1、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在水果品質(zhì)控制方面的應(yīng)用進展摘要：蛋白質(zhì)組學(xué)旨在闡明基因組所表達的真正執(zhí)行生命活動的全部蛋白質(zhì)的表達規(guī)律和生物功能。其對生命現(xiàn)象的詮釋直接、準(zhǔn)確，已逐漸成為現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的支撐技術(shù)。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)在食品科學(xué)方面的應(yīng)用逐漸涉及各個方面，包括果實保鮮研究、食品功能研究、食品營養(yǎng)分析、食品品質(zhì)評價、安全檢測及真?zhèn)舞b別等。這為與食品科學(xué)相關(guān)的研究提供新思路和新技術(shù)。本文概述了蛋白質(zhì)組學(xué)的概念及相關(guān)主要研究技術(shù)，分析了蛋白質(zhì)組學(xué)在食品科學(xué)研究中的應(yīng)用，尤其水果品質(zhì)控制方面，并對其在食品加工檢測方向的發(fā)展前景進行了展望。關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學(xué)；電泳技術(shù)；質(zhì)譜技術(shù)；水果；品質(zhì)控制The ap

2、plication progress of proteomics technology in fruit quality controlAbstract: Proteomics seeks to clarify the genome expression really perform life activities protein expression pattern and biological functions. Direct interpretation of the phenomenon of life, accurate, and has gradually become the

3、support of the development of modern biotechnology techniques. In recent years, the application of proteomics in food science gradually involve all aspects, including fresh fruit research, functional food, food nutrition analysis, evaluation of food quality, safety testing, and the authenticity of i

4、dentification. This is to provide new ideas and new technology research and Food Science. This article provides an overview of the concept of proteomics and related research, analysis and application of proteomics in food science, especially fruit quality control aspects and prospects of its develop

5、ment in the direction of food processing detection prospect.Keywords: proteomics; electrophoresis; mass spectrometry; fruit; quality control前言1994年澳大利亞科學(xué)家Marc Wilkins提出蛋白質(zhì)組概念，并在1995年7月在Electrophoresis生命科學(xué)領(lǐng)域從那開始取得了許多突破性的進展。特別是2003年人類基因組計劃完成，功能基因組時代到來，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究被提升到新的高度1。全基因組測序工程為世界各物種基因組學(xué)的研究奠定了重要的信息基礎(chǔ)，

6、也為蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供分析基礎(chǔ)。植物基因組尤其是水果類基因組相對龐大，測序工作進展緩慢。目前，已測序完成的水果物種有：番木瓜 Carica papaya (Papaya)，西瓜 Citrullus lanatus (Thunb.) (Watermelon)，甜橙 Citrus sinensis (Sweet orange)，甜瓜 Cucumis melo (Melon)，黃瓜 Cucumis sativus (Cucumber)，草莓 Woodland strawberry (Fragaria vesca)，蘋果 Malus × domestica (Domesticated ap

7、ple)，木薯 Manihot esculenta (Cassava)，香蕉 Musa acuminata (Banana)，桃 Prunus persica (Peach)，番茄 Solanum lycopersicum (Tomato)，葡萄Vitis vinifera (Wine Grape)。蛋白質(zhì)組學(xué)作為一項較為新興的技術(shù)，以蛋白質(zhì)組為研究對象，在蛋白質(zhì)水平上，整體，定量，動態(tài)地去研究和分析正在工作的基因組，是后基因組時代的一個重要組成部分2, 3。蛋白質(zhì)組學(xué)主要對蛋白質(zhì)表達進行研究分析，研究工具以分離技術(shù)和生物質(zhì)譜技術(shù)為支撐平臺，生物信息學(xué)為橋梁。蛋白質(zhì)賦予食品功能性及營養(yǎng)性等特性

8、，是食品重要組成成分之一。蛋白質(zhì)是生物體細胞的重要組成成分，在細胞的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用。為了保證食品蛋白組分的生化活性達到最高期待值，對食品的生產(chǎn)，包括原料養(yǎng)殖（種植）、收獲、加工、保藏等環(huán)節(jié)的控制都需有嚴格的要求。因此，在食品生產(chǎn)及最終產(chǎn)品質(zhì)量控制上，需進行必要的蛋白質(zhì)檢驗。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在食品蛋白質(zhì)研究中應(yīng)用越來越廣泛。在功能性食品或者高附加值食品的真?zhèn)舞b別和品質(zhì)控制中，蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)對蛋白質(zhì)組分進行分析，獲得本質(zhì)的產(chǎn)品信息。與傳統(tǒng)的檢測方法相比優(yōu)勢明顯，且為食品功能研究、營養(yǎng)分析、安全監(jiān)測、品質(zhì)控制與評價、新型食品開發(fā)等研究領(lǐng)域提供新方法。本文綜述了蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究技術(shù)及在

9、食品方面的應(yīng)用進展，重點論述其在水果品質(zhì)控制與分析，并對其在食品安全監(jiān)測方面的應(yīng)用進行展望。1 蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組(proteomics)是一個基因組所表達的全部蛋白質(zhì)4，即生物物種、個體、器官、組織、細胞乃至體液等在特定的環(huán)境條件、特定的時刻全部蛋白質(zhì)表達的圖譜。概括來講，蛋白質(zhì)組學(xué)是基于蛋白質(zhì)組的對大量蛋白質(zhì)的整體研究，包括在生長發(fā)育中和各種外界因素下的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和豐度的變化等5。同時，蛋白質(zhì)組學(xué)是基因組學(xué)與代謝組學(xué)之間聯(lián)系的橋梁，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究旨在闡明組織、器官或生物體全部蛋白質(zhì)的表達模式及功能模式，揭示特定生命現(xiàn)象和過程的機理。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有的高通量、高精確度等特點，為植物

10、的生長發(fā)育、成花機理、脅迫反應(yīng)、生理處理等內(nèi)在機理的研究在蛋白質(zhì)水平上提供了新的研究途徑1。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要技術(shù)有：蛋白質(zhì)組分分離技術(shù)，蛋白質(zhì)組分鑒別技術(shù)及利用蛋白質(zhì)信息學(xué)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能進行分析和預(yù)測。目前蛋白質(zhì)分離分析技術(shù)主要有四種較為常用，分別為：電泳技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)、色譜技術(shù)及蛋白質(zhì)芯片技術(shù)。蛋白質(zhì)組學(xué)的三大核心技術(shù)分別是雙向電泳技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)6。其中，雙向電泳技術(shù)和質(zhì)譜相結(jié)合的方法是目前較為經(jīng)典且應(yīng)用廣泛的技術(shù)7。2 蛋白質(zhì)組學(xué)關(guān)鍵技術(shù)2.1 蛋白質(zhì)樣品的提取制備蛋白質(zhì)樣品的提取及制備技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。理想的蛋白質(zhì)提取方法能夠獲得大量蛋白、最大程度降低

11、蛋白污染和防止蛋白變性和降解并具有可重復(fù)性，有助于獲得高質(zhì)量2-DE圖譜和蛋白質(zhì)相關(guān)信息后續(xù)研究8。蛋白樣品制備是獲得高質(zhì)量且重復(fù)性好的2-DE凝膠圖像的關(guān)鍵步驟。蛋白樣品的提取的傳統(tǒng)常用方法是TCA/丙酮法和酚抽法。但是，在大量的實驗研究中，科學(xué)研究人員根據(jù)原材料的特殊組成常對著兩種方法進行改良以獲得最為適合自身研究材料的提取方法。不管采用哪種方法，在蛋白質(zhì)樣品制備過程中，應(yīng)盡可能提高樣品蛋白溶解度，抽提最大量總蛋白，減少蛋白損失，減少對蛋白的人為修飾，破壞蛋白質(zhì)與其他生物大分子的相互作用，并使蛋白質(zhì)處于完全變性狀態(tài)。TCA/丙酮沉淀法9和酚抽法10是植物蛋白質(zhì)提取的基本且常見的方法。Isa

12、acson等11對上述兩種方法做了簡要的說明及對比，認為TCA/丙酮法雖已成功運用于植物幼嫩組織蛋白的提取。但對復(fù)雜的頑拗植物組織，如：成熟葡萄果粒、馬鈴薯葉片、香蕉果實等，使用酚抽法比TCA/丙酮法獲得更好的實驗結(jié)果。采用酚抽法可以抑制蛋白酶的活性，避免蛋白質(zhì)的降解，還可較好地避免酚類、多糖和色素等物質(zhì)的干擾，得到的蛋白質(zhì)干粉中雜質(zhì)少。Vincent等12在進行葡萄果實蛋白質(zhì)提取時也表明，酚抽提法雖操作復(fù)雜、耗時長，但能獲得更多的蛋白點和高質(zhì)量的雙向電泳圖譜。Vincent等還發(fā)現(xiàn)利用酚抽提法用尿素、硫脲素兩種裂解劑再懸浮相結(jié)合的方法更適合葡萄蛋白的提取。同時，Wang等13在提取葡萄果實蛋

13、白質(zhì)組時采用了PVPP/TCA法，即將酚類化合物用酸化的PVPP（增加PVPP聚合能力和消除PVP的污染）多次洗脫后，再用TCA、丙酮沉淀蛋白，此方法耗時少、毒性小且2-DE圖譜的質(zhì)量會隨PVPP洗脫次數(shù)的增加而提高，同時還適于葡萄果實中-1,3-葡聚糖酶(-1,3-glucanase)的檢測與分析。然而，植物細胞中包含多種次生代謝物質(zhì)，可能會干擾蛋白的提取、分離及純化14，從而在果實組織中提取蛋白質(zhì)難度增加。由于果實中蛋白質(zhì)含量相對較低，并且含有大量干擾性物質(zhì)，如色素、淀粉、多酚、多聚糖、單寧和有機酸類等，對高純度蛋白質(zhì)的提取也有一定的難度15。水果果實蛋白質(zhì)的提取分離與鑒定研究技術(shù)需要進一

14、步探討與優(yōu)化。2.2 蛋白質(zhì)濃度的測定蛋白質(zhì)濃度的測定用于衡量蛋白樣品的提取量是否滿足雙向電泳及后續(xù)實驗的需要。蛋白質(zhì)濃度的測定常采用Gornall雙縮脲16、Lowry酚試劑17、Bradford法18等比色定量的方法測定,其中Bradford法是應(yīng)用最廣的，很多試劑盒就是在它的基礎(chǔ)上優(yōu)化得來。Levashov等19發(fā)現(xiàn)Goa法不僅能夠測定全蛋白濃度，還能對較難測定的寡肽、膜蛋白質(zhì)等的濃度進行測定。并且Goa方法所獲得校準(zhǔn)曲線較穩(wěn)定，靈敏度高，能夠適合含量在0.11.2mg范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的測定，并且不用繁瑣的稀釋，較為方便。另外，Goa法還可檢測1g/ml的多肽溶液。2.3 電泳技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)

15、研究中，主要的電泳技術(shù)是雙向凝膠電泳(2-DE)，其他還有聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、毛細吸管電泳(CE)等。SDS-PAGE曾是蛋白質(zhì)分析較為常用的方法，此法具有特異性強、操作簡單及干擾因素少等優(yōu)點，可用于檢測蛋白質(zhì)純度、評估蛋白質(zhì)分子質(zhì)量等。但是這種方法只能將不同分子質(zhì)量的蛋白分離，對于分子質(zhì)量相同的蛋白則無法分離20。毛細管電泳(CE)是一種新興的色譜分離技術(shù)，這種技術(shù)是將經(jīng)典電泳技術(shù)與現(xiàn)代微柱分離有機結(jié)合21。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的高效分離分析。與經(jīng)典電泳相比，毛細血管電泳由于其側(cè)面積/截面積大、能克服由于焦耳熱引起

16、的譜帶展寬、散熱快、可承受高電壓，其分離效率較高22。此外毛細血管電泳還具有靈敏度高、樣品需求少、速度快、種類多、分離范圍廣、成本低等諸多優(yōu)點。但是其對于復(fù)雜樣品的分離尚且不完全。2.3.1 雙向電泳技術(shù) 雙向電泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)由OFarrell于1975年創(chuàng)立的，作為蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)之一，是目前常用的唯一能連續(xù)在一塊膠上分離某一物種的數(shù)千種蛋白質(zhì)的方法，同時是當(dāng)前分辨率較高的工具，已在生物學(xué)研究方面得到廣泛的23。雙向電泳根據(jù)蛋白質(zhì)兩個相互獨立的特性等電點和分子量對蛋白質(zhì)組分進行兩次電泳：第一向等電聚焦(Isoelectr

17、ofocusing, IEF)，IEF是基于蛋白質(zhì)等電點不同而將其分離；第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，是基于蛋白質(zhì)亞基分子質(zhì)量不同而分離，從而達到在二維空間上先后將蛋白質(zhì)分離的目的，并能得到蛋白質(zhì)等電點和分子量的信息。兩次電泳后會在二維膠上出現(xiàn)濃度不等的點，一個點通常代表一種蛋白質(zhì)。電泳之后的染色主要有考馬斯亮藍染色法和銀染法、負染、熒光染色法等。但二維電泳技術(shù)對低拷貝、強疏水性、低溶解度、極酸或極堿的蛋白質(zhì)不易分離，同時也存在繁瑣、靈敏度低、不穩(wěn)定等缺點24。實驗過程中，影響雙向電泳圖譜效果的因素有多方面。在進行苜蓿、水稻及一些鹽生植物25-27等的生物學(xué)研究中，不同

18、的蛋白提取方法、不同分離膠濃度、不同等電聚焦(IEF)電泳上樣量、不同pH范圍的固相pH梯度(immobilized pH gradients, IPG)膠條進行的蛋白質(zhì)雙向電泳圖比較，并選取圖譜較為滿意的雙向電泳條件。另外，實驗中雙向電泳圖譜重復(fù)性的優(yōu)劣關(guān)系到實驗數(shù)據(jù)的可比性和平行試驗間數(shù)據(jù)的參考。保證雙向電泳實驗良好的重復(fù)性也是研究后續(xù)差異表達蛋白的基礎(chǔ)。電泳過程中，保證參數(shù)和操作一致，如等電聚焦的電壓、時間控制，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移時膠條的位置、SDS-PAGE的電流電壓、染色用水、試劑過濾等操作，從而可保證蛋白質(zhì)斑點數(shù)目、等電點、分子質(zhì)量以及蛋白質(zhì)量等在多次不同試驗中具有較好的重復(fù)性。水果果實中

19、含大量多糖、色素、酚、醌等次生代謝產(chǎn)物，給蛋白質(zhì)雙向電泳研究增加了難度。曾有人使用管狀載體兩性電解質(zhì)凝膠電泳研究果實蛋白質(zhì)組學(xué)28，該實驗對研究水果果實蛋白質(zhì)組有一定的推動作用，但由于方法的局限性較難滿足對果實蛋白質(zhì)組學(xué)研究需要。近年來，應(yīng)用IPG-IEF與SDS-PAGE系統(tǒng)雙向電泳研究水果果實蛋白質(zhì)組方法逐漸變得普遍并成熟。2.3.2 蛋白質(zhì)裂解液的選擇 植物果實中富含的酚類、多糖以及色素等次生代謝物質(zhì)對蛋白質(zhì)等電聚焦干擾很大，容易在2-DE凝膠圖譜中產(chǎn)生水平條紋。在雙向電泳過程中，為獲得較好的等電聚焦效果，蛋白質(zhì)樣品必須完全溶解。因此，樣品裂解緩沖液需達到蛋白樣品的最大溶解度。樣品裂解液

20、通常包含離液劑，如尿素和硫脲；表面活性劑，如CHAPS和Triton X-100；還原劑，如DTT、二硫赤蘚糖醇(DET)以及磷酸三丁酯(TBP)；也可以選擇性的加入Tris-base、蛋白酶抑制劑以及核酸酶等組分29。盧丞文6在番茄果實的實驗研究中發(fā)現(xiàn)，緩沖液中尿素濃度的升高和表面活性劑Triton X-100的加入，對蛋白樣品溶解度的增加有促進作用。2.3.3 蛋白質(zhì)上樣量的選擇 水果果實的蛋白質(zhì)表達豐度因品種而差別較大，增加或減少蛋白質(zhì)的上樣量會影響樣品溶液中鹽離子的含量進一步影響等電聚焦效果。因此，蛋白質(zhì)樣品上樣量直接影響雙向電泳圖譜的效果。不同水果果實的實驗應(yīng)比較不同蛋白上樣量的圖譜

21、，選擇最為合適的上樣量使得雙向電泳圖譜中蛋白點數(shù)目多，各點分離清晰，并能滿足雙向電泳及后續(xù)的質(zhì)譜分析的需要。王一鳴等30以發(fā)育中期的桃果實為試材，探索適用于全細胞蛋白質(zhì)組分離的雙向電泳技術(shù)。為使得雙向電泳圖譜背景清晰并蛋白點分離效果好，實驗采用TCA丙酮沉降蛋白11，所用上樣緩沖液含有硫脲和SB3-10效果較好，含有碘乙酰胺的平衡緩沖液其產(chǎn)生背景紋理少、蛋白點清晰，合適的上樣量，較窄pH范圍的膠條及染色方法最佳選擇會使得背景清晰，蛋白點清楚突出。楊愛珍等31為了探究桃果實發(fā)育過程后期中、內(nèi)果皮不同的代謝進程，以“大久保”桃(Prunus persica L.cv.Okubao)盛花后56天的果

22、實為試材，TCA/丙酮沉淀法提取蛋白質(zhì)，采用固相pH梯度(immobilized pHgradients，IPG)雙向電泳系統(tǒng)分離蛋白質(zhì)，凝膠銀染顯色后用圖像分析軟件比較分析差異表達的蛋白點，初步了解中果皮和內(nèi)果皮蛋白質(zhì)組表達的差異點。采用pH 5-8 IPG膠條進行等電聚焦得到的雙向電泳圖譜在中果皮與內(nèi)果皮中檢測到蛋白質(zhì)點的數(shù)量分別為（1273±101）和（1292±115）個，所有匹配的蛋白點中有65個在中果皮與內(nèi)果皮的圖譜中均存在，其中30個為內(nèi)果皮相對于中果皮2倍（P<0.05）上調(diào)的點，35個為內(nèi)果皮相對于中果皮2倍（P<0.05）下調(diào)的點。有10個蛋

23、白點僅在中果皮表達，18個蛋白點只在內(nèi)果皮表達而中果皮未顯示。表明桃果實發(fā)育硬核期中果皮與內(nèi)果皮的蛋白質(zhì)組存在一定差異，這些差異初步解釋為內(nèi)果皮主要是進行木質(zhì)素的沉積，而中果皮主要是進行碳水化合物的代謝過程并為后期糖分的積累和芳香味的形成奠定基礎(chǔ)。2.4 色譜技術(shù) 在蛋白組學(xué)研究技術(shù)中，分離純化技術(shù)除電泳技術(shù)外，色譜技術(shù)(chromatography)又稱層析技術(shù)也是當(dāng)前物質(zhì)分離純化、分析鑒定的重要方法之一。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)方面常用的色譜技術(shù)是高效液相色譜(high performance liquid chro-matography，HPLC)。按照不同的分離模式，其可以分為一維(one-d

24、imensiona，l 1D)、二維(two-di-mensiona，l 2D)和多維(multidimensiona，l MD)。因具有分離效率高、檢測靈敏度高、分析速度快和應(yīng)用范圍廣等特點，高效液相色譜在生產(chǎn)實踐中得到了廣泛應(yīng)用。二維或多維液相色譜，是一種將分離機理不同而又相互獨立的兩支色譜柱串聯(lián)起來構(gòu)成的分離系統(tǒng)。待分析樣品經(jīng)過第一維的色譜柱進入接口中，通過濃縮、捕集或切割后被切換進入第二維色譜柱及檢測器。二維液相色譜通常采用兩種不同的分離機理分析樣品，即利用樣品的不同特性把復(fù)雜混合物（如肽）分成單一組分，這些特性包括分子尺寸、親水性、電荷、特殊分子間作用（親和）、等電點等。一維分離系統(tǒng)

25、中不能完全分離的組分，可能會在二維系統(tǒng)中得到更好的分離，分辨率、分離能力得到極大的提高。多維液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)機可以用來分離鑒定雙向凝膠電泳技術(shù)容易丟失的低豐度蛋白和膜蛋白32。2.5 質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)(mass spectrometry)是一種鑒定生物大分子的技術(shù)。近年來，質(zhì)譜技術(shù)得到迅速發(fā)展，其在蛋白質(zhì)組研究中主要用于蛋白質(zhì)的鑒定。質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展是近年來蛋白質(zhì)組學(xué)研究得到迅速發(fā)展和應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一33。質(zhì)譜技術(shù)的基本原理是：樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子的質(zhì)荷比(m/z)差異對離子進行分離并確定其分子質(zhì)量。由于單一地依靠蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量并不能對目的蛋白進行理想的鑒定，因此需要事先用蛋

26、白酶（如胰蛋白酶）將檢測樣品酶解成不同長度的肽段再進行分析。質(zhì)譜儀根據(jù)離子源的不同，質(zhì)譜可分為電噴霧離子化質(zhì)譜(electrospray ionization mass spec-trometry，ESI-MS)和基質(zhì)輔助的激光解吸質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry，MALDI-MS)，后者常與飛行時間(time of flight，TOF)質(zhì)譜聯(lián)用，稱為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)。質(zhì)譜技術(shù)中無需將蛋白純化，可同時鑒定多個蛋白質(zhì)，具有靈敏度高、易自動化、準(zhǔn)確度高的特點

27、，這點是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個重大突破。MALDI-TOF-MS與四極桿質(zhì)譜聯(lián)合，具有更高的準(zhǔn)確度、高分辨率和fmol級的敏感度，可用于鑒定蛋白質(zhì)修飾從而對闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行說明。同時將2個質(zhì)譜連接在一起構(gòu)成的串聯(lián)質(zhì)譜，可以更靈敏、更精確地分析蛋白樣品34, 35。2.6 蛋白質(zhì)芯片技術(shù) 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)SELDI(surface-enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry，SEL-DI-TOF-MS)作為新發(fā)展起來的蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)之一，為蛋白質(zhì)的檢測和研究提供了新的技術(shù)平臺36。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)主要

28、應(yīng)用于差異顯示蛋白質(zhì)組學(xué)和蛋白質(zhì)間相互作用的研究。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)就是將一系列“誘餌”蛋白（如抗體），以陣列的方式固定在經(jīng)過特殊處理的底板上，然后將其與待分析的樣品雜交，只有那些與“誘餌”結(jié)合的蛋白才被保留在芯片上。這種方法實質(zhì)上是大規(guī)?；拿嘎?lián)免疫吸附測定37。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，全稱是表面增強激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜，是將蛋白質(zhì)芯片與飛行質(zhì)譜相結(jié)合，使它既具備芯片的高通量、高效率的特點，又具備飛行質(zhì)譜的高靈敏度飛級（fg，1×10-15）水平檢測的功能38?？捎糜趯ρ寮敖M織粗樣品中的各種蛋白質(zhì)直接進行檢測，特別適于以往蛋白質(zhì)分析的盲區(qū)，即低分子質(zhì)量、低豐度和疏水的蛋白質(zhì)進行研究39

29、。因此，在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中蛋白質(zhì)芯片技術(shù)與目前常規(guī)方法比較具有顯著的優(yōu)勢。2.7 蛋白質(zhì)信息學(xué)蛋白質(zhì)信息學(xué)(Protein Bioinformatics)在蛋白質(zhì)組的分析中起重要作用，一是通過與數(shù)據(jù)庫中的已知蛋白質(zhì)相比較來判斷未知蛋白質(zhì)的功能；二是預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，并判斷蛋白質(zhì)是否發(fā)生修飾40, 41。蛋白質(zhì)鑒定的方法主要是利用蛋白質(zhì)的各種屬性參數(shù)進行，如：相對等電點、分子質(zhì)量、氨基酸組成、序列等信息在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中檢索，尋找與這些參數(shù)相符的蛋白質(zhì)。如果在數(shù)據(jù)庫中找不到，則有可能是發(fā)現(xiàn)了新蛋白，此時可進行新蛋白的鑒定。近年來，一些處理數(shù)據(jù)的先進算法和軟件相繼出現(xiàn)，并且還存在著許多開放性資源和

30、商業(yè)化的數(shù)據(jù)庫平臺42，使得蛋白質(zhì)的鑒定更快捷、更方便，而且隨著基因組學(xué)的深入研究，及基因測序工程的范圍擴大，從而能為蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供更全面的數(shù)據(jù)庫43。3 蛋白質(zhì)組學(xué)在水果品質(zhì)控制方面的應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)作為一項新興的科技能力將其應(yīng)用到食品領(lǐng)域，對食品的成分、營養(yǎng)、生物性能等，或是對食品的品質(zhì)進行評估并采取有效的控制措施，為食品科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展注入了新能量。當(dāng)前，人們已經(jīng)將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)逐漸應(yīng)用與食品品質(zhì)分析及控制，功能性研究，真?zhèn)舞b別和安全性檢測等方面44-46。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)在水果品質(zhì)控制方面的應(yīng)用取得了很大的進展。通常評判果實采收成熟度的依據(jù)主要有：果色、硬度和可溶性固形物等，但

31、這些指標(biāo)容易受品種、生長條件和季節(jié)的影響，因此尋找不受外界環(huán)境因素影響的指標(biāo)用其判斷果實的成熟度變得十分必要。這樣也為水果果實的保鮮貯藏提供工具。在果實成熟衰老的研究中將蛋白質(zhì)組學(xué)與上游的基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和下游的代謝組學(xué)、表型組學(xué)相結(jié)合，可以更加系統(tǒng)地闡述果實的生理代謝過程15。這樣可以為水果果實貯藏保鮮過程中提供有效的檢測工具并為選擇合適的保藏方法提供合理的方向。研究發(fā)現(xiàn)，在日本李、歐洲李、桃和油桃4種核果類果實的最佳采收期均有4個特異蛋白合成（Z1、Z2、Y和X），它們屬于一系列參與防御的抗原物質(zhì)，可以作為判斷桃、李和油桃果實最佳成熟度的一種新方法46。3.1 蛋白質(zhì)組學(xué)在水果果實生長發(fā)

32、育研究中的應(yīng)用果實在發(fā)育的過程中，蛋白質(zhì)含量變化較快，并相較于成熟階段，發(fā)育階段的果實蛋白含量相對較高。Faurobert M等47在研究番茄發(fā)育和成熟過程中的蛋白質(zhì)組變化中，發(fā)現(xiàn)7種蛋白參與果實發(fā)育，分別為碳水化合物代謝相關(guān)蛋白，氨基酸代謝相關(guān)蛋白，蛋白質(zhì)命運相關(guān)蛋白，光合作用、呼吸作用相關(guān)蛋白，信號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白，脅迫反應(yīng)相關(guān)蛋白，次生代謝相關(guān)蛋白。果實在發(fā)育過程中，高表達的蛋白主要存在于細胞質(zhì)和葉綠體中，參與光合作用，糖、蛋白質(zhì)代謝，細胞壁代謝等；在果實成熟過程中，高表達的蛋白主要是與脅迫反應(yīng)相關(guān)的蛋白。Giribaldi M等48研究了內(nèi)比奧羅葡萄成熟過程中果實蛋白質(zhì)組的動態(tài)變化，從花后

33、1個月到完全成熟，共得到了730個蛋白點，其中118個為差異蛋白點，93種蛋白成功得到鑒定，它們大多數(shù)與新陳代謝、能量、蛋白質(zhì)合成與降解相關(guān)。在轉(zhuǎn)色期前后，與果實表面蠟質(zhì)和萜類化合物合成相關(guān)的檸檬酸裂解酶、乙酰COA轉(zhuǎn)乙酰酶，與氨基酸代謝有關(guān)的甲硫氨酸合酶、谷氨酸脫氫酶等大量表達。在果實成熟過程中，糖酵解能力下降，細胞骨架進行了重新排列。果實發(fā)育成熟是果實生命周期的重要組成階段，這期間經(jīng)歷著一系列復(fù)雜的代謝變化，包括葉綠素、呼吸作用的改變、多糖的降解，芳香物質(zhì)、類胡蘿卜素和各類植物激素的合成等。近年來，大量的實驗證據(jù)表明，果實成熟是一系列與成熟相關(guān)基因時空表達以及相互作用的結(jié)果。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

34、在果實發(fā)育研究中的應(yīng)用，可以為更全面、系統(tǒng)地闡明果實發(fā)育機制而提供線索。3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)在水果果實采后研究中的應(yīng)用在蛋白質(zhì)組學(xué)的迅猛發(fā)展下，雙向電泳技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)及生物信息學(xué)為核心的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)逐漸參與到水果果實采后生理及病理學(xué)研究中。近年來，在水果果實采后生理病理學(xué)方面的蛋白質(zhì)組學(xué)研究成果頗為顯著。目前已經(jīng)應(yīng)用于番茄、桃、葡萄、柑橘、草莓、蘋果等果實成熟衰老的研究，在這方面的研究應(yīng)用主要集中在以下幾個方面：成熟過程不同品種、不同成熟度果實的蛋白表達比較；水果果實的抗病性研究；水果果實的冷害機理研究；采后處理對果實成熟調(diào)控機理的研究等。水果果實的發(fā)育成熟是一項重要的階段，而采收前后的成熟衰

35、老在食品科學(xué)研究的意義上則更為重要，這個階段設(shè)計到淀粉向糖的轉(zhuǎn)化，色素的合成，芳香物質(zhì)的積累，細胞壁的修飾，多酚類物質(zhì)及抗氧化系統(tǒng)的變化等49，這些過程在受到基因表達、生長發(fā)育階段和激素調(diào)控等因素的調(diào)控的同時也受到果實采后處理方法、貯藏條件和時間等的調(diào)節(jié)。國內(nèi)外的科研人員在基因表達、生理生化方面進行大量的研究，以滿足對果實成熟衰老的分子機理的研究需要。但在果實成熟衰老的過程中對蛋白質(zhì)表達的研究處于萌芽階段。有專家認為15將蛋白質(zhì)組學(xué)與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及代謝組學(xué)、表型組學(xué)相結(jié)合，對果實的成熟衰老的生理代謝研究的闡述能更加的系統(tǒng)清晰。利用蛋白質(zhì)組學(xué)對研究與成熟衰老相關(guān)的功能性蛋白或者基因變化，為

36、水果果實成熟衰老過程中各個生理生化過程分子機理的研究提供新的技術(shù)方法和證據(jù)。3.2.1 水果果實成熟衰老機制研究 Guarino等50對蘋果果實的蛋白質(zhì)進行了分離分析并得到了蛋白圖譜，得到303個清晰的蛋白點，44類蛋白由28個基因編碼，其中參與能量代謝和成熟脅迫與防御的蛋白（病程相關(guān)蛋白）的最多，能量代謝包括磷酸戊糖途徑、糖酵解途徑、發(fā)酵作用和呼吸作用等。Faurobert等47利用熒光差異凝膠雙向電泳(DIGE)技術(shù)對櫻桃番茄成熟過程中的蛋白差異表達進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)未成熟的番茄果實中：蛋白合成和氨基酸代謝的蛋白在細胞分裂階段表達較多，隨后表達量逐漸降低；在細胞膨脹階段，參與光合作用和細

37、胞壁形成的蛋白表達逐漸增加。成熟果實中，碳水化合物代謝和抵抗脅迫的蛋白表達較多，這些蛋白變化貫穿著番茄果實成熟的全過程。水果果皮在一定程度上可以保護果實免受物理損傷和微生物侵染。Negri等51研究了葡萄成熟過程中果皮蛋白質(zhì)的變化，通過LC-ESI-MS/MS鑒定出69個差異蛋白，這些蛋白分別參與了糖代謝、脅迫反應(yīng)、氨基酸代謝等。研究發(fā)現(xiàn)參與基礎(chǔ)代謝成熟的相關(guān)蛋白在果皮中被誘導(dǎo)表達而與前人以全果肉作為實驗材料研究出現(xiàn)下調(diào)表達結(jié)果不同。其實，Pig-nataro等52在實驗中利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法(2DE，LC-ESI-MS/MS和ESTs數(shù)據(jù)庫)鑒定出檸檬果實外皮含有大量的微生物糖類蛋白Cit

38、s1異構(gòu)體，它的分子量在20120 kDa之間。3.2.2水果采后處理對果實成熟調(diào)控機制研究 對采后水果應(yīng)用適當(dāng)?shù)奶幚?，不僅可以延長果實的貯藏時間，保證水果的品質(zhì)，而且也是保證市場季節(jié)性調(diào)控的有效措施。然而由于采后處理對果實成熟過程的調(diào)控機理仍不十分清楚，使得采后處理所采用的方法嚴重受限，也沒有可觀的發(fā)展前景。采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來研究分析果實采后處理中果實成熟衰老的調(diào)控機制，希望可以得到明了的機理并為水果果實保鮮技術(shù)提供理論支持53。Wang等54研究草酸對棗的脅迫反應(yīng)，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究結(jié)果表明，適量草酸作用能抑制乙醇脫氫酶的表達及其活性，降低乙醇的含量；對乙烯的產(chǎn)生起到抑制作用，提高胱

39、硫醚合酶的表達；同時能引發(fā)抗性蛋白的表達，抑制果實顏色變紅，延緩棗的衰老過程，并提高棗果實對青霉菌侵襲的抵抗力。Zhang等55對桃果實進行熱處理實驗，將桃果實在48熱水中浸泡10 min后貯藏于室溫條件下，經(jīng)過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，熱處理組和對照組共有30個蛋白達到2倍差異表達，這些蛋白主要參與了脅迫反應(yīng)和防御、細胞結(jié)構(gòu)、蛋白代謝、能量和代謝、成熟衰老，還有大概17%為功能未知。其中熱處理誘導(dǎo)了兩個分子量分別為17.7 kDa和17.4 kDa的小分子熱激蛋白(mHSP)和18.4 kDa的應(yīng)激蛋白，同時參與抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)的兩個重要酶類抗壞血酸過氧化物酶和雙脫氫抗壞血酸還原酶的表達，降

40、低活性氧的含量，對糖酵解過程的酶類和成熟相關(guān)蛋白的表達有一定的抑制作用，從蛋白水平方面解釋了熱處理對果實衰老、維持果實品質(zhì)的生化機理有延緩作用。4 蛋白質(zhì)組學(xué)在食品加工檢測方面的應(yīng)用前景盡管蛋白質(zhì)組學(xué)誕生的時間較短，于二十世紀九十年代中期問世。但其發(fā)展速度迅速，目前已經(jīng)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)等各領(lǐng)域得到應(yīng)用。作為一門新興的學(xué)科，蛋白質(zhì)組學(xué)在蛋白質(zhì)水平上對蛋白質(zhì)作用模式、功能機理、調(diào)節(jié)控制以及蛋白質(zhì)群體內(nèi)相互作用進行探索，為食品成分的功能、安全性及食品營養(yǎng)組分的研究提供了理論和基礎(chǔ)，并極大的拓展了食品科學(xué)的研究領(lǐng)域，同時促進了食品科學(xué)快速的反戰(zhàn)，逐漸成為食品品質(zhì)控制研究的一個高準(zhǔn)確性、高靈敏度

41、、高通量的研究平臺。面對目前不斷出現(xiàn)的各種食品營養(yǎng)及質(zhì)量安全問題，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為解決食品安全問題的提供了新的思路和方法。通過對食品中蛋白質(zhì)的檢測和分析可以確定食品中是否摻假，還可以得知摻假物的具體品種，甚至精確到可以得知摻假物來自動植物體的具體部位，這使得食品質(zhì)量檢測在精準(zhǔn)度方面更進了一步。但是，現(xiàn)在蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)仍有很多不足之處，今后蛋白質(zhì)組檢測方法應(yīng)該向便捷靈敏方向發(fā)展：操作的半自動化甚至自動化，減少工作量，提高重復(fù)性，縮短時間等。我們可以充分利用色譜良好的分離能力與光譜的結(jié)構(gòu)鑒別能力以及雙向凝膠電泳技術(shù)高分辨率能力，并將其結(jié)合使用，并且對食品的功能成分、營養(yǎng)成分及食品鑒偽的研究會是未來

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