1、實(shí)驗(yàn)一 薄層層析板的制備一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?制備薄層層析板，使葉綠素在層析板上分離顯色。二、 實(shí)驗(yàn)原理薄層層析，常用 TLC（Chromatography）表示，又稱薄層色譜，屬于液固吸附色譜。是近年來發(fā)展起來的一種微量、快速而簡單的色譜法，它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)。一方面適用于小量樣品（幾到幾十微克，甚至 0.01 g ）的分離；另一方面若在制作薄層板時(shí)，把吸附層加厚，將樣品點(diǎn)成一條線，則可分離多達(dá) 500mg 的樣品。因此又可用來精制樣品。故此法特別適用于揮發(fā)性較小或在較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物資。 薄層吸附色譜的吸附劑最常用的是氧化鋁、硅膠、硅藻土、聚酰胺和纖維素。其顆粒

2、大小,一般要求直徑為1040m。硅膠是無定形多孔性物質(zhì)，略具酸性，適用于酸性物質(zhì)的分離和分析。薄層色譜用的硅膠分為： “硅膠 H ”不含粘合劑；“硅膠 G ”含煅石膏粘合劑；“硅膠 HF 254 ”含熒光物質(zhì)，可用于波長為 254nm 紫外光下觀察熒光；“硅膠 GF 254 ”既含煅石膏又含熒光劑等類型。 粘合劑除上述的煅石膏（半水合硫酸鈣： 2CaSO4 · H2O ）外，還可用淀粉、羧甲基纖維素鈉。三、 實(shí)驗(yàn)材料、器具1、試劑 硅膠、4的CMC溶液（羧甲基纖維素鈉）2、實(shí)驗(yàn)用具：藥匙、研缽、載玻片、量筒、玻棒四、實(shí)驗(yàn)步驟1、載玻片要求平滑清潔，沒有劃痕，在使用前可用洗滌液或肥皂水

3、洗滌，再用水沖洗干凈。（干凈的標(biāo)準(zhǔn)：水不是呈股流下，而是呈瀑布狀態(tài)流下。）2、與硅膠混合：CMCNa溶液與硅膠的比例為3:1(3ml：1g)。取CMCNa溶液倒入研缽中，然后加入硅膠，在研缽中研磨，按一個(gè)方向研磨，自下而上，然后自上而下，以趕盡氣泡為佳。3、鋪板：將載玻片置于平臺(tái)上，用藥匙舀取糊狀硅膠，均勻地鋪在載玻片表面。鋪板時(shí)，可以順著板中間倒，也可以順著某個(gè)邊緣倒，也可以用玻璃棒引著溶液平鋪在玻璃板上，倒時(shí)也要注意不要引入小氣泡。尤其是載板的四個(gè)角，容易高出玻璃板其他部位，所以要格外注意。后輕顛幾下薄層板即可。顛好的板，表面看上去要光滑平整，沒有氣孔。薄層板鋪好后一定要放置在平的臺(tái)面上，

4、否則難保證板面硅膠的厚度均勻。（3g硅膠大約可鋪7.5×2.5cm載玻片5-6塊）4、晾干：置水平臺(tái)上于室溫下晾干。5、活化：將晾干的板子在105烘箱中干燥30min，然后取出，放入干燥器中，備用。活化硅膠有利于提高硅膠的吸附性能，同時(shí)排除硅膠內(nèi)部已吸收的水分及其他氣體。通過活化硅膠，主要改變了硅膠內(nèi)部的微孔結(jié)構(gòu)，使其孔徑的大小及微孔結(jié)構(gòu)的排列得到進(jìn)一步的改善。但是這樣硅膠的吸附變大，可能會(huì)使樣品分離困難。下面先介紹一下配置方法：  1. CMCNa溶液的配置：一般其濃度為0.30.5，根據(jù)自己經(jīng)驗(yàn)而定（我習(xí)慣用0.4的）。具體方法如下：先將預(yù)用的水加熱至6070

5、，然后加入CMCNa，邊加邊攪拌，使之溶解，即得。  2. 與硅膠混合：CMCNa溶液與硅膠的比例為3：1。具體方法如下：先將CMCNa溶液倒入自動(dòng)攪拌器或研缽中，然后加入硅膠，攪勻即可。若是在研缽中研磨，按一個(gè)方向研磨，自下而上，然后自上而下，以趕盡氣泡為佳。  3. 鋪板：手動(dòng)或機(jī)械。手動(dòng)鋪出的板的薄厚與所加的混合后的硅膠量有關(guān)，而機(jī)械鋪出的板的薄厚與機(jī)械所選用的鋼板有關(guān)，可根據(jù)需要來定。但此過程中最關(guān)鍵的是板子邊緣鋪得好壞，手動(dòng)鋪板一定要將玻璃板邊緣硅膠涂勻（我習(xí)慣用兩頭掂法，即板下方的中間墊一物體，兩頭懸空，兩手均勻掂動(dòng)）。而機(jī)械鋪板要注意板與板

6、之間平整性，或者由高到低排列。  4. 晾干：自然晾干。  5. 活化：將晾干的板子在105烘箱中干燥30min，取出，放入干燥器中，備用。  這是實(shí)驗(yàn)室和檢驗(yàn)室薄層層析板常用的制備方法之一，供大家參考！層析 英文名稱：chromatography定義1：基于不同物質(zhì)在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)不同而將混合組分分離的技術(shù)。當(dāng)流動(dòng)相(液體或氣體)流經(jīng)固定相(多孔的固體或覆蓋在固體支持物上的液體)時(shí)，各組分沿固定相移動(dòng)的速度不同而分離。能用于微量樣品的分析和大量樣品的純化制備。定義2：利用某種類型的固定介質(zhì)，根據(jù)混合物分子的電荷大小和分

7、子量不同等性質(zhì)，在流動(dòng)相和固定相之間進(jìn)行分離的一種生物化學(xué)技術(shù)。層析（chromatography）是“色層分析”的簡稱。利用各組分物理性質(zhì)的不同，將多組分混合物進(jìn)行分離及測(cè)定的方法。有吸附層析、分配層析兩種。一般用于有機(jī)化合物、金屬離子、氨基酸等的分析。層析利用物質(zhì)在固定相與流動(dòng)相之間不同的分配比例，達(dá)到分離目的的技術(shù)。層析對(duì)生物大分子如蛋白質(zhì)和核酸等復(fù)雜的有機(jī)物的混合物的分離分析有極高的分辨力在把微細(xì)分散的固體或是附著于固體表面的液體作為固定相，把液體（與上述液體不相混合的）或氣體作為移動(dòng)相的系統(tǒng)中，使試料混合物中的各成分邊保持向兩相分布的平衡狀態(tài)邊移動(dòng)，利用各成分對(duì)固定相親和力不同所引起

8、的移動(dòng)速度差，將它們彼此分離開的定性與定量分析方法，稱為層析，亦稱色譜法。根據(jù)移動(dòng)相種類的不同，分為液體層析、氣體層析二種。用作固定相的有矽膠、活性炭、氧化鋁、離子交換樹脂、離子交換纖維等，或是在硅藻土和纖維素那樣的無活性的載體上附著適當(dāng)?shù)囊后w，也可使用其他物質(zhì)。將作為固定相的微細(xì)粉末狀物質(zhì)裝入細(xì)長形圓筒中進(jìn)行的層析稱為柱層析（column chromatogra-phy），在玻璃板上涂上一層薄而均的物質(zhì)作為固定相的稱為薄層層析（thin-layer chromatography），后者可與用濾紙作為固定相的紙上層析進(jìn)行同樣的分析，即在固定相的一端，點(diǎn)上微量試料，在密閉容器中，使移動(dòng)相（液體）

9、從此端滲入，移動(dòng)接近另一端。通過這種展開操作，各成分呈斑點(diǎn)狀移動(dòng)到各自的位置上，再根據(jù)Rf值的測(cè)定進(jìn)行鑒定。當(dāng)斑點(diǎn)不易為肉眼觀察時(shí)，可利用適當(dāng)?shù)娘@色劑，或通過紫外燈下產(chǎn)生熒光的方法進(jìn)行觀察。也可采用在第一種移動(dòng)相展開后再用另一移動(dòng)相進(jìn)行展開（這時(shí)的展開方向應(yīng)與原方向垂直），使各成分分離完全的雙相層析（two-dimensional chromatography）。分離后，將斑點(diǎn)位置的固定相切取下來，把其中含有來自試料的物質(zhì)提取進(jìn)行定量分析。但為制備與定量，柱層析則更為適宜。在柱層析中，移動(dòng)相從加入試料的一端展開到達(dá)另一端后，繼續(xù)展開使各成分和移動(dòng)相一起向柱外分別溶出，這就是廣泛使用的所謂洗提層

10、析（elution chromatography）。層析根據(jù)固定相與溶質(zhì)（試料）間親和力的差異分為吸附型、分配型、離子交換型（離子交換層析）等三種類型。但這并不是很嚴(yán)格的，有時(shí)常見到其中間類型。此外，近來也應(yīng)用親和層析，即將與基質(zhì)類似的化合物（通常為共價(jià)鍵）結(jié)合到固定相上，再利用其特異的親和性沉淀與其對(duì)應(yīng)的特定的酶或蛋白質(zhì)。按層析的機(jī)理劃分： 吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。 吸附層析：利用吸附劑表面對(duì)不同組分吸附性能的差異，達(dá)到分離鑒定的目的。 分配層析：利用不同組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之分離。 離子交換層析：利用不同組分對(duì)離子交換劑親和力的不同

11、。 凝膠層析：利用某些凝膠對(duì)于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。 按流動(dòng)相與固定相的不同劃分： 氣相層析、液相層析。這兩大類層析是以流動(dòng)相不同來劃分的。如同時(shí)區(qū)分流動(dòng)相和固定相，劃分為：氣固層析、氣液層析、液固層析和液液層析等。 按操作形式劃分： 柱層析、紙層析、薄層層析、高效液相層析等。 柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)而達(dá)到分離。 紙層析：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開，以達(dá)到分離鑒定的目的。 薄層層析：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。 以上劃分無嚴(yán)格界限，有些名稱相互交叉，如親和層析應(yīng)屬于一種特殊的吸附層析，紙層析是一種分配層析

12、，柱層析可做各種層析。基本原理層析須在兩相系統(tǒng)間進(jìn)行。一相是固定相，需支持物，是固體或液體。另一相為流動(dòng)相，是液體或氣體。當(dāng)流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，被分離物質(zhì)在兩相間的分配，由平衡狀態(tài)到失去平衡到又恢復(fù)平衡，即不斷經(jīng)歷吸附和解吸的過程。隨著流動(dòng)相不斷向前流動(dòng)，被分離物質(zhì)間出現(xiàn)向前移動(dòng)的速率差異，由開始的單一區(qū)帶逐漸分離出許多區(qū)帶，這個(gè)過程叫展層。 系數(shù)K是物質(zhì)在兩相中的濃度比。K值大，則在固定相中吸附牢，K值小吸附差。各物質(zhì)間的K值差別大，則易被分離。不同類型層析的K值含義不同，可視為吸附平衡常數(shù)，分配常數(shù)或離子交換常數(shù)等。 研究層析現(xiàn)象而發(fā)展的塔板理論，與有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的分餾法原理有些相似。被分

13、餾的有機(jī)溶劑在分餾柱內(nèi)的填充物上形成許多熱交換層，從而把低沸點(diǎn)溶劑先分餾出來，達(dá)到純化的目的。在層析時(shí)用理論塔板數(shù)n來衡量層析效能。 tR為物質(zhì)在層析柱上的保留時(shí)間，W為洗脫下來的物質(zhì)峰形的寬度。n值愈大表示層析柱的效能愈高。如用理論塔板高度H表示，則包含了層析柱長度的因子。 式中L為層析柱的柱長。H值越大，則柱效越低。 此外影響層析分離效果的還有渦流擴(kuò)散、縱向擴(kuò)散和傳質(zhì)阻抗等因素。因此選擇層析固定相支持物的粒度、均勻度等物理性能，流動(dòng)相的層析系統(tǒng)和溫度等都是做好層析的關(guān)鍵幾種常用的層析吸附層析 吸附劑的吸附力強(qiáng)弱，是由能否有效地接受或供給電子，或提供和接受活潑氫來決定。被吸附物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如與

14、吸附劑有相似的電子特性，吸附就更牢固。常用吸附劑的吸附力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋夯钚蕴?、氧化鋁、硅膠、氧化鎂、碳酸鈣、磷酸鈣、石膏、纖維素、淀粉和糖等。以活性炭的吸附力最強(qiáng)。吸附劑在使用前須先用加熱脫水等方法活化。大多數(shù)吸附劑遇水即鈍化，因此吸附層析大多用于能溶于有機(jī)溶劑的有機(jī)化合物的分離，較少用于無機(jī)化合物。洗脫溶劑的解析能力的強(qiáng)弱順序是：醋酸、水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、四氯化碳和己烷等。為了能得到較好的分離效果，常用兩種或數(shù)種不同強(qiáng)度的溶劑按一定比例混合，得到合適洗脫能力的溶劑系統(tǒng)，以獲得最佳分離效果。 分配層析 在支持物上形成部分互溶的兩相系統(tǒng)。一般是水相和有機(jī)溶劑相。常用支持

15、物是硅膠、纖維素和淀粉等，這些親水物質(zhì)能儲(chǔ)留相當(dāng)量的水。被分離物質(zhì)在兩相中都能溶解，但分配比率不同，展層時(shí)就會(huì)形成以不同速度向前移動(dòng)的區(qū)帶。 離子交換層析 支持物是人工交聯(lián)的帶有能解離基團(tuán)的有機(jī)高分子，如離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠等。帶陽離子基團(tuán)的，如磺酸基（SO3H）、羧甲基（CH2COOH）和磷酸基等為陽離子交換劑。帶陰離子基團(tuán)的，如DEAE（二乙基胺乙基）和QAE（四級(jí)胺乙基）等為陰離子交換劑。離子交換層析只適用于能在水中解離的化合物，包括有機(jī)物和無機(jī)物。對(duì)于蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸及核苷酸的分離分析有極好的分辨力。離子交換基團(tuán)在水溶液中解離后，能吸引水中被分離物的離子，各種

16、物質(zhì)在離子交換劑上的離子濃度與周圍溶液的離子濃度保持平衡狀態(tài)，各種離子有不同的交換常數(shù)，K值愈高，被吸附愈牢。洗脫時(shí)，增加溶液的離子強(qiáng)度，如改變pH，增加鹽濃度，離子被取代而解吸下來。洗脫過程中，按K值不同，分成不同的區(qū)帶。 凝膠過濾層析 支持物是人工合成的交聯(lián)高聚物，在水中膨脹后成為凝膠。凝膠內(nèi)為內(nèi)水層，凝膠周圍的水為外水層?？刂平宦?lián)度以形成不同孔徑的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。交聯(lián)度小的孔徑大，交聯(lián)度大的孔徑小。凝膠只允許被分離物質(zhì)中小于孔徑的分子進(jìn)入，大于孔徑的分子被排斥在外水層，最先被洗脫下來。而進(jìn)入孔徑的分子也按分子量大小大致分離成不同的區(qū)帶。選擇不同規(guī)格的凝膠，可把一個(gè)混合物按分子量的差異分成不同的

17、組分。這種方法曾被稱為分子篩。目前常用的凝膠商品有：葡聚糖凝膠（sephadex）、聚丙烯酰胺凝膠（bio-gel）、瓊脂糖凝膠（sepharose）和聚苯乙烯凝膠（styragel）等。 親和層析 在一對(duì)有專一的相互作用的物質(zhì)中，把其中之一聯(lián)結(jié)在支持物上，用于純化相對(duì)的另一物質(zhì)。常見的親和對(duì)如：酶和抑制劑，抗原和抗體，激素和受體等。支持物為瓊脂糖或纖維素等。 氣相層析 屬于分配層析或吸附層析，僅適用于分析分離揮發(fā)性和低揮發(fā)性物質(zhì)。固定相是在惰性支持物（如磨細(xì)的耐火磚）上覆蓋一層高沸點(diǎn)液體，如硅油、高沸點(diǎn)石蠟和油脂、環(huán)氧類聚合物。外涂層約為支持物重量的20。分析時(shí)操作溫度范圍，一般從室溫到20

18、0。特殊的層析柱能達(dá)到500。流動(dòng)相常用氦、氬或氮為展層氣體。氣相層析分離的區(qū)帶十分清晰，是由于揮發(fā)性物質(zhì)在兩相間能很快達(dá)到平衡，所需分析時(shí)間大為縮短，一般為數(shù)分鐘至10余分鐘。檢測(cè)記錄系統(tǒng)繪出的各峰是測(cè)定流出氣體電阻變化的結(jié)果，因而測(cè)定樣品量可到微克和毫微克水平。具有快速、靈敏和微量的優(yōu)點(diǎn)。氣相層析也能用于分離制備樣品，但需增加將流出氣體通過冷凍將分離物回收的裝置。 紙層析 以濾紙為支持物的分配層析。組成濾紙的纖維素是親水物質(zhì)，能形成水相和展層溶劑的兩相系統(tǒng)，被分離物質(zhì)在兩相中的分配保持平衡關(guān)系。紙層析用于分析簡單的混合物時(shí)可做單向?qū)游觥?duì)于復(fù)雜的混合物，可做雙向?qū)游觥?944年AJP馬丁第

19、一次用紙層析分析氨基酸，得到很好的分離效果，開創(chuàng)了近代層析的發(fā)展和應(yīng)用的新局面。70年代以后，紙層析已逐漸為其他分辨力更高、速度更快和更微量化的新方法，如離子交換層析、薄層層析、高效液相層析等所代替。 薄層層析 在玻璃片、金屬箔或塑料片上鋪上一層約12毫米的支持物，如纖維素、硅膠、離子交換劑、氧化鋁或聚酰胺等，根據(jù)需要做不同類型的層析。聚酰胺薄膜是一種特異的薄層，將尼龍溶解于濃甲酸中，涂在滌綸片基上，當(dāng)甲酸揮發(fā)后，在滌綸片基上形成一層多孔的薄膜，其分辨力超過了用尼龍粉鋪成的薄層。薄層層析較紙層析優(yōu)越在于分辨高，展層時(shí)間短。例如用紙層析做氨基酸分析，往往需要兩天時(shí)間，而且對(duì)層析條件要求嚴(yán)格，不易

20、得到滿意的分離效果。如用薄層層析做，一般約需半小時(shí)，分離效果更好。薄層層析一般用于定性分析。也能用于定量分析和制備樣品。 高效液相層析（又名高壓液相色譜） 70年代新發(fā)展的層析法。其特點(diǎn)是：用高壓輸液泵，壓強(qiáng)最高可達(dá)5000psi（相當(dāng)于34個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓）。用直徑約310微米的超細(xì)支持物裝填均勻的不銹鋼柱。常用的支持物是在玻璃小珠上涂一層12微米的二氧化硅，經(jīng)硫酰氯反應(yīng)生成SiCl，進(jìn)一步連接疏水的烷基，如SiC18H37，或陽離子交換基團(tuán)Si（CH2）nC6H4SO3H，或陰離子交換基團(tuán)Si（CH2）nNH2。這種支持物能承受很高的壓力，化學(xué)性能穩(wěn)定。用不同類型支持物的HPLC，可做吸附層析

21、、離子交換層析和凝膠過濾層析。其分析微量化可達(dá)10-10克水平。但用于制備，可以純化上克的樣品。展層時(shí)間短，一般需幾分鐘到10余分鐘。其分析速度、精確度可與氣相層析媲美。HPLC適于分析分離不揮發(fā)和極性物質(zhì)。而氣相層析只適用于揮發(fā)性物質(zhì)，兩者互為補(bǔ)充，都是目前最為理想的層析法。HPLC配有程序控制洗脫溶劑的梯度混合儀，數(shù)據(jù)處理的積分儀和記錄儀等電子系統(tǒng)，成為一種先進(jìn)的分析儀器，在生物化學(xué)、化學(xué)、醫(yī)藥學(xué)和環(huán)境科學(xué)的研究中發(fā)揮了重要作用。 反相層析 在吸附層析中，高極性物質(zhì)在層析柱上吸附較牢，洗脫時(shí)發(fā)生拖尾現(xiàn)象和保留時(shí)間長的問題。如果在支持物上涂上一層高碳原子的疏水性強(qiáng)的烷烴類，洗脫液用極性強(qiáng)的溶劑，如甲醇