1、研究生課程論文（作業）封面（ 2015 至 2016 學年度 第 2 學期）課 程 名 稱： 植物顯微技術 課 程 編 號： 學 生 姓 名： 學 號： 年 級： 任 課 教 師: 提 交 日 期： 2015 年 7 月 1 日成 績：_教 師 簽 字：_開課-結課：第 7 周-第 12 周評 閱 日 期： 年 月 日東北農業大學研究生院制擬南芥AtASK21基因突變對植株根發育的影響 東北農業大學 生命科學學院 黑龍江 哈爾濱 150030摘要：當前，突變體已成為功能生物學研究的重要工具。模式植物擬南芥突變體的研究能促進其在功能、進化上的了解。本研究發現擬南芥AtASK21基因突變導致植株發

2、育遲緩，根徑變小，同時縱切根發現，突變體ask21細胞長度減小，數量增多。關鍵詞：擬南芥；突變體；ASK21；發育引言石蠟切片組織學常規制片技術中最為廣泛應用的方法。石蠟切片不僅用于觀察正常細胞組織的形態結構，也是病理學和法醫學等學科用以研究、觀察及判斷細胞組織的形態變化的主要方法，而且也已相當廣泛地用于其他許多學科領域的研究中。擬南芥突變體已成為功能生物學研究的重要工具。其在群體遺傳變異、自發突變體表型、人工突變體庫構建、突變體基因功能分析等方面取得的進展。擬南芥突變體的研究能促進其在功能、進化上的了解，更有助于其他高等植物的基因功能分析。泛素化過程在植物多種細胞反應中起著重要的作用，如細胞

3、分裂周期的調控，激素信號傳導和脅迫響應等1。S期激酶相關蛋白1（SKP1）是一SCF復合體的組分之一，參與真核生物中的蛋白泛素化過程2。在擬南芥中已確定21個同源基因統稱為擬南芥類SKP1基因（ASKs）3。ASK1是在擬南芥中第一個分離出的SKP1同源基因4，5，已報道有TIR1 F-box及COI1 等F-box蛋白與ASK1相互作用6，7。ASK2與ASK1相似性是最高的8，其同樣也參與到調控減數分裂過程。在ask1突變體中，超表達ASK1可以彌補這種突變使花粉和四分體的正常比率提高，超表達ASK2也可以部分彌補這種突變所引起的敗育，但明顯不如前者。 當然，即使是超表達ASK1也無法使a

4、sk突變體恢復到野生型的水平。在ask1突變體中，減數分裂的很多過程會出現異常，比如染色體凝縮、同源染色體結合與分離異常，而這些異常最終導致聯會與分離的紊亂。有研究表明ASK1蛋白能夠通過定位減數分裂早期調控因子或需降解的基質蛋白來控制染色質的結構，從而影響減數分裂的正常進行9。有研究證實ASK1在減數第一次分裂前期對于同源染色體重組、染色質從核膜上釋放以及核仁的移動與重構都起到十分重要的作用10。另外，在ask1突變體中，擬南芥位于第2輪和3輪的花瓣和雄蕊出現異常，即矮小而且具有花瓣與雄蕊共同特征的器官會在很多花中出現，出現與ufo突變體類似的表型。UFO是一個花分生組織特異性基因， 它可以

5、對LFY和AP1的花分生組織形態建成對ASK1引起雄性不育起到輔助作用， 同時參與生長素應答作用11。ASK2蛋白，具有ASK最相似的序列，能夠替代ASK1參與雄性減數分裂。此外ask1/ask2雙突變體表現出在胚胎期的發育遲緩，和在幼苗期的出現致死現象。除ASK1，ASK2以外，ASK家族的其他成員功能也有一定的研究。通過T -DNA插入ask11/ask12的突變體發現沒有明顯的表型變化。 通過Ds插入突變體ask14/ask18在發育上的表型同樣不明顯。此外，不同于典型的ASKs，ASK20和ASK21在結構上明顯區別于其他的ASKs，他們在擬南芥ASK蛋白的系統結構聚類分析中聚集到另一

6、個分支。據報道，蛋白ASK20a和ASK20b在酵母雙雜和三雜交系統中不能與CUL1相互作用，可能會起到阻止SCF復合物的其他組分結合形成SCF復合物的作用12。1材料方法1.1 植物材料 植物材料選擇哥倫比亞野生型擬南芥與ask21突變體植株1. 2方法采用石蠟切片法制備標本進行觀察，具體步驟如下：第一天安排準備工作：在操作之前配制30%、50%、70%、85%、95%的酒精溶液（利用95%的酒精溶液配制）、100%酒精。 操作時間操作步驟 13：00將材料至于70%的酒精中 15：00將材料至于85%的酒精中 17：00將材料至于95%的酒精中，其中加入幾滴1%蕃紅溶液中第二天的安排準備工

7、作：在操作之前配制2/3酒精+1/3二甲苯、1/2酒精+1/2二甲苯、1/3酒精+2/3二甲苯、純二甲苯、石蠟（熔點52-54）、先預熱溫箱使其穩定在35-37。操作時間操作步驟7：00將材料至于100%的酒精中8：00將材料至于100%的酒精中9：00將材料至于2/3酒精+1/3二甲苯中11：00將材料至于1/2酒精+1/2二甲苯中13：00將材料至于1/3酒精+2/3二甲苯中15：00將材料至于100%二甲苯中16：00將材料至于100%二甲苯中17：00向小瓶中加入石蠟屑，使其達到飽和，放入35-37的溫箱中過夜注：疊紙盒并在上面編號：在盒壁上寫上欲包埋的材料名稱第三天的安排準備工作：在

8、操作之前，將蠟入在敞口瓶中在浸蠟箱中熔化、準備好小盒、水盆及涼水。操作時間操作步驟8：00倒出1/2二甲苯石蠟后，再倒入1/2溶化的石蠟10：00倒出1/2二甲苯石蠟后，再倒入1/2溶化的石蠟12：00倒出1/2二甲苯石蠟后，再倒入1/2溶化的石蠟2：00倒出全部的石蠟后，倒入純的石蠟3：00倒出全部的石蠟后，倒入純的石蠟4：00包埋：浸蠟后，將事先疊好的小盒放在桌上，取事先溶好的石蠟倒入盒中，然后迅速從溫箱中取出材料，移入盒內，并注意擺好位置和切面，等盒內石蠟表面開始凝固時，將紙盒移至冷水中冷卻加速凝固。待完全凝固后，從水盆中取出試干，等等切片。 第四天的安排準備工作：調好旋轉切片機，磨好切

9、片機的刀，刀片，干凈的載片，梅氏粘貼劑，蒸餾水，酒精燈，解剖刀，毛筆等第一步：切片1 固著和修整：取包埋好的材料，將蠟塊的材料之間切一適當深溝，用手掰開，用解剖刀切去材料周圍的石蠟，僅留部分不使材料暴露的適當大小方塊，并將切面相對的一面粘附在一個木塊上。2 將上述的木塊固定的旋轉切片機的夾物部上，調節切片厚度（10-15微米）及切片刀的角度，旋轉切片機手輪柄即可切成連續的蠟帶。第二步：粘片取干凈載片，用清潔手指蘸少許梅氏粘貼齊均勻地涂在載片上（一定要薄），再在其上加數滴蒸餾水，分割蠟帶將蠟片浮于水上，在酒精燈上微微加熱，使其展平，傾斜載片上，排去多余水分，用解剖刀（針），調整材料位置后，放35

10、-37度的溫箱干燥。第五天的安排準備工作：染色缸、各級濃度的酒精、酒精與二甲苯的按比例混合溶液，平面皿，費液缸，中性膠（加拿大樹膠），蓋片，鑷子，標簽紙。第一步：染色1 先將干燥好的載片放入盛二甲苯的染色缸內去蠟10分鐘，直到沒有蠟為止。2 取出載片分別在材料上依次滴加二甲苯、1/2純酒精+1/2二甲苯、純酒精、蒸餾水。各級用2分鐘，用蕃紅染色液染2-3分鐘，加入幾滴蒸餾水去掉輔色，然后，加入30%酒精、50%酒精、70%酒精、85%酒精，各級為2-3分鐘，加入固綠染色液染色10-30秒，95%酒精，（停留一會），100%酒精（加入兩次），1/2純酒精+1/2二甲苯，二甲苯。第二步：透明滴染后

11、的材料再放入另一盛二甲苯的染色缸中（10-30分鐘）。第三步：封固取透明好的切片，將材料周圍擦拭干凈，滴一滴加拿大樹膠后，再取干凈的蓋片從樹膠滴一側放下蓋好，并防止氣泡發生。第四步：用顯微鏡觀察并選擇典型的結構進行照相。2 結果與分析2. 1擬南芥AtASK21基因突變使植株根系根徑減小通過觀察發現，擬南芥ask21突變體植株的根徑明顯小于野生型（圖1）。2.2 擬南芥AtASK21基因突變使植株根細胞增多，尺寸減小通過觀察發現，擬南芥ask21突變體植株根中的細胞數量明顯多于野生型，而細胞大小要小于野生型（圖2）。3結論本研究發現擬南芥AtASK21基因突變導致植株發育遲緩，根徑變小，同時縱

12、切根發現，突變體ask21細胞長度減小，數量增多。參考文獻：1 D Zhu, H Cai, X Luo, et al., Over-expression of a novel JAZ family gene from Glycine soja, increases salt and alkali stress tolerance J. Biochem Biophys Res Commun, 2012. 426(2): 273-9.2 Y Ge, Y Li, Y M Zhu, et al., Global transcriptome profiling of wild soybean (Glyc

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16、 the rice OsHKT2;1 and OsHKT2;2 transporters in plant cells J. Plant Physiol, 2010. 152(1): 341-55.8 Z Ali, H C Park, A Ali, et al., TsHKT1;2, a HKT1 homolog from the extremophile Arabidopsis relative Thellungiella salsuginea, shows K(+) specificity in the presence of NaCl J. Plant Physiol, 2012. 15

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