1、 高效液相色譜（高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）是）是20世紀(jì)世紀(jì)60年代末年代末發(fā)展起來的一種新型微量分離分析技術(shù)。發(fā)展起來的一種新型微量分離分析技術(shù)。 高效液相色譜法是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上，高效液相色譜法是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏檢測器，因而具備速泵、高效固定相和高靈敏檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。第一節(jié)第一節(jié) 概述概述主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)

2、備和檢測手段主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測手段1 1經(jīng)典經(jīng)典LCLC：僅做為一種分離手段：僅做為一種分離手段 常壓輸送流動相，分析周期長常壓輸送流動相，分析周期長 柱內(nèi)徑柱內(nèi)徑13cm13cm，固定相粒徑，固定相粒徑100m 100m 且不均勻且不均勻 柱效低（柱效低（HH，nn） 無法在線檢測無法在線檢測2HPLC：分離和分析：分離和分析 高壓（高壓（1.47-2.941014 Pa）輸送流動相，分析）輸送流動相，分析時間大大縮短時間大大縮短 柱內(nèi)徑柱內(nèi)徑28mm，固定相粒徑，固定相粒徑20 m，多采用干法填充；，多采用干法填充； 填料顆粒填料顆粒 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙

3、醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二二氧六環(huán)氧六環(huán) 四氫呋喃四氫呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 異丙醚異丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化二硫化碳碳環(huán)己烷環(huán)己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)4. 4. 選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題（1）盡量使用）盡量使用高純度試劑高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相）避免流動相與固定相發(fā)生作用發(fā)生作用而使柱效下降或損壞而使柱效下降或損壞柱子，如使固定液溶解流失；

4、酸性溶劑破壞氧化鋁固定柱子，如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。相等。（3）試樣在流動相中應(yīng)有）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。淀并在柱中沉積。（4）使用二元體系流動相時，應(yīng)該注意）使用二元體系流動相時，應(yīng)該注意兩種溶劑能否兩種溶劑能否互溶互溶。（5）流動相同時還應(yīng)滿足）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求檢測器的要求。當(dāng)使用紫外。當(dāng)使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。溶劑溶劑紫外截止波長紫外截止波長/nm正己烷正己烷190二硫化碳二硫化碳380四氯化碳四氯化碳265苯苯210氯仿氯仿245二氯甲烷二氯

5、甲烷233四氫呋喃四氫呋喃212丙酮丙酮330乙腈乙腈190甲醇甲醇205水水187流動相在使用前應(yīng)該過濾、脫氣！流動相在使用前應(yīng)該過濾、脫氣！除了在分析前利用真空或超聲波脫氣之外，除了在分析前利用真空或超聲波脫氣之外，可以使用在線脫氣。可以使用在線脫氣。三、進樣三、進樣定量環(huán)規(guī)格：定量環(huán)規(guī)格：2ul、5ul、10ul、20ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul、2000ul、5000ul。蛋白的上樣量取決于檢測器的靈敏度蛋白的上樣量取決于檢測器的靈敏度Effect of Sample Load on Protein Peak Shape and Resolution

6、手柄位進樣手柄位進樣( (LoadLoad) )位置時，樣品經(jīng)微量進樣針從進樣孔注位置時，樣品經(jīng)微量進樣針從進樣孔注射進定量環(huán)，定量環(huán)充滿后，多余樣品從放空孔排出；射進定量環(huán)，定量環(huán)充滿后，多余樣品從放空孔排出；將手柄轉(zhuǎn)動至進樣將手柄轉(zhuǎn)動至進樣( (InjectInject) )位置時，閥與液相流路接通，位置時，閥與液相流路接通，由泵輸送的流動相沖洗定量環(huán)，推動樣品進入液相分析柱由泵輸送的流動相沖洗定量環(huán)，推動樣品進入液相分析柱進行分析。進行分析。Load Inject手柄處于手柄處于LoadLoad和和InjectInject之間時，由于暫時堵住了流路，之間時，由于暫時堵住了流路，流路中流路

7、中壓力驟增壓力驟增，再轉(zhuǎn)到進樣位，過高的壓力在柱頭上，再轉(zhuǎn)到進樣位，過高的壓力在柱頭上引起損壞，所以應(yīng)盡快轉(zhuǎn)動閥，引起損壞，所以應(yīng)盡快轉(zhuǎn)動閥，不能停留在中途不能停留在中途。在液相色譜系統(tǒng)開始工作前，可以用注射器連接恒流泵在液相色譜系統(tǒng)開始工作前，可以用注射器連接恒流泵的排空閥，抽出流動相，將流路中的空氣驅(qū)趕干凈。的排空閥，抽出流動相，將流路中的空氣驅(qū)趕干凈。在注入樣品前注意排出樣品注射器中的空氣。在注入樣品前注意排出樣品注射器中的空氣。 避免氣泡的產(chǎn)生避免氣泡的產(chǎn)生：HPLC有等度洗脫有等度洗脫(isocratic elution)和梯度洗脫和梯度洗脫(gradient elution)兩種方

8、式。兩種方式。等度洗脫等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動相是在同一分析周期內(nèi)流動相組成保持恒定組成保持恒定，適合，適合于組分?jǐn)?shù)目較少，性質(zhì)差別不大的樣品。于組分?jǐn)?shù)目較少，性質(zhì)差別不大的樣品。四、洗脫四、洗脫等度洗脫缺點等度洗脫缺點梯度洗脫梯度洗脫是在一個分析周期內(nèi)程序控制流動相的組成，如是在一個分析周期內(nèi)程序控制流動相的組成，如溶劑的極性、離子強度和溶劑的極性、離子強度和pH值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時間，提高分離度，改善峰形，采用梯度洗脫可以縮短分析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常

9、常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫洗脫曲線曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性線性梯度最常用，尤其適合于在反相柱上進行梯度洗脫。梯度最常用，尤其適合于在反相柱上進行梯度洗脫。在進行梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變在進行梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視：化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視：要注意溶劑的要注意溶劑的互溶性互溶性，不相

10、混溶的溶劑不能用作梯度洗，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。脫的流動相。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，使用有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，使用時更要引起注意。時更要引起注意。當(dāng)有機溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其當(dāng)有機溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。使用磷酸鹽時需特別小心。梯度洗脫所用的溶劑梯度洗脫所用的溶劑純度純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。性。進行樣品分析前必須進行進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因為弱溶劑中的雜質(zhì)富集在色譜柱頭后

11、會被強溶劑洗峰，因為弱溶劑中的雜質(zhì)富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣徹底脫氣，以防止混合時產(chǎn)生氣泡。，以防止混合時產(chǎn)生氣泡。混合溶劑的混合溶劑的粘度粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時常常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現(xiàn)出現(xiàn)壓力的變化壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當(dāng)二者以相近比例混合時粘度例如甲醇和水粘度都較小，當(dāng)二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。增大很多，此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸

12、液泵或色譜柱能承受的最大壓力。能承受的最大壓力。流速流速選擇合適的流速對于維持一定柱壓，保證層析峰的峰形以選擇合適的流速對于維持一定柱壓，保證層析峰的峰形以及洗脫時間都有一定影響，流速控制可參考下表及洗脫時間都有一定影響，流速控制可參考下表 210004.6d =對于內(nèi)徑不同的層對于內(nèi)徑不同的層析柱，其合適的流析柱，其合適的流速計算公式速計算公式在對未知樣進行洗脫時，可以選擇如下方式以了解樣品的在對未知樣進行洗脫時，可以選擇如下方式以了解樣品的疏水性：疏水性：在在0B的流動相中，疏水性強的的流動相中，疏水性強的C18烷基鏈容易貼在固定烷基鏈容易貼在固定相載體顆粒的表面，從而降低與樣品的結(jié)合。相

13、載體顆粒的表面，從而降低與樣品的結(jié)合。因此一般開始時選用因此一般開始時選用2-5B的流動相洗脫。的流動相洗脫。洗脫條件的優(yōu)化洗脫條件的優(yōu)化洗脫梯度洗脫梯度洗脫時間洗脫時間柱平衡柱平衡洗脫時間依照柱長、流動相性質(zhì)的不同而變化。洗脫時間依照柱長、流動相性質(zhì)的不同而變化。每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其恢復(fù)恢復(fù)到初始狀態(tài)到初始狀態(tài)。需讓。需讓1030倍柱容積的初始流動相流經(jīng)色譜倍柱容積的初始流動相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動相達(dá)到完全平衡。柱，使固定相與初始流動相達(dá)到完全平衡。1、使用前仔細(xì)閱讀色譜柱附帶的說明書，注意適用范圍，使用前仔細(xì)

14、閱讀色譜柱附帶的說明書，注意適用范圍，如如pHpH值范圍、流動相類型等。值范圍、流動相類型等。2、選擇使用適宜的、選擇使用適宜的流動相流動相（尤其是（尤其是pH），以避免固定相），以避免固定相被破壞。被破壞。3、應(yīng)、應(yīng)逐漸改變逐漸改變?nèi)軇┑慕M成溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬粗嗳弧＝訌挠袡C溶劑改變?yōu)槿渴撬粗嗳弧?、當(dāng)采用、當(dāng)采用鹽緩沖溶液鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應(yīng)用無鹽流作流動相時，使用完后應(yīng)用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能動相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與

15、之接觸。會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。5、避免將、避免將基質(zhì)復(fù)雜基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對樣品進行需要對樣品進行預(yù)處理預(yù)處理或者在進樣器和色譜柱之間連接或者在進樣器和色譜柱之間連接一一保護柱保護柱。6、一般說來色譜柱、一般說來色譜柱不能反沖不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。速降低柱效。7、保存色譜柱保存色譜柱時應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，時應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干

16、燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時間。過夜或更長時間。8、色譜柱使用過程中，避免柱壓過高。如果、色譜柱使用過程中，避免柱壓過高。如果壓力升高壓力升高，一，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕龇N可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M行清洗；另一種可能是大分子進入柱內(nèi)，使柱頭被污進行清洗；另一種可能是大分子進入柱內(nèi)，使柱頭被污染。染。 9、不要在高溫下長時間使用硅膠鍵合相色譜柱；不要在高溫下長時間使用硅膠鍵合相色譜柱； 使用過程中注意輕拿輕放。使用過程中注意輕拿輕放。典型窗口元素（運行樣品）典型窗口元素（運行樣品）第六節(jié)第六節(jié) 高效液相色譜的應(yīng)用高效液相色譜的應(yīng)用環(huán)境保護環(huán)境保護農(nóng)業(yè)農(nóng)業(yè)醫(yī)藥醫(yī)藥生化研究生化研究食品質(zhì)量食品質(zhì)量http:/www.forumsci.co.il/HPLC/topics.htmlTopics in Liquid Chromatographyhttp:/ of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications思考題思考題1、高效液相色譜與常規(guī)液相色譜相比為什么有很高的分、高效液相色譜與常規(guī)液相色譜相比為什么