白質毒素結晶實驗：取經30培養24h并于室溫放置3-4d的養分瓊脂培養物少許于載玻片上，滴加蒸餾水混涂成薄膜。以自然干燥，微火固定后，于涂膜加甲醇半分鐘后傾掉，再通過火焰干燥，于載片上滴滿0.5堿性復紅液，放火焰上加熱微見蒸氣（勿使染液沸騰）后持續1-2min，移去火焰，使載片放置0.5min再傾去染液。用潔凈自來水徹底清洗、晾干、鏡檢。觀看有無游離芽孢和染成黑色的菱形毒素結晶體。如發覺游離芽孢形成的不豐盛，應將培養物置室溫2-3d再行檢查。蘇云金芽孢桿菌用此法檢測為陽性，而蠟樣芽孢桿菌群的其他菌種則為陰性。 試驗結果符合蠟樣芽孢桿菌群的形態特征

12、，動力實驗陽性，溶血實驗陽性，不能形成根狀生長和不產生蛋白結晶毒素，可報告為蠟樣芽孢桿菌陽性。 生化分型（選做項目）：按照對檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、淀粉水解、vp實驗反應、明膠液化實驗，將蠟樣芽孢桿菌分成不同生化型別，見表4-24。 注：表示90%-100的菌株陽性；一表示90一100的菌株陰性。 (5）結果計算典型菌落計數、確認和計算公式參照本章4.6.3.1金黃色葡萄球菌的baird-parker平板計數（其次法），其中a表示某一稀釋度蠟樣芽孢桿菌典型菌落的總數；b, b1 ,b2表示鑒定結果為蠟樣芽孢桿菌的菌落數；c,c1,c2表示用于蠟樣芽孢桿菌鑒定的菌落數。 (6)結果與報告按照myp平板上蠟樣芽孢桿菌的典型菌落數，按公式計算、報告每克（每毫升）樣品中蠟樣芽孢桿菌菌數，以cfu/g (cfu/ml）表示；如t值為0，則以小于1乘以最低稀釋倍數報告。須要時報告蠟樣芽孢桿菌生化分型結果。 四、fda/bam蠟樣芽孢桿菌檢測 蠟樣芽孢桿菌檢驗程序4-37所示。 蠟樣芽孢桿菌的分別物應符合下述條件：革蘭氏陽性產芽孢大桿菌，其芽孢不突出體外；在myp瓊脂上產生卵磷脂酶