1、 細胞融合 一、 實驗材料 手術剪，鑲子，離心機，蠟盤等。 二、 實驗所配試劑 1640根底培養液：取一包 1640干粉，溶于1000 mL雙蒸水中， 慢慢參加2.5 g NaHCOs,0.22叩濾膜過濾除菌，分裝，4C冰箱保存 備用。 青鏈霉素溶液(100X)：取青霉素100萬單位和鏈霉素1 g,無 菌溶于100mL已滅菌的三蒸水中，0.22 濾膜過濾除菌，1 mL/管 分裝，-20 C凍存備用。 1640完全培養液：向1640根底培養液中參加10%的小牛血清和 1%青鏈霉素溶液(100X)(為養成良好的操作習慣，建議不加最好)， 搖勻，4C冰箱保存備用。 HT培養液：在100 mL含15%

2、血清的1640完全培養液中參加 1 mL 100X的HT溶液，搖勻，4 C冰箱保存備用。 HAT培養液：在100 mL含15%血清的1640完全培養液中參加 2 mL 50X的HAT溶液(使用前HAT有局部白色沉淀應充分混勻)，搖 勻，4 C冰箱保存備用。 GNK 溶 液 ： 準 確 稱 取 KCL 0.4g , NaCL 8g , Na2HPO4 2H2O 1.77g(N&HPO412H2O 3.56g), NaJPO4 H2O 0.69g(NaH2PO4 2H2O 0.78g),酚紅0.01g,葡萄糖2g,加DDW 定容至1000mL,調節pH值 至7.2, 115C高壓滅菌，4C

3、保存備用。 三、實驗步驟 1. 免疫小鼠 選擇6-8周齡的Balb/c雌性小鼠進行免疫，免疫劑量 50 只， 皮下注射。免疫程序如下： 首次免疫：100 L抗原+100止弗氏完全佐劑/只 加強免疫：100 L抗原+100 gL弗氏不完全佐劑/只，于首免后2 周后進行。共免疫3次，每次間隔2周。第二次免疫后的第十天斷尾 采血一般尾部采血4止，溶于200止PBS混勻備用檢測效價，如 果效價很低或沒有效價，建議直接放棄，不用繼續再免疫。如果效價 可以，在二免后的2周進行三免，最后一次免疫10天后，斷尾采血， 用適當的抗原進行包被，用間接 ELISA檢測抗體效價，效價到達 1:1600以上即可進行細胞

4、融合。 超強免疫：最后一次加強免疫后 2周，細胞融合前35天，尾靜 脈或腹腔注射50純抗原。 2. 飼養細胞的制備 融合前1-2 d制備飼養細胞。取昆明鼠1只致死收集小鼠血清， 以供篩選時用該血清做陰性對照，75%酒精消毒體表，無菌手術剪 刀輕輕剝去小鼠的腹部皮膚，以防止剪破腹膜，暴露腹膜。然后用 5mL注射器和16號針頭將5mL預冷的HAT打入小鼠腹腔，輕輕壓擠 腹部，重新吸出注入的液體在吸取過程中為防止污染， 防止針頭刺 破腸管，收取小鼠腹腔巨噬細胞。用 HATW釋至40ml, 100uL/孔添 加到4塊96孔細胞培養板中，置37C 5% CQ培養箱中培養，第二 天檢查有無污染情況。 3.

5、 細胞計數 為保證NS0細胞在融合時到達最正確狀態和局活力，建議在融合 時前一天給所需的每瓶 NS0細胞換液，以備融合時使用。 80%左右NS0的細胞計數(三次平均數)：(11.6X 105+9X 105+3.7 x 105) /3=8.1 x 105/mL 脾細胞計數6.5X 106/mL,大約是40mL有2.6 x 108個細胞，兩次計 數相差不大，所以脾細胞數可固定為 2.6 x 108個/40mL。 NS0細胞計數： 3.7 x 105 個/mL (70% 9X 105個/mL (80% 11.6 x 105個/mL (90% 脾細胞計數: 4. 細胞融合 在40C水浴中預熱 GNK溶

6、液、PEG和HAT溶液； 免疫小鼠采血并別離血清，然后致死浸泡到酒精中； 收集NS0細胞于50 mL離心管中為保證高融合率建議大于 4瓶 90%的NS0細胞，1000 r/min離心10 min,棄上清，用GNK洗一次； 5小鼠脾細胞的制備 依次剪開小鼠皮膚，腹膜暴露腹腔建議為防止污染，建議至少 用兩套手術刀具，一套用于剝開小鼠外部皮膚和腹膜， 另一套用于取 出小鼠脾臟，取脾臟放置與尼龍紗布上充分研碎，并用 GNK洗下 去，收集脾細胞于50 mL離心管中，1000 r/min離心10 min,棄上清， 打散細胞團； 將脾細胞與NS0骨髓瘤細胞混合于50 mL離心管中，加GNK溶 液至40 mL

7、, 1000 r/min離心10 min,棄上清，打散細胞團充分打 散細胞團，以保證融合時的高融合率； 為保證融合時的溫度可以事先將混勻好的細胞在 40 C水浴預熱兩 分鐘，然后在另一剛取出的40C水浴燒杯中做融合，用1mL或大于 1mL吸管將預熱的50%PEG pH8.0滴加到融合管中，邊加邊輕輕 搖動融合管， 1min或80s內加完，并繼續在水浴中緩緩搖動融合管 1.5min。立即緩慢滴加37C預熱的GNK溶液15mL。參加步驟為：1 mL/30s, 3 mL/30s , 11 mL/30s。然后慢慢補加 GNK 溶液至 40mL, 37C水浴靜置 5min, 1000 r/min離心10

8、 min,棄上清。 打散細胞團，力口 40mL HAT完全培養具吹打混勻，加到含飼養細 胞的96孔細胞培養板上，每孔100L，置37C 5% CO2培養箱中培 養。 克隆細胞的篩選、轉孔及亞克隆 一、 融合細胞的培養 1、 融合后的細胞置于 CO2培養箱中培養，次日檢查有無污染， 如發現污染立即滴加1%的NaOH。 2、 一般2 3d可見小克隆；7d時于出現克隆的孔內半量換液注 意：37 C預熱HAT培養基； 3、 10d左右可以吸取少量上清用于篩選一般吸取 50 100 L, 并補加等量的HAT培養基換液時應輕柔，以減少對克隆細胞的損 傷； 4、 14d左右對所篩選的陽性孔可半量更換 HT培

9、養基，同時對篩 選陽性孔的細胞轉至24孔培養板中擴大培養，準備克隆化。在篩選 過程中將HAT培養基逐漸更換為完全培養基 RPMI1640/10。 二、 篩選 (1) 包被。將抗原以pH 9.6的NaCO3-NaHCO3包被，每塊酶標板以 5-20ug抗原為宜(如果抗原為多肽或小分子物質，那么需要加大包被量， 如果是純化病毒根據病毒的濃度做 1:400-1000倍稀釋)。每孔的包被 體積為50ul。37C包被2h或4C包被過夜。 (2) 封閉。倒掉抗原，拍干酶標板孔內液體， 5%脫脂牛奶(PBST 溶解) 或其它無關物種血清于 37C封閉2h,封閉完后可立即使用， 也可以洗滌一次置于4C密封保存

10、以備后面使用。 (3) 一抗。封閉完后，棄去孔內液體，拍干，用封閉液 1:1稀釋待 檢測克隆孔上清，每孔 50ul為宜。同時做陽性(融合小鼠血清 1:500-1000倍稀釋)和陰性(所制備飼養細胞小鼠血清1:200倍稀釋) 及空白對照(所稀釋抗體用封閉液) 和無克隆孔上清對照。在每塊板 子上做好標記。37 C孵育30min。 (4) 二抗。孵育完一抗后，棄去孔內液體，拍干，以 PBST洗滌3 次，每次5min。根據二抗說明稀釋二抗至適當比例，每孔參加 50ul, 37C 孵育 30min。 (5) 顯色。孵育完二抗后，棄去孔內液體，拍干，參加顯色劑，37C 顯色5-10min,拍照記錄檢測結果

11、，篩選出陽性較強的克隆進行特異 性檢測。 三、特異性篩選 對篩選的強陽性克隆孔進行特異性篩選，如果是用大腸桿菌表達 的蛋白，可以用載體蛋白、正常大腸桿菌上清以及其它無關蛋白進行 包板檢測；如果是細胞毒免疫的可以用正常細胞的裂解液包板檢測； 如果是組織毒免疫的可以用正常動物組織包板檢測。其檢測方法同 上，注意設立對照組。同時對篩選的特異性較強的陽性孔轉至 24孔 培養板中擴大培養，準備克隆化。 四、 陽性細胞的轉孔 1、 為保證轉孔成功，建議當 96孔板細胞長至80%時轉孔。 2、 按常規方法轉孔前一天制備飼養細胞， 24孔板每孔參加0.5-1ml 的飼養細胞懸液，第二天檢查有無污染情況。 轉孔

12、時所用培養基和 轉孔前所用培養基應保持一致。 3、 收集待轉孔的陽性細胞上清，做好標記保存備用，添加已預熱的 HAT和HT培養基1:1混合因此時96孔板克隆已半量過度到 HT 培養基各100ul/孔。 4、 用200ul移液器輕輕吹下細胞，為減少對克隆細胞的刺激，吹打 過程應輕柔，然后將細胞懸液參加至 24孔板中，為保證細胞均勻分 布到板底，可以用振蕩器輕輕混勻，做好標記。同時，對所轉孔細胞 補加新的培養基，保存原始孔以防止轉孔失敗。 五、 轉孔后的檢測 當轉孔后細胞長至50%時，用ELISA檢測方法及時進行效價檢 測和特異性檢測，檢測方法同上，篩選出效價高和特異性較強的準備 亞克隆。同時在篩

13、選過程中對24孔板的細胞逐步更換至1640完全培 養基。 六、 雜交瘤細胞的克隆 為保證克隆細胞的活性和數量，建議當待克隆的細胞孔長至80% 時進行有限稀釋。提前一天制備飼養細胞，收集待轉孔細胞的培養上 清保存備用，參加已預熱1640不完全培養基1ml 其目的是該孔細 胞被有限稀釋后可以凍存該孔細胞。凍存方法為：直接吸取 500 ul 該孔細胞懸液，再參加 400 ul胎牛血清和100 ulDMSO混勻，1ml/ 管，做好標記，按照正常程序凍存細胞，輕輕吹打混勻細胞，取出 少許細胞懸液 進行計數，采用有限稀釋法對陽性孔的融合細胞進行克 隆化。其步驟如下： 1、 用10ul臺盼藍和10ul細胞懸

14、液于PCR管中等比例混合后， 在顯微鏡下進行活細胞計數根據公式：細胞數 /mL = N/4 x 103 X 10 X稀釋倍數N為顯微鏡下四角4個大方格的活細胞總數來計算每 毫升細胞懸液所含的活細胞數，然后取適量的細胞懸液，用 1640培 養基此時24孔板克隆細胞過度到那種培養基就用那種培養基做有 限稀釋稀釋到10mL,并且要含有2X 103個活細胞稀釋度I; 2、 取1mL稀釋度I的細胞懸液加 9mL1640完全培養基 稀釋 度II； 3、 取3mL稀釋度n的細胞懸液加 7mL1640完全培養基 稀釋 度m; 4、 用稀釋度I的細胞懸液鋪板半塊 96孔板，100四孔，20個 細胞/孔；用稀釋度n的細胞懸液鋪板另半塊 96孔板，100此/孔，2 個細胞/孔；用稀釋度山的細胞懸液鋪一塊 96孔板，100 gL/孔，0.6 個細胞/孔； 5、 將上述培養板置于CO2培養箱中培養，培養7d后，對單克隆 孔進行標記并半