1、免疫組化操作方法、原理、步驟以及常見問題處理大總結1、方法操作不難，最大的難處是出現異常結果時如何解決？這就需要掌握免疫組化實驗原理，每一步知道為什么這樣做，這樣你才敢大膽地改革先前的不對的方法步驟。如抗體孵育條件主要是抗體濃度、溫度、時間，這三者一般是相互成反比的（相對），其中濃度 是最重要的先決條件，溫度決定反應的速度、時間決定反應的量。就拿溫度來說，可以有4度、室溫、37度，我推薦4度最佳，反應最溫和，背景較淺；而37度反應速度較快，時間較短；室溫我不太提倡，除非你每次都把環境溫度控制在一定的范圍，否則，盡量選擇前兩者。2、 免疫組化最大的優勢是定位和定性。相比于其他蛋白檢測方法，免疫組

2、化具有定性靈敏度高、定位較直接準確，是定位檢測分析首選方法。尤其對于有些因子的轉位研究十分有用。3、 免疫組化結果定量分析的前提是高質量的染色切片。免疫組化結果也能定量分析，但必須是背景染色淺而特異性染色較深的情況下，分析最為準確，這種原則可能也是我們日常審稿時判定研究結果的必備條件。4、 免疫組化實驗一定要設置陽性對照和陰性對照。陽性對照一般是用肯定表達這 種抗原的切片來做；陰性對照一般是用 PBS或非一抗替代一抗來進行反應，其余步驟均一致。 前者是排除方法和實驗系統有無問題；后者是排除有無一抗外的非特異性染色。5、 免疫組化的應用廣泛，是當前實驗研究的最重要方法之一。 如今發SCI論文時，

3、 明顯感覺僅靠量化的數據來發文章很難，加一些形態學數據或圖片， 老外十分歡迎，可能是 怕你學術造假吧。當然也不能做假陽性或假陰性結果。6、免疫組化技術掌握與否的鑒定標準是同一切片或不同切片中不同抗原均從摸索濃度或條件而做出優良的染色切片。我在平時帶教中就發現許多研究生把我已經摸索很成熟的反應條件、濃度、方法步驟，重復運用于同一性質的切片和同一種抗體，做出來后就覺得自己已經掌握了免疫組化方法，更換一種抗體后，居然連二抗的種屬來源都拿錯了。失敗往往促進你去思考試驗原理和過程，成功有時也加快你自傲。7、 實驗方法需要動手+動腦。如今我還不敢說我在免疫組化什么都知道。我只所以今天敢在這里說這說那，這是

4、因為我經過了反復的動手+動腦，把理論原理運用于實踐，在把實踐中發現的問題帶到理論知識中去解決，最終把理論與實踐融會貫通。一、概念和常用方法介紹1、定義用標記的特異性抗體對組織切片或細胞標本中某些化學成分的分布和含量 進行組織和細胞原位定性、定位或定量研究，這種技術稱為免疫組織化學（immun ohistochemistry ）技術或免疫纟田胞化學（ immuno cytochemistry ）技術。2、原理 根據抗原抗體反應和化學顯色原理，組織切片或細胞標本中的抗原先和一抗結合，再利用一抗與標記生物素、熒光素等的二抗進行反應，前者再用標記辣根過氧化物 酶（HRP或堿性磷酸酶（AKP等的抗生物素

5、（如鏈霉親和素等）結合，最后通過呈色反應 或熒光來顯示細胞或組織中化學成分，在光學顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細胞內發生的抗原抗體反應產物，從而能夠在細胞爬片或組織切片上原位確定某些化學成分的分布和含 量。3、 分類1 ）按標記物質的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、免疫酶 標法和免疫金銀法等。2）按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。3 ）按結合方式可分為抗原-抗體結合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP法；親和連接，如卵白素-生物素-

6、過氧化物 酶復合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法等，其中SP法是比較常用的方法；聚合物鏈接，如即用型二步法，此方法尤其適合于內源性生物素含量高的組織 抗原檢測。4、 目前幾種常用免疫組化方法簡單介紹1 ）免疫熒光方法是最早建立的免疫組織化學技術。它利用抗原抗體特異性結合的原理，先將已知抗體標上熒光素，以此作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原，在熒光顯微鏡下觀察。 當抗原抗體復合物中的熒光素受激發光的照射后即會發出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進而還可進行定量分析。由于免疫熒光技術特異性強、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗 中應用較廣。2）

7、 免疫酶標方法免疫酶標方法是繼免疫熒光后，于60年代發展起來的技術。基本原理是先以酶標記的抗體與組織或細胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞表面和細胞內的各種抗原成分進行定位研究。免疫酶標技術是目前最常用的技術。本方法與免疫熒光技術相比的主要優點是：定位準確，對比度好，染色標本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。免疫酶標方法的發展非常迅速，已經衍生出了多種標記方法， 且隨著方法的不斷改進和創新， 其特異性和靈敏度都在不斷提高， 使用也越來越方便。目前在病理診斷中廣為使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法檢測系統等。3）免疫膠體金技術免

8、疫膠體金技術是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標記物。膠體 金是指金的水溶膠，它能迅速而穩定地吸附蛋白，對蛋白的生物學活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標記一抗、二抗或其他能特異性結合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作為探針，就能對組織或細胞內的抗原進行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不 同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高， 所以免疫膠體金技術特別適合于免疫電鏡的單標記 或多標記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進行光鏡觀察。如應用銀加強的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。5、 被檢測的物質組織或細胞中凡是能作為抗原或半抗原，如蛋白質、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶

9、、激素、核酸及病原體等都可用相應的特異性抗體進行檢測。6、 特點1 ）特異性強。免疫學的基本原理決定抗原與抗體之間的結合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細胞中抗原的特定顯示，如角蛋白（keratin ）顯示上皮成分，LCA顯示淋巴細胞成分。只有當組織細胞中存在交叉抗原時，才會出現交叉反應。2）敏感性高。在應用免疫組化的起始階段，由于技術上的限制，只有直接法、間接 法等敏感性不高的技術，那時的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；現在由于ABC法或SP三步法的出現，使抗體稀釋上千倍、 上萬倍甚至上億倍仍可在組織細胞中與抗原結合，這樣高敏感性的抗體抗原反應， 使免疫組化方法越來越方便地應用于常

10、規病理診斷工作。3）定位準確、形態與功能相結合。該技術通過抗原抗體反應及呈色反應，可在組織和細胞中進行抗原的準確定位，因而可同時對不同抗原在同一組織或細胞中進行定位觀察，這樣就可以進行形態與功能相結合的研究，對病理學領域開展深入研究是十分有意義的。7、從蛋白水平檢測角度 ，免疫組化技術與 Western blotting 、ELISA的異同1） Western blott ing :蛋白質免疫印跡，也是利用抗體抗原反應原理，結合化學發光等技術來檢查組織或細胞樣品內蛋白含量的檢測方法。與免疫組化技術相比， 定量可能更加準確；當然Western blotting也可定性和定位（通過提取膜蛋白或核蛋

11、白、胞漿蛋白分別檢測其中抗原含量，進而間接反映它們的定位），但敏感性遠遠低于免疫組化技術。2）ELISA:酶聯免疫吸附試驗，也是利用抗體-抗原-抗原結合反應原理來檢查體液或組織勻漿中蛋白含量的 檢測。與免疫組化技術相比，定量最準確，是分泌性蛋白檢測首選方法之一。二、實驗流程簡介1、 SP三步法1）石蠟切片，常規脫蠟至水。2） 0.3%或 3%H2O去離子水（無色液體）孵育10-30分鐘，以滅活內源性過氧化物酶活性。3）蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘4）候選步驟：采用抗原修復：微波（建 議30分鐘內4次中火）、高壓、酶修復方法。自然冷卻，再用3分鐘X 3次.5）血清封閉：室溫15-30分鐘，盡可能

12、與二抗來源一致。 傾去，勿洗。6 ）滴加適當比例稀釋的一抗，37 C 孵育23小時或4C過夜（最好復溫）。PBS沖洗，3分鐘X 5次。7）滴加生物素標記的二抗，室溫或37C孵育30分鐘-1h。 8） PBS沖洗，3分鐘X 5次。9）滴加SP （鏈霉親和素- 過氧化物酶），室溫或 37 C孵育30分鐘-1h。 10） PBS沖洗，3分鐘X 5次。11）顯色劑顯 色（DAB等）。12）自來水充分沖洗。13）可進行復染，脫水，透明。14）選擇適當的封片劑封片。2、 即用型二步法1 ）脫蠟、水化組織切片。2）根據所應用的一抗的特殊要求，對組織切片進行預處理。3） 0.3%或 3%H2O去離子水孵育5分

13、鐘-30分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶，PBS或TBS沖洗。4）滴加一抗，室溫或 37C孵育3060分鐘，或4C過夜，PBS 或TBS浸洗3分鐘X 5次。5）滴加enhangcer增強劑，37度30min, PBS或TBS浸洗3分鐘 X 5次。6）滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體，室溫/37 C孵育30分鐘-1h , PBS/TBS 沖洗，3分鐘X 5次。7）應用DAB溶液顯色。8）蒸餾水沖洗、復染、脫水、透明、封片。三、免疫熒光技術1、免疫熒光方法中的重要環節 1 ）冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織 細胞內部結構破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防

14、止裂 片和脫片嚴重。2 ）組織切片固定： 切好片風干后立即用冰西奈山環保組織固定液固定 5-10min ,尤其要較長時間保存的白片，一定要及時固定和適當保存。3）血清封閉：為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致） 封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調整的，一般10-30min。4） 一抗孵育條件：在免疫組化反應中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后37度復溫45min。具體條件還要摸索。5） 二抗孵育條件：二抗一般室溫或

15、37度30min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記 要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗濃度和孵育時間先定下，然后去摸索一抗濃度和孵育時間。最后，熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長，可能后有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時小包裝和并進行適當的離心。6）復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位。一般常用DAPI復染。7） 封片：為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液， 然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直

16、至接觸到液體時為止；當發現液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產生氣泡。8）切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當地加強清洗（延長時間和增多次數）尤為重要，我一般在一抗 孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。注意（1 ）單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；（3）沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。（4） PBS的PH和離子強度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓，當時我買的抗體稀釋液偏酸，結果背景一片黃（未見特異性染色），建議 PH在7.4-7.6濃度是0.01M。

17、（中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復合物的形成，而 酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解）9）拍照：有條件的話最好立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持 避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序；應在暗室中進行檢查；防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡；檢查時間每次以12h為宜，超過90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本 受紫外線照射35min后，熒光也明顯減弱或褪色；激發光長時間的照射，會發生熒光的衰 減和淬滅現象；所以最多不得超過23h;熒光顯

18、微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈 熄滅后欲再啟用時，須待燈光充分冷卻后才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。關閉汞燈至少在開啟15-30分鐘后；標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4C保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發；使用的玻片等載體， 都必須厚度均勻，無明顯的自發熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源最好裝穩壓器，否則電壓不穩不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。已有的常見免疫組化難題集錦1、 石蠟切片和冰凍切片的比較？（ 1）要求做冰凍切片的不一定

19、能做石蠟切片，這是今天我向一老師請教得出的結論。因為作石蠟切片時要高溫烤片，可能會破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。（2）冰凍切片的優點是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時不需抗原修復這一步。缺點是細胞內易形成冰晶而破壞細胞結構，可能會使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。當你買一抗時，目錄上都寫著做什么樣的切片，如果它寫著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫著兩者都可，那就都能做。（3）石蠟切片的優點可以保持組織細胞的形態結構，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80度的低溫冰箱中，尤其是用來做原

20、位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保存一貫很重要。由于石蠟切片可以切到4微米左右，所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色/形態都較冰凍切片好。2、 一抗的選擇要點和技巧是什么？（ 1）單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標明確地與單一的特異抗原決定簇結合，就像導彈精確地命中目標一樣。另一方面，即使是同一個抗原決定簇，在機體內也可以由好幾種克隆來產生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。 在抗原抗體反應中，一般單克隆抗體特異性強，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強，靈敏

21、度高，但易出現非特異性染色（可以通過封閉等避免）。（2）應用范圍的選擇。有的一抗只能用于Western blotting ，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至表明石蠟切片或冰凍切片。（3）種屬反應性的選擇（speciesreactivity ）。這一點很重要，表明這種抗體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測哪種種屬動物體內的抗原。（4）種屬來源，一般兔來源的多是多克隆；而小鼠來源的多是單克隆， 但也有另外。根據此來源來選擇相應的二抗。（5）生產廠家的選擇。如 santa Cruz公司抗體一般1ml,價格2100元左右；而chemicon公司一抗一般100ul，價格2800元左右。這兩個 廠

22、家的同一種抗體它的實際效價穩定是不同的，我一般用后者抗體做免疫組化效果較好，而前者做Western blotting效果還可以。3、 在什么情況下使用 TritonX-100 ?（1） Triton X-100化學名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學（10um厚切片）和免疫細胞化學中一般用Triton X-100作為細胞通透劑，在膜上打孔。（2）其作用原理：Triton X-100 可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質而使抗體及大分子結構的物質進入胞漿和胞核內，故在細胞免疫組化時尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進入胞內與相應抗原結合。（3）Trit onX-100既是一種

23、表面活性劑，也有抗氧化作用，具體參閱： 4、 封閉血清的選擇原則是什么？（ 1）膜上或切片上有剩余的位點可以非特異性吸附抗體，造成后續結果的假陽性！（ 2）封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點發生結合，否則在后面的步驟中如果和二抗發生結合，會造成背景。（3）也可以用小牛血清、BSA羊血清等，但不能與一抗來源一致。5、 抗體孵育條件的比較？（ 1 ）一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后37度復溫45min。（ 2）二抗一般室溫或 37度30min-1

24、h，具體時間需要摸索。6、 一抗4度孵育后為什么要進行 37度復溫？（ 1） 一方面，防止切片從 4度直接放入PBS易脫片；（2 ）另一方面，使抗原抗體結合更穩定。一般不需要，但對表達較弱的抗原可能有用,4度和37度時分子運動方式不同，前者分子碰撞機率和運動速度小于后者，后者結合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色。（3）其實，我更贊同后一種說法，因為我嘗試把肝臟或睪丸片子從4度過夜拿出后，直接用PBS洗沒發生過脫片現象。事實勝于雄辯！7、 DAB顯色時間如何把握？（ 1） DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現淺棕色本底時即可沖洗；（2） DAB顯色時間很短（如幾秒

25、或幾十秒）就出現很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；（3）此外，若很短時間就出現背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；（4） DAB顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短（最好一抗4度過夜）；另一方面就是封閉時間過長。8、 免疫組化結果如何分析？（ 1）陽性著色細胞計數法。在 40*光鏡下，隨機選擇不重疊的10個視野，人工或機器計數陽性著色細胞，每組36張不同動物組織切片，然后進行組間比較即可。（2）灰密度分析法。通過在不同組別和不同動物組織切片上選

26、擇相 同區域、相同條件下用image j進行灰密度分析，然后進行統計分析即可。（3）評分法。通過在光學顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（03分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽性范圍進行評分（14分為025% 2650% 5175% 76100%），最終可以分數 相加，再進行比較。對于以上這幾種方法，各有利弊，請細心選擇。要想得到正確結果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質量切片。9、 在什么情況下進行組織抗原修復，抗原修復的條件是什么？（ 1）由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發生了蛋白之間交聯及醛基的封閉作用，從而失去抗原性。通過抗原修復，使得細胞內抗原決定族重新暴露

27、，提高抗原檢測率。（2）修復方法從強到弱一般分為三種，高壓修復、微波修復、胰酶修復。修復液也分為若干種（具體的可以查閱相關資料，大量的：中性的、高pH的等）。（3）微波修復，我們一般用 6min*4次，效果不錯。10、 內源性過氧化物酶的滅活時間和濃度是什么？（ 1） 一般3%±氧化氫滅活時間短點，可以10min左右；而0.3%過氧化氫則可以適當延長封閉時間，一般1030min。（ 2）用西奈山環保組織固定液配置過氧化氫比雙蒸水或PBS能更好保護抗原和固定組織作用，過氧化氫孵育時間過長易引起脫片。（3）現用現配，配好后 4度避光保存。11、 如何才能充分脫蠟？（ 1）蠟不溶于水，如果

28、脫蠟不干凈，少許蠟存留于切 片上，將會引起染色不均勻、陽性物時隱時現、真假難辨、背景染色增加等。為了解決上述 的問題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強，脫蠟時間較短；（2）脫蠟的時間要根據季節，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時間不需很多，3-5分鐘就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時間需要延長，10-20分鐘或更長。（3）當天切的切片，燒烤2小時后進行染色，切片帶有溫度進行脫蠟這將可加速脫蠟的過程，如果預先切好烤好的切片，在染色前，還必須對切片進行加溫10-20分鐘，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速

29、度加快，效果魁偉更好。總之，操作時應根據不同的季節，不同的室溫，不同的試劑來決定，脫蠟的時間，原則上是要徹底、干凈、完全地脫去切片上的蠟。12、 如何最大限度地降低組織非特異性染色？（ 1）縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條。（2） 一抗用多克隆抗體易出現非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。（3）內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；（4）非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來 加強封閉效果；（5）縮短DAB孵育時間或降低 DAB濃度/過氧

30、化氫濃度等；（6）適當增加PBS沖洗次數和浸洗時間，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要；（7）防止標本染色過程中出現干片，這容易增強非特異性著色。13、 蘇木素復染時間的把握？（ 1）蘇木素復染時間要看當時的室溫、溶液的新舊、目標抗原的定位等情況，一般數秒-數分鐘。不過這個如果染色不理想可以補救的。即:染色深則分化時間稍長些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。（2）鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復染完后流水振洗， 然后置于鹽酸酒精中數秒 （一定動作要快） 后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。（3）如果分化的顏色過淺，可以復置于蘇木素中染色。14、 PBS的清洗方式選擇、次

31、數和時間的選擇？（ 1 ）單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。臨床上每天檢測的病例很多，所用的抗體種類及項目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們在一個缸內洗，這樣就會造成交叉污染， 影響最后的結果。正確的做法是單獨地進行沖洗，沖洗的 PBS為一次性，保證切片沒有相互交叉污染的機會。（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。沖洗切片，取出切片，將PBS從上輕輕地沖洗，讓 PBS自上而下流下來，不要拿起切片將PBS對準切片沖洗，這樣由于沖出的 PBS有一定的沖擊力，很容易使切片周 邊引起松動，導致切片的脫落。（3）沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結合的各種物， 使

32、之不產生背景，此種做法一是浪費時間，二是很容易導致切片的脫落。切片的沖洗據實踐認為，用一小燒杯柔和地于切片上沖 洗，就能徹底沖洗去未結合的物質，無需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入PBS持續2分鐘左右就完全足夠了。（ 4） PBS的PH和離子強度的使用和要求。劉彥仿指出：中性及 弱鹼性條件（PH7- 8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解。免疫組化PBS我們目前常用的 PBS的PH在7.4-7.6濃度是0.01M，根據本室十幾年來的使用情況，認為該溶液價格便宜配制方面，使用效果好。（5）常用試劑的配制和使用。在免疫組織化

33、學的染色過程中，用得最 多的試劑就是緩沖液，因為切片在整個染色中，抗體的加、換、切片的沖洗，DAB的配制都離不開緩沖液。可見緩沖液在整個染色中都起至關鍵的作用，緩沖液的過酸或偏堿，都將影響染色的結果。15、 脫片產生的原因和如何防止脫片？（ 1）多聚賴氨酸玻片質量的問題。我原 先是買的，邁新按說也是不錯的， 可是都脫成什么樣子了。 后面補做第二批時用的病理科老 師自己做的片子，要好一點。（2）組織切的不好，切片機的問題例如比較老的舊的機器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。（3）組織的問題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類越容易脫。（4）沒烤好，時間短溫度不夠之類。（5）操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛生紙從邊