1、精品文檔第三章基因的轉移和重組自然界的基因轉移和重組是基因變異和物種進化的基礎，也在繁殖、病毒感染、基因表達以及癌基因激活等過程中起重要的作用。人們正是對自然界基因轉移和重組的認識，才發 展起DNA重組技術。第一節基因的轉移一、細菌的接合（一）概念：細菌細胞通過相互接觸使遺傳信息從供體細胞單向轉移到受體細胞的過程。在發現接合以前，人們就對細菌的雜交進行探索，但存在兩大難題不易解決。1 . a+b xab+雜交后得到的重組子頻率很低，和基因回復突變的頻率相接近。難以確定a + b+是由于a+b或a-b +親本回復突變而產生，還是真正的重組產物。2 .現已知道細菌重組頻率低于 10-6 ,觀察百萬

2、個菌落以上才可能出現一個重組菌落, 對于當時用形態特征作為研究對象來說，工作量太大。（二）實驗證據1、1946年，萊德伯格（Lederberg ）和塔特姆（Tatum ）的多重營養缺陷型菌雜交實驗。met', bib,而七記戲伴江林2、1950年，戴維(Davis,B.D.)U 型管實驗(三)遺傳物質的單向轉移1953年，海斯(Hayes , W)在重復萊德伯格和塔特姆的雜交實驗之前，先用高劑量的鏈霉素處理 A菌株，結果A菌株受處理后雜交結果不受影響，而B菌株受處理后卻完全阻止了重組的發生。這意味兩個菌株在雜交過程中的作用是不同的，可能不是交互的過程。因為鏈霉素可以阻止細胞分裂，繼而殺

3、死細胞，但它還可以讓雜交持續一個短時間，A菌株在雜交后被殺死，但并不影響雜交結果，表明它是一種供體， 像雄性動物一樣，交配后被殺死不影響后代。而 B菌株像是一種受體，和雌性動物一樣，受孕后被殺死的話，就不會產生后代。海斯的結論認為細菌在接合過程中，兩個親本在雜交中所起作用不同，有供體和受體之分，相當于“雄性“和“雌性”(四)F因子的發現海斯將放入冰箱一年之久的一個菌種A (strs )和B ( strs )進行雜交，A菌株是推測的雄性，B菌株是推測的雌性，結果和預期不同，不能產生重組子。他將A菌種進行誘變，使其由 strs變成strr,以便試著和另一品系 A ( strs )雜交，結果是可育的

4、，說明原來的雄性A菌株放在冰箱內一年變成了雌性，即從供體變成了受體。以上實驗完成不久，萊德博格和她的妻子也發現了這一現象。他們對此的一致解釋是，所謂的供體或雄性是細菌的細胞內有一種致育因子(fertilityfactor , F), F +表示，而雌性品系缺乏這種F因子，以F表示。原先的F +品系(A)放置冰箱一年后丟失的 F因子，變成了 F-,作為F白A A品系不能 和另一 F 的B品系雜交，所以不育。丟失 F因子的A菌株經誘變后其基因型由 strs變為 strr，但仍為F,作為F 的A菌株可與另一品系的 F+的A ( strs)雜交，經strr選擇 培養基篩選出的重組子仍是 F+ (str

5、r),獲得的重組子和 F 的(strs )雜交仍然可育，這 樣便發現了 F因子。F因子存在的細菌為 F+, F因子喪失的細菌為 F-, F +細胞分裂后仍為 F+,在這一點 上F +類似于染色體基因。但F并不是染色體基因，因為染色體基因不那么容易消失，且染色體基因的轉移頻率不超過10 6,而F因子的轉移頻率很高。所以 F因子是染色體外的遺傳結構，即質粒。產氣3亡產)|丟失NF(£rs) X F(str)1 I誘變I不育I I f (3爐)| X |百亡產)|I Str工一 (兇立產)X可育(五)F因子的特性高頻重組菌(high frequency recombination , Hf

6、r)：從F+菌株中可以得到重組頻率高于F+菌株1000倍的菌株，是由F因子通過同源重組整合到宿主染色體上形成的。隨意編輯F- F. coti (fernale)Bacterial ronnosomesF+ £, coli f、(male)二:二；F (iertElity) J factorConju-J) gation J l tube .Conjugating celh； copy of F factor transferred to F-ce(lf * cell becomes P it obtains a copy of F factor; both cells W(ithE&

7、#167;i n a complementary ONA strandF* males, eparaie1 .F +和F 能雜交，Hfr和F一菌株能接合，F 和F 不能接合。2 .F +和Hfr細胞表面有性菌毛，F-細胞表面沒有性菌毛，性菌毛與細菌接合有關。3 .Hfr菌與F 菌接合后F 很少變為F+ , F+與F接合后，F 常變為F+。4.Hfr細菌經口丫咤橙處理后，性質不變，F +經口丫咤橙處理后變為 F-o（六）F因子的遺傳結構F因子是一種質粒，為環狀閉合雙漣 DNA ,長度為94.5kb ,是大腸桿菌基因組的 2%,其中1/3的基因與接合有關。F質粒可在細胞內游離，也可以整合到宿主染色

8、體內。整個基因組包括：轉移區、復制區、插入區Figure 9JS Cknvtic map nf the F (fi'rtifciEy) phsmid of Ek九丁!、Hi, Tht- numbi rs i)n the inicrior show thr si/r ef the plasmid in kilobase pairs. The locations(4 k£y F 中”小 arcfr優 113 nMhi rations；。門T, *>ngin uf transfer:rtriS, origin nf rupJicdtinn: iiicr iricompitab

9、ility 右門up;jE rfplkalion funtlicns. Thesliown m yellow on 卜 aretrjiHpuybk? elements where intcratioTi ink> idmlical elements on the bMteviftl ehrtraMwome can occur and iesd to 收 tornuibon of ditterent Hfr itrauib (see Sfctinn 也力，轉移區? 由23個基因組成，構成tra操 縱子。? 這些基因分別與性菌毛的形 成，轉移因子的轉移，雜交對 的配對，轉移的起始有關。? 轉

10、移的起始區為oriT ,供體F 質粒的轉移從oriT開始。復制區? 復制區負責質粒的自我復制。? F質粒的自主復制區中包含復 制的起點。? F質粒的復制是按0型方式雙 向復制。插入區? F質粒的插入區包含 4個插入 順序：2個IS3, 1個IS2和1 個Tn1000。通過和宿主染色體 上的IS同源重組或通過轉座， F因子可以整合到宿主染色體 不同位點上。? 與質粒的整合、切除、分離有 關。、細菌的轉化（一）概念：細菌攝取外源 DNA片段產生新的遺傳性狀的過程。（二）轉化發生條件? 建立了感受態的受體細胞? 外源DNA游離分子感受態：把細菌能從周圍環境中吸收DNA的生理狀態稱為感受態。自然感受態

11、：是細胞一定生長階段的生理特性，受細菌自身的基因控制。人工感受態：通過人為誘導的方法使細胞具有攝取DNA的能力，或人為地將 DNA導入細胞內。（三）自然轉化精品文檔1、概念：將不經過特殊處理的細菌細胞從其環境中吸收DNA的過程稱為自然轉化。2、過程：感受態的出現細菌細胞在特定時期產生一種感受態因子，該因子與細胞膜上受體結合，引起某些感受態特異蛋白質表達，其中一種是自溶素，它可以使細胞表面的DNA結合蛋白及核酸酶裸露出來，使其具有和 DNA結合的活性。因此可以說細菌表面出現許多DNA結合位點就意味著細菌出現了感受態。 結合位點只能與雙鏈接合， 完整的DNA雙鏈結構對轉化是重要的。 DNA的結合和

12、進入一般認為，革蘭陽性菌和革蘭陰性菌在轉化過程中DNA結合和進入細胞的方式有些差異。a革蘭陽性菌DNA的結合和進入肺炎鏈球菌為例：細胞生長后期，細胞密度升高時，細胞分泌感受態因子，誘導感受態出現。雙鏈DNA結合到細胞表面特異受體上，核酸內切酶將吸附的DNA隨機切成一些大片斷。核酸外切酶將雙鏈中一個單鏈分解掉，另一個單鏈進入細胞。b革蘭陰性菌 DNA的結合和進入流感嗜血菌為例：首先在感受態細胞的形成過程中，流感嗜血菌會形成一種能結合雙鏈DNA的膜結構，叫做轉化小體，該結構將雙鏈DNA吸收后，能使DNA免受外源DNA酶的降解。轉化小體位于細胞膜表面，與細胞的內鏈被降解為單鏈，單鏈進入細胞。DNA的

13、整合單鏈DNAS入細胞后，不經復 制便以單鏈的形式與受體 DNA勺同 源部分配對（可以設想受體 DNA由 于處于復制、轉錄或其他原因而呈 單鏈）。供體DNA和受體DNA形成 共價鍵，被交換下來的一小段受體 單鏈DNAt核酸酶所分解。精品文檔總結：轉化因子與染色體的整合取決于幾個因素1 . 受體細胞的感受態。2 .受體與供體DNA 的同源性。3 .受體細胞的限制系統，可決定轉化因子在整合前是否被分解。4 . 線狀供體的DNA 比環狀質粒的DNA 整合效率更高一些。（四）人工轉化：1 、 Ca2 誘導轉化：1 ）將處于對數生長期的細菌置入0的 CaCl2 低滲溶液中，使細胞膨脹，同時Ca2 使細胞

14、膜磷脂層形成液晶結構，使得位于外膜與內膜間隙中的部分核酸酶離開所在區域，這就構成了大腸桿菌人工誘導的感受態；2 ） 此時加入DNA ， Ca 2 又與 DNA 結合形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基-磷酸鈣復合物，并粘附在細菌細胞膜的外表面上；3）經短暫的42 熱脈沖處理后，細菌細胞膜出現許多間隙，致使通透性增加，DNA分子便趁機進入細胞內。本方法的關鍵是選用的細菌必須處于對數生長期，實驗操作必須在低溫下進行。2 、 PEG 誘導轉化：在高滲培養基中生長至對數生長期的細菌，用含有適量溶菌酶的等滲緩沖液處理，剝除其細胞壁，形成原生質體，它喪失了一部分定位在膜上的DNase ，有利于雙鏈環狀DNA分子的吸

15、收。此時，再加入含有待轉化的DNA 樣品和 PEG 的等滲溶液，均勻混合。通過離心除去聚乙二醇，將菌體涂布在特殊的固體培養基上，再生細胞壁，最終得到轉化細胞。這種方法不僅適用于芽孢桿菌和鏈霉菌等革蘭氏陽性細菌，也對酵母菌、霉菌甚至植物等真核細胞有效。只是不同種屬的生物細胞，其原生質體的制備與再生的方法不同。3 、電穿孔驅動轉化：電穿孔是一種電場介導的細胞膜可滲透化處理技術。受體細胞在電場脈沖的作用下，細胞壁上形成一些微孔通道，使得 DNA 分子直接與裸露的細胞膜脂雙層結構接觸，并引發吸收過程。具體操作程序因轉化細胞的種屬而異。雖然電穿孔法轉化較大重組質粒（100Kb ）的轉化效率比小質粒（ 3

16、Kb）低一千倍，但這比 Ca2 +誘導和PEG轉化方法理想，因為這兩種方法幾乎不能轉化大于100Kb 的質粒 DNA 。4、基因槍法三、轉導（一）概念：以噬菌體為媒介，將供體菌DNA 片段轉移到受體菌內，使受體菌獲得新的遺傳性狀。（二）轉導現象的發現1952 年， Lederberg 和他的學生把鼠傷寒沙門菌的一個突變菌株LT22 （ try ）和另一個突變菌株LT2（ his ）混合培養物在基本培養基上培養，結果在107 個細胞中得到大約 100 個重組菌。為進一步驗證傷寒沙門菌是否通過細胞接合而產生重組體又進行了U 形管實驗，在接種LT22 的一端出現重組菌。說明沙門菌的重組不是通過細胞接

17、合，而是通過某些可濾因子。通過一系列實驗發現可濾因子具有一些特性? 不因 DNA 酶處理而失活。? 因加熱失活，抗P22 血清處理也失活。和從溶源性LT22菌株獲得的噬菌體（P22）具有相同的大小和質量。結論：基因的傳遞很可能是由可透過型曾2榔菌體介導的把P22的LT2和LT22菌株混合培養，在基本培養基上出現重組菌。隨意編輯Restricted transductioninfection（三）局限性轉導：以噬菌體為媒介，只能使供體的一個或少數幾個基因轉移到受體的轉導作用。Separate prophayn with bacterial markerViral replication a an

18、d lysismarkerA ce 11 becomesA+ with Incorporation .置j7 - Transducing1 /u n.% - h'B_ of marker carried by transducing phage入噬菌體為例：入噬菌體感染宿主菌后，它的染色體由線狀變為環狀。這一環狀 DNA分 子以它的附著位點 attP和細菌染色體 DNA同源位點attB作用，通過一次交換整合到宿主 染色體中。通過相反的過程入噬菌體可以脫離宿主染色體而成為游離的噬菌體，這一過程稱為切離。如果切離的位置有偏差則成為帶有宿主染色體的噬菌體，成為轉導噬菌體。轉導噬菌體在帶有宿主

19、細胞一部分染色體的同時必然失去自己的一部分染色體。（四）普遍性轉導：宿主基因組任意位置的 DNA成為成熟噬菌體顆粒 DNA 一部分而被帶 入受體菌。DNA導入真核細四、轉染：噬菌體、病毒或以它為載體構建的重組子導入細胞、或外源胞的過程稱為轉染。五、轉座：大多數基因在基因組內的位置是固定的，但有些基因可以從一個位置移動到另一位置。這些可在 DNA分子間進行轉移的 DNA片段，稱為轉座因子（或）可移動因子。由可移動因子介導的基因移位或重排稱為轉座。（一）原核生物的轉座子1、插入序列(insertion sequence, IS )轉座酶基因組成:? 反向重復序列（IR）:位于兩側，在IS的切割和D

20、NA鏈的轉移中起作用。? 轉座酶編碼基因：位于中間，產物引起轉座，負責識別切割轉座子的兩端及在靶部 位造成切口。? 正向重復序列：位于反向重復序列外側，為插入序列所特有。2、轉座子（transposon, Tn ）：是較復雜的轉座因子，除含轉座酶基因外還含有抗性或其他基因。分為兩類：? 復合轉座子：通常兩端為順向或反向重復的插入序列作為兩臂，中間為標記基因。圖 工一" 復轉座子的兩端往往每有 4個IS用列，在每個1S序列兩側各有倒置重修序列? 復雜轉座子：兩端不帶插入序列，但有反向重復序列。中央是轉座酶基因和抗藥性基因。阻遢和解*霰白質反向重復(TnpR)反向重復轉座薛(TnpA)

21、B-內Bt胺薛/S 3-5 Tn3的分子結構3、Mu噬菌體Mu噬菌體遺傳圖：線狀雙鏈分子，游離 Mu噬菌體DNA的兩端連接一段宿主 DNA , 左端約長100bp ,右端約長1500bp 。這兩段宿主 DNA序列在不同 Mu噬菌體DNA上各 不相同。Mu噬菌體基因組有以下特征：? 基因A和B分別編碼轉座酶和轉座輔助蛋白。? C基因產物對轉座酶基因的表達起阻遏作用。? 轉座時需要 Mu噬菌體的兩個末端，即 attL和attR。? 當Mu噬菌體DNA被包被在噬菌體頭部時，DNA的左末端帶有100bp的宿主DNA ,右末端帶有約長 1500bp 的宿主 DNA 。精品文檔當Mu噬菌體浸染宿主時，其線

22、形DNA進入細胞后，Mu噬菌體DNA通過剪-貼型的非復制方式，插入到宿主染色DNA的任意部位，成為原噬菌體。原噬菌體兩側各有一個5bp重復。免疫晚期mRNA合成的微活裂解頭、尾基因G片段（宿主范圍） j 可變末端 （宿主 DMA隨意編輯宿主DN2IC AB Cg _ 工deHfg itjkLm YNJ1 R5 u斗aitR圖8-7 Mu噬菌體的遺傳用譜原噬菌體：在大多數情況下，溫和噬菌體的基因組都整合于宿主的染色體中（如入噬菌 體），也有少數是以質粒形成存在（如 P1噬菌體）。整合于細菌染色體或以質粒形式存在的 溫和噬菌體基因組稱作原噬菌體。溶源化的野生型噬菌體相當穩定，但Mu噬菌體的突變株，

23、如溫度敏感抑制型-MuCts ,則可通過將溫度提高到 42 c而誘導其進入裂解循環。這是因為該突變體中的阻遏基因C失活，則噬菌體基因組中的 A蛋白和B蛋白大量表達，表達的 A和B轉座酶通過復制型轉座 機制使Mu插入到宿主染色體上 50-100個新的位點。同時，噬菌體的晚期基因開始表達， 如編碼噬菌體頭部、尾部、裂解蛋白等，然后從噬菌體DNA左端約50-150bp 處的宿主DNA進行切割，右末端也帶有 1-2kb的宿主DNA ,進行包裝。（二）轉座機制? 非復制轉座：轉座酶識別轉座子末端反向重復序列，并在3'端切開，同時在靶部位交錯切開單鏈，它的 5端與轉座子的3'端連接，形成中

24、間體。轉座子從原來位置上切下來轉入新的位置，兩條鏈均被保留。? 復制轉座：轉座酶識別轉座子末端反向重復序列，并在 3'端切開，同時在靶部位交錯切開單鏈，它的 5端與轉座子的3'端連接，形成中間體。在形成靶部位與轉座子連接中間體后即進行復制。通過復制使原來位置與靶部位各有一個轉座子。一條鏈是原有的，另一條鏈是新合成的。? 剪-貼型轉座：轉座酶識別轉座因子的兩個末端，在轉座因子的兩個末端進行雙鏈平端切割，完整的轉座子從供體DNA中釋放出來。同時轉座酶在受體的靶部位進行交錯切割，轉座子與靶部位的切口末端相連接。imlwpThe： UranipMon % icMdal JiiLe dT

25、 the cklUi.DNAin lb? tariFHRupiidBUfm fills m th。Rape.dupbcaluig seqrurinrca Qankui艮 the tFiUwpoMMl（三）轉座的遺傳學效應? 引起插入突變或啟動沉默基因。? 插入新的基因。? 原來位置保留轉座因子。? 造成靶 DNA 缺失倒位。? 切離? 生物進化第二節 基因的遺傳重組一、同源重組又稱一般重組，由兩條同源區的DNA 分子，通過配對，鏈的斷裂和再連接，而產生片段交換的過程。同源重組的分子模型分為三種：（二）分類1 、 Holliday 雙鏈侵入模型? 兩個同源染色體DNA 排列整齊。? 在 DNA

26、內切酶的作用下，兩個同源的非姐妹染色單體DNA 分子在相應位置同時切開。? 切開的單鏈交換重接，形成連接分子，稱為Holliday 中間體。? 通過分支移動產生異源雙鏈。? 交叉結構旋轉，產生Holliday 中間體的異構體。? Holliday 中間體切開，形成兩個雙鏈重組體DNA 。精品文檔2、單鏈侵入模型（Meselson radding 模型）? 兩個同源染色體DNA排列整齊。? 在DNA內切酶的作用下，兩個同源的DNA分子中的一個單鏈在隨機的位置被切開。? 切開的單鏈末端侵入另一個雙鏈DNA分子中，直到發現它的互補序列，并替代一條與它相同的鏈。? DNA聚合酶將利用留下的一條鏈作為模

27、板，填補侵入的鏈留下的缺口。? 被替代的鏈降解，它的殘留末端與另一分子中新合成的鏈連接，形成連接分子，為 Holliday 中間體。? 產生Holliday中間體的異構體。? Holliday 中間體切開，形成兩個雙鏈重組體DNA。3、雙鏈斷裂修復模型? 參與重組的一對 DNA分子之一的兩條鏈斷裂。? 核酸外切酶進一步作用，將雙鏈斷裂處加工成帶有3'末端單鏈突出的缺口。? 單鏈突出的3'末端侵入另一個同源染色體。修復合成填補缺口，形成兩個Holliday中間體，分支移動。兩個Holliday 中間體拆分。籟鋌入HI切薛基麟.壞（池J昭瞰 不對酢理海 女璉區異幽化,產生分支任移I

28、nltlatXon牝串碑,H4IGcaEEB ariidforKes疝t/an53 35Brancn migration prattlnsR-BSDivarBB用8 - 9友麗1用門|（植理本意圖了干薄£小用雄的1色*體的用個rsN A通懾孫子）（三）同源重組的酶學機制1 、 RecA 蛋：參與同源重組的酶至少有27 種，包括重組酶，解旋酶，外切核酸酶等，其中以重組酶RecA 最為重要。RecA 基因突變可以使同源重組頻率降低到10-6 以下。? 單鏈結合活性：ssDNA 結合力比dsDNA 結合力強100 倍。平均一個RecA 單體結合 4 個核苷酸，這種結合相當穩定,ATP 的存在可促進結合。? 雙鏈 DNA 結合活性：pH 6.0, 必需有 ATP 存在。? 雙鏈解旋作用：由于RecA 的結合，使雙鏈DNA 發生解 鏈。? ATP 酶活性：對ATP 的水解可促進聯會。2 、 RecBCD 酶：由 Re