1、實驗一胰蛋白酶活性測定實驗目的：掌握測左胰蛋白酶濃度、活性、比活的原理與方法。實驗原理：胰蛋白酶相對分子量23.7 KD,主要水解肽鏈中堿性氨基酸與英它氨基酸相連接的 肽鍵，此外還能水解堿性氨基酸形成的酯鍵，如把人工合成的N-苯甲酰丄-精氨酸乙酯(N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE)水解為 H苯甲酰精抵酸(BA)。H-5NH朋師 OC2HH _一 HKH 一一-c胰蛋白酶，Ca"pH 8.0BAEEHNH - H I L N-ONO-OO-O B3 N )H2)H-=OHA+ C2HeOH乙醇胰蛋白酶所催化的上述反應中，產物BA對253 nm的光

2、吸收遠大于BAEE,因此可以在實驗起 始點把253 nm的消光值調為零，然后記錄反應體系對253 nm的消光值的增量，并把這個增量 作為測怎胰蛋白酶的活性指標。酶活單位定義：在底物BAEE濃度lmmol/L,光程1 cm,波長253nm,溫度25 C 測量體積3n】L,.條件下吸光值每分鐘遞增0.001 (AA/min=0.001)為1個BAEE酶活單位。胰蛋白酶制劑中蛋白質濃度含義：胰蛋白酶含量一般E攸表達。這個值的含義是：濃度為1%酶蛋白，在1cm光徑下，對紫外280nm 的消光值。不同廠家、不同產品的E臨值有很大差別。E攸值越髙，表明酶制劑中酶蛋白含量越 高°由于酶制劑中蛋白質

3、含雖各不相同，所以用酶制劑配制E依的蛋白質溶液時，按照廠家對產品 的E詫的測龍值配制溶液。在本實驗中，脇蛋白酶酶蛋白樣品采用SIGMA公司生產的產品,生產公司對展品的描述是對 280nm紫外吸收值15.3,配制胰蛋白酶標準溶液可根據廠家的這個說明。器材以試劑：器材，電子天平，紫外分光光度計，微量加樣器。試劑：標準胰蛋白爾，N-苯甲 酰丄-精氨酸乙酯，HCI.Tris。1. 胰蛋白酶活性測定：1) 配制童的胰蛋白酶溶液每組取E攸=15.3的胰蛋白酶樣品10mg放到lml去離子水中，充分溶解后，放入冰中保存。2）按照表1的要求配制試驗體系所需英它各種溶液.3）按照表1的順序進行測左標準胰蛋白酶的活

4、性。表1腕蛋白酶活性測定加樣順序試劑步驟1:空白調零步驟2：樣品測定0.1 mol/LTris-HCl 緩沖液,pH &0,1.5 mL1.5 mL2.0 m mol/L BAEE1.5 mL1.5 mL25°C 預熱 5min25°C 預熱 5min胰蛋白酶：10mg/niL0 gL10 gL蒸佛水10 pLOpL充分搖勻充分搖勻步驟 1： AA253 nm/min調0步驟 2： AA253-nm/min記錄在步驟2樣品測左中，加入酚液后立即蓋上蓋迅速混勻汁時，每半分鐘讀數一次，共讀34min° 測得的結果要使厶A253nm/min控制在0.05-0.1

5、00之間為宜，若偏離此范用則要適當增減酶量（5 HL -20 nL之間，空白試驗相應增減等體積水）后重新測立，一直到Azssnm/min值落在0.05 0.100之間為止。3分別求算：1）標準胰蛋白酶溶液（濃度10mg/mL）的酶活和比活:計算方法：i）胰蛋白酶活性單位數計算:胰蛋白酶活力單位（隔戦血5篇鬲為積（噸X稀釋倍數H）胰蛋白酶比活il算:（用BAEE單位數/mg胰蛋白酶表示比活）胰蛋白酶比活力（加血單位mg）-稀釋倍數酶液活力（必應單位泌）酶液蛋白含量（mg wZ）xM加入體祝（mL）實驗二 胰蛋白酶動力學測定實驗目的：初步掌握以下幾個酶動力學參數測宦與求算方法：來氏常數Km,最大反

6、應速度Vmax, 轉換數Kcat,特異性常數Kcat./Knio 實驗原理：已知胰蛋白酶遵守米氏方程，可以通過測怎底物濃度與反應速度間的關系測龍與求 算這個酶的諸動力學參數。胰蛋白酶可以水解堿性氨基酸的按基所生成的肽鍵、酰胺建和酯鍵° 在本實驗中，利用胰蛋白酶水解酰胺鍵活性的性質，以苯甲酰丄精氨酰對硝基苯胺(BAPA)作底物測圧這個酶的動力學參數，反應式如下:4-NA反應最適PH8. 1,最適溫度25 °Ce反應產物之一：對硝基苯胺(p-Nitroaniline. 4-NA)呈黃色,對405nm波長光的摩爾吸光系數為9870,但底物BAPA和另一個產物BA對405nm波長的

7、光 基本不吸收，因此本實驗測泄光波的波長設在405nm ±,把起始反應的吸光值調為0,記錄消光值的變化。L-BAPA最大濃度低于5xlOlmol/L時這個酶促反應符合米氏方程，可用Hanes作圖法求動力學參數。Hanes作圖法是單倒數作圖法，把米氏方程變形為:S在實驗中設立一系列底物濃度SJ,測左每一個底物濃度條件下的反應速度Vi然后用Si/Vi對Si作圖，可以得到一條線段，線段在y軸的截距是Km/Vmax,線段的延長線在X軸的截距是Km,據此可以得到Km和Vmax值：Kcat=Vmax / E° 印是酶的初始濃度，已在實驗設左 為已知，因此Kcal可以得岀：特異性常數Km

8、/ Kcat可根據上述已知數計算出來。器材與試劑：器材：756紫外-可見分光光度計，恒溫水浴鍋，分析天平，秒表，容量瓶，移液器。試劑：1. O.lmol/L pH8l 的 TrisHCI 緩沖液（含 0.4%CaCh）：取 O2mol/L Tris （Mr=121.14） lOOmL 與0.2mol/L HCI 52.4mL混勻,加入O.8gCaCh,蒸憾水定容到200mL （pH值需用計pH校正）。2. lmmoin. DL-BAPA （Mr=434.9）水溶液：稱取43.49mg BAPA,蒸飾水溶解并加熱到80吃 以上，完全溶解后苣冰水中冷卻，泄容到lOOmL。這個濃度為lmn】ol/L

9、的DL-BAPA溶液命需 為第六組母液，按照逐步稀釋原則配制下列溶液濃度系列：0.8m moI/L （第五組母液，25mL）： 0.6m mol/L （25mL,第四組母液）;0.4m mol/L （25mL,第三組母液）；0.2 m mol/L （10mL, 第二組母液）：0.1mmol/L （10mL,第一組母液）。3. 60% （V/V）乙酸溶液4. 胰蛋白酶溶液，該酶的比活1.0x10'BAEE單位/mg蛋白實驗步驟：1. 計算胰蛋白酶加樣體積：在本實驗中加入胰蛋白酶的量是60腿，實驗1已經測到胰蛋白酶的 比活和濃度（迎4山），根據這些值訃算加入體系的酶液體積的"L數

10、。2. 實驗溶液系統：本實驗有6組實驗組成。實驗順序按照表2的加樣程序執行。表2.測定Km和Vmax值加樣表組BAPA母液濃度(m mol/L)加入BAPA 液<mL)加入Tris-HCI(mL)加入荻at白陽（gL）加入60%乙酸（mL）反應體系底物BAPA濃度<ni mol/L）VA4I>51.0.1樣品1,2.01.5n0.4|Sj |0.05對照1.2.01.600.40.2樣品2.2.01.5n0.4S2IO對照2.2.01.600.430.4樣品3.2.01.5n0.4(Sj| 0.2對照3,2.01.600.440.6樣品丄2.01.5n0.4IS4IO.3對照

11、4,2.01.600.450.8樣品5,2.01.5n0.4|S$|0.4對照5,2.01.600.461 .0樣品6.2.01.5n0.4ISJ0.5對照6.2.01.600.425吃 保溫5 min后，搖勻，秒表計時，準確反應2min后加入0.4mL 60%的乙酸溶液，搖勻終 止反應。反應溶液總量應達到4mL.不足部分可加蒸餡水補足。對照試管不加入胰蛋白酶，只加 入0.4mL60%的乙酸溶液。最后分別記錄樣品和對照的人05值，每組種兩者的差值人密代入下式即可得到對應于SJ的Vi9870x1060x2表2列岀的是6個實驗，鑒于目前實驗室尚沒有12個槍頭的加樣，所以每一個實驗都可獨立進 行。需

12、要特別注意：1）比活大于1.0xl（H BAEE u/mg protein的胰蛋白酶制劑，純度范圍是90%-100%, 一般可達 到95%97%。在計算動力學參數時，如無特殊精確要求，可按照胰蛋白酶100%的近似值計算。 在本試驗中，可根據濃度胰蛋白酶濃度10ing/ml,純度100%,每個試管要求加入質量數60訊, 計算出每個試管加入的胰蛋白酶溶液微升數。2）在進行動力學參數計算時，要進行般蛋白酶質就摩爾數轉換，如無特殊要求，也可以把脇 蛋白酶純度近似為100%.3）如果有求精確，但產品說明沒有給出腦蛋白酶在固形物中的百分含量，就需配制一定濃度的 固形物溶液，首先測定蛋白質濃度，通過求算蛋白質總量，得到蛋白質在酶制劑中的重量比。 然后通過雙向電泳，圖像掃描，把掃描結果輸入計算軟件，按照軟件步驟，求算胰蛋白酶在全 部蛋白樣品中的百分比。把實驗設泄的每一個Si和測定到的對應的Vi換算成Si/Vi后,填入表3,作圖求Km, Vmax 表3. Hanes作圖的數據(Si/v,:SiJ/v,S2/v2 S3/v3 S4/v4 S5/v5 S6/v6Si：SiS2SiSJS5S6用S/v對S作圖可得到一條線