1、培養基血清濃度對人表皮干細胞增殖分化的影響南京大學醫學院附屬鼓樓醫院 李云劍 林 樾 燕 辛 周宏礽 譚 謙【摘要】目的:比較不同血清濃度培養體系對表皮干細胞增殖分化的影響。方法: 采用兩步酶消化法和型膠原差速貼壁相結合的方法獲得人原代表皮干細胞,分別以0、5、10、15和20血清濃度的培養基在96孔板中進行培養。觀察表皮干細胞形態，克隆形成及增殖的情況，應用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測各組細胞存活和生長情況,分析量效和時效關系；持續傳代培養細胞，每次傳代的同時取適量細胞，用免疫細胞化學的方法進行表皮干細胞和表皮細胞相應標志物（K19、K14和K10）的測定。結果：表皮干細胞在各種血清濃

2、度的培養基內均能形成克隆，增殖良好。用四甲基偶氮唑藍(MTT) 比色法測定，所得相同時間點各組OD值在統計學上沒有差異（P0.05），表皮干細胞生長速度各組間無差異。第1代表皮干細胞K19均有表達，而K14和K10表達均為陰性；其后高血清濃度（15、20）培養基中細胞較低血清濃度（0、5）先出現K14、K10蛋白的表達；培養至第10代是各組細胞均出現K10高表達，而K19、K14表達陰性。結論:在低血清濃度(0、5)的培養基中表皮干細胞生長良好，且能夠相對較好保持表皮干細胞的特性。【關鍵詞】 表皮干細胞 血清濃度 增殖分化 培養【Abstract】 Objective To study the

3、 proliferation and differentiation of epidermal stem cells in medium with different level of serum. Methods to obtain the primary epidermal stem cell with two step enzyme digestion method and type IV collagen coated chosen methods. Culture the cell in medium with different serum level-0、5、10、15 and

4、20. The shape and clone formation and proliferation of the cell was observed through inverted microscope, tested by the MTT METHOD Immunocytochemistry was used to observe the expression of corresponding marker such as K19、K14 and K10 on epidermal stem cells in every generation after passaging. Resul

5、ts the epidermal stem cell can form clones in every kind of serum-medium, with well proliferation. There was no statistically significant difference in the OD values between different time points using MTT test. The expressing of the K19、K14、K10 in levelled serum-medium did not have obvious differen

6、ce at first, but there can detect gradual difference between these subgroups with different level of serum during passaging. Conclusion the epidermal stem cell will keep its characteristics and grow better in medium with lower serum.【Keyword】epidermal stem cells level of serum proliferation and diff

7、erentiation culture近年研究表明，表皮干細胞(epidermal stem cell, ESC)是皮膚發生、修復和重建的關鍵“種子細胞”。建立體外表皮干細胞的分離、純化和培養體系,探討ESC增殖、分化和遷移等機制已成為皮膚創面修復領域的研究重點。其中，分離、誘導和調控ESC，是組織工程化皮膚走向臨床應用的核心技術。雖然表皮干細胞可以在體外培養擴增,但其在培養過程中極易分化,臨床所需的表皮干細胞來源仍非常緊張。因此，如何在體外建立良好的培養體系，使得體外培養的表皮干細胞能夠快速增殖而不分化或者延遲分化便成了目前急需解決的問題。本研究中，我們通過改變培養基血清濃度，觀測表皮干細胞

8、的增殖分化現象，得到相對滿意的培養體系，為進一步研究表皮干細胞的分化、誘導等機制奠定了基礎。1 材料和方法型膠原、半琥珀酰氫化可的松、表皮生長因子、DMEM/F12(半琥珀酰氫化可的松，0.4mg/L；重組人表皮生長因子，10g/L；胰島素,0.5ml/L)（美國Sigma公司），抗角蛋白（抗-K19）19，抗角蛋白14（抗-K14），抗角蛋白10（抗-K10）等抗體（北京中杉金橋生物公司），胎牛血清(FBS)（杭州四季青生物公司）。MTT試劑盒（武漢博士德生物公司），D-Hank，s液自行配制準備。1.2 方法 ×1cm 大小,加入1U·ml1中性蛋白水解酶,4冰箱過夜。

9、次日，用 D-Hank，s液清洗3次,分離表皮和真皮。獲得的表皮放入 0.25 %胰蛋白酶+EDTA的消化液中,室溫消化5min后,加入含10%FBS的培養液終止消化,經200目細胞篩過濾,獲得角質形成細胞懸液。將角質形成細胞懸液1000 r· min1 離心 5min ,棄上清液 ,加入含10g·L1 表皮細胞生長因子(epidermal growth factor ,EGF) 的和10FBS DMEM/F12表皮干細胞培養液調節細胞數為 5 ×105· mL1 ,接種于已經用型膠原包被過96孔板12中 ,每孔 0.1mL ,37,5%CO2孵箱中培養

10、，約20min,去除懸浮的細胞和雜質，分5組分別加入含020的血清的培養液，繼續孵箱內培養，隔日換液 ,觀察細胞貼壁、增殖及克隆樣生長的情況。l 濃度為5 mg· mL1 的MTT ,置 37 5 % CO2 培養箱中培養 4h ,棄去上清液 ,每孔加入 200l 二甲亞砜 ,振蕩 10 min 后 ,在酶聯免疫檢測儀上測定各孔OD 值。×104·孔1接種于放有玻片并預鋪型膠原的24孔板中培養（培養液仍是020血清濃度）。24小時后，吸出培養液，DHanks沖洗3次，95的乙醇固定15min。D-Hank，s沖洗3次，3過氧化氫室溫孵育10min，以消除內源性過氧

11、化物酶的活性；每孔分別加200l的鼠抗人單克隆抗體 (K19、K14、K10)，滴度均為1：100，對照組加入D-Hank，s液，4孵育過夜。D-Hank，s沖洗3次，每孔加100l辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠的IgG，室溫下孵育30min；D-Hanks沖洗3次，DAB染色液顯色，顯微鏡下觀察，出現棕黃色后即可把玻片放入水中終止反應。蘇木精復染，鹽酸乙醇分色，氨水返藍。觀察K19、K14、K10染色陽性的細胞，比較各組間的差別。±s表示，采用SPSS13.0統計軟件處理數據，組間均數比較用 t 檢驗處理。2 結果2.1不同血清濃度培養體系對表皮干細胞增殖的影響 兩步酶消化結合型膠原

12、差速貼壁法1制備的表皮干細胞為單個、散在、圓形，折光性強，細胞核大，輪廓清晰的貼壁細胞，24小時后便能見到34個細胞形成的集落，此時細胞開始呈多邊形。隨著培養時間的增加細胞集落內細胞數增多，并漸漸聯合成片，約2周時間長滿瓶底。MTT檢測結果顯示不同血清濃度培養基對表皮干細胞的增殖無明顯影響（表1）。表 1 MTT檢測各組吸光度OD值結果（n=6, ±s）0%5%10%15%20%2d 0.760±0.0450.766±0.0760.770±0.0670.753±0.0540.786±0.0406d 0.881±0.0390.

13、858±0.0270.849±0.0160.859±0.0520.874±0.04610d 1.065±0.0271.069±0.0171.069±0.0221.048±0.0181.086±0.02814d 1.445±0.048 1.313±0.025 1.297±0.048 1.290±0.052 1.275±0.058相同時間點各組比較 P0.052.2 細胞免疫化學染色結果 第1代表皮干細胞K19均有表達（圖1-1），而K14和K10表達均為陰性

14、。細胞培養至第3代時，血清濃度較高（15、20）的培養基內K19表達減少而出現K14表達（圖1-2），而低血清濃度(0、5)培養基內暫未出現K14的表達。當細胞培養至第6代左右時所有血清濃度培養基內K19表達均明顯降低，鏡下幾乎見不到陽性細胞，低血清濃度(0、5)培養基內的細胞K14表達增加，未見明顯K10陽性細胞表達；高血清濃度（15、20）培養基內的細胞K14表達亦有減少，出現了K10陽性細胞的表達。細胞培養至第10代時，各組血清濃度培養基內細胞均以K10表達為主（圖1-3）。 圖11細胞中K19的表達 圖12細胞中K14的表達 圖13細胞中K10的表達（免疫組織化學×100）3

15、 討論 表皮干細胞在體能夠自我復制并分化成皮膚組織而維持了皮膚組織的自我更新；在皮膚組織受損或者體外培養時都會被激活并增殖從而形成皮膚組織2-3。從而可以看出表皮干細胞極易分化，這對皮膚組織的自我更新是很有利的，但是從組織工程的角度看又是相當不利的。用組織工程的方法重建皮膚組織需要大量的維持干細胞特性的“種子細胞”，需要利用少量的表皮干細胞培養增殖達到足夠重建皮膚“種子細胞”的量比較困難4。要想獲得足夠的“種子細胞”體外培養是必不可少的一項重要技術方法。大多數動物細胞的體外培養，都不同程度地依賴血清才能生長增殖。血清除了供給細胞的營養成分外，還能促使細胞合成DNA，對細胞增殖的促進作用很大。現

16、已清楚，血清在體外培養細胞中的作用，主要是提供了細胞增殖所必需的生長因子，然而，同時因為血清的成分十分復雜，特別是對一些基礎理論研究，使用不同血清濃度也可能影響實驗結果5。對表皮細胞培養的研究發現，根據其生長潛力可將其分為3類：(1)完全克隆細胞，即干細胞，具有強大的生長增殖潛力；(2)間生態克隆，即暫時擴充細胞(transit amplifying cell，TAC)；(3)終末分化細胞鱗狀細胞6。已有研究表明隨著分化程度的不同，表皮細胞表達不同的角蛋白，因而可用于鑒別ESC、TAC及終末細胞。19和15被認為是ESC的陽性標志，TAC表達5和14，而分化的終末細胞表達1 和107-8。本研

17、究中表皮干細胞在不同血清濃度培養體系中均能夠成活、增殖。表皮干細胞成活率及增殖的速度并不隨著血清濃度的增加而明顯增加，各組間經MTT法所測得的OD值在統計學上并不存在差異。而在表皮干細胞及表皮細胞標志物的測定上卻存在著明顯差異,主要體現在細胞傳代至36代，相應代數的不同組間細胞標志物的測定出現了明顯的差異。提示不同血清濃度的培養體系在對表皮干細胞的分化上有著特殊的影響。血清是一種很復雜的混合物，含有豐富的細胞生長必須的營養成份，能夠維持表皮干細胞成活，并促進增殖。同時血清中含有的成分能誘導細胞使其發生分化，有研究者在行其他干細胞研究時同樣發現了不同血清濃度對其他干細胞的分化產生不同的影響9。可

18、能與血清中含有的VEGF、EGF、bFGF等多種細胞生長因子有關，細胞生長因子對細胞增殖、分化影響均存在一定的量效關系。因此才出現本研究中隨著培養基中血清濃度的逐漸增加對細胞的分化促進作用逐漸不同，即低血清濃度培養基內表皮干細胞特性的維持比高血清濃度培養基內的特性維持的時間要長，這些結果和劉緣10等人在神經干細胞研究中的結果一致。該實驗所用低血清濃度培養體系能夠使得表皮干細胞存活、快速增殖，并能夠很好的維持表皮干細胞的特性。但是是血清中何種活性成分對表皮干細胞的分化影響較大，是一種活性成分在起作用，還是多種活性成分共同作用，能夠產生生物活性的濃度是多少，等等，都是需要進一步深入研究的問題。對這

19、些問題的深入研究必將對表皮干細胞成為良好的“種子細胞”，為皮膚的組織工程的研究產生積極的影響。參考文獻1Olszewski WL.Stem cells of the human skin epithelium-can they be isolated and resume function as single-cells transplanted into recipient skin defects? J Ann Transplant 2004,9:34-36 2胡葵葵，胡瓊華，戴育成。表皮干細胞的研究進展M。國外醫學皮膚性病學分冊，2004，30：1051073 Bickenbach JRChism ESelection and extended growth of routine epidermal stem cells in cultureJExp Cell Res，1998.244（1)：l844 Morasso ML,Tomic-Canic M.Epidermal stem cells: the cradle of Epidermal determination ,differentiation and wound healingJ.Bio cell2005，97：1731835 E Z. Technology of tissue and m