1、第九章免疫學活性測定Dot blot 原理：原理：抗原抗體和受體配體結合可以被利用作蛋白質簡單快速的定量 分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗體或者受體配體可以被標記的 抗體識別并進行定量記數形成定量分析方法的基礎。由于細胞培養需 要不斷監測，工作量很大。因此快速簡潔的定量分析是檢測細胞表達 水平監測的重要手段。主要監測方法包括Dot blot和ELISA。Dot blotDot blot是最快速簡捷的方法之一，簡述如下：在超凈臺內，使 用無菌多孔加樣器將96孔板內的細胞克隆培養液以5gL上樣量，成 排點于硝酸纖維素膜上并風干，記錄好樣品順序（可在膜的正面邊緣 處標記正面及名稱，也可通過在膜的右

2、下角剪去一角作為標記，識別 膜的正反面及方向）。取上面風干好的硝酸纖維素膜，用配制好的封 閉液（脫脂奶粉或白蛋白溶液）室溫震蕩孵育至少一小時。此步驟的 目的是封閉硝酸纖維素膜上的非特異性蛋白結合位點，以避免下一步加入的抗體與膜發生非特異性結合。將封閉好的硝酸纖維素膜浸泡在 第一抗體中，室溫震蕩孵育1小時，然后用TTBS溶液淋洗膜2遍后， 將膜浸泡到TTBS溶液中，室溫震蕩洗滌3次，每次5分鐘。將洗滌 后的硝酸纖維膜浸泡在含有酶標第二抗體溶液中，室溫震蕩孵育1小時，然后用TTBS溶液淋洗膜2遍后，將膜浸泡到TBST溶液中，室 溫震蕩洗滌3次，每次5分鐘。最后，將膜浸于熒光顯色劑（新鮮剛剛混合的等

3、量A和B液）。1-2分鐘后將浸泡過的膜，抖去多余顯色 劑，夾入保鮮膜（保鮮膜應薄而透明，以免阻擋曝光效果）中，同時 觀察顯色情況，確定大致曝光時間（一般情況下，如果樣品亮度肉眼 可見且較強，那么初次曝光時間應較短，一般選3-5秒；如果樣品亮度肉眼不可見，則初次曝光時間應略長一些，一般選擇1分鐘），曝光完畢，經顯影，定影后，用清水沖洗 X光膠片，根據膠片上結果 情況，再將膜放入曝光暗盒中進行二次曝光及顯影、定影反應。溶液 配制及整個操作過程請斑點雜交操作流程圖。Dot blot需要TTBS溶解的倍比稀釋后的標準品做對照方能進行半定量。 同時樣品倍比稀釋 也是半定量所必需。附1: Dot-Blot

4、操作流程圖以下均用微振搖床混和一、試劑1、抗待檢樣品抗體：第一抗體為純化鼠抗人IgG Fc 單抗； 第二抗體為HRP-兔抗小鼠IgG二抗。2、封閉液（5%脫脂奶粉）3、底物熒光顯色劑A、B4、TTBS（10 X ） 緩沖液：取三羥甲基氨基甲烷（Tris）60.5g, NaCl 45g ,吐溫-80 5.5ml ,加適量超純水溶解，用濃鹽酸（32ml）調PH7.5 ,補加超純水 至500ml。置于棕色瓶中，4 C保存，有效期6個月。用前10倍稀釋為1 X TTBS緩沖液。二、操作1、取硝酸纖維素膜1張，將標準品倍比稀釋、樣品、陰性對照、陽性對照點 在膜上，風干。2、將膜置于封閉液（5%脫脂奶粉溶

5、于超純水中）室溫封閉1小時（也可4 C 過夜封閉）。3、棄去封閉液后，加入含有待檢樣品第一抗體的TTBS緩沖液30mL （抗體稀 釋度為1 : 1000 ）,且其中含有1%的脫脂奶粉，室溫震蕩孵育1小時。4、將硝酸纖維素膜用TTBS緩沖液充分淋洗兩次，每次洗后都盡量棄去溶液。 然后再用TTBS緩沖液震蕩洗滌3次，每次5分鐘。5、棄去液體后，加入含有第二抗體的TTBS緩沖液30mL （抗體稀釋度為1 : 2000 ）,室溫震蕩孵育1小時。6、將硝酸纖維素膜用TTBS緩沖液充分淋洗兩次，每次洗后都盡量棄去溶液。 然后再用TTBS緩沖液震蕩洗滌3次，每次5分鐘。7、取出硝酸纖維素膜，略除去膜上多余溶

6、液后，加入適量的熒光顯色劑A、B （一般1/2張96孔板大小的膜加4mLA、B混合液，且A液：B液=1 : 1）。8、用保鮮膜將硝酸纖維素膜覆蓋，盡量平整，避免產生氣泡，并放在曝光夾 上，根據樣品及標準品的亮度，初步確定曝光時間（一般情況下，如果樣品亮度 肉眼可見且較強，那么初次曝光時間應較短，一般選 3-5秒；如果樣品亮度肉眼不可見，則初次曝光時間應略長一些，一般選擇1分鐘），然后取適 當大小的膠片覆蓋在薄膜上，關夾曝光。8、曝光后，取出膠片浸于顯影液中， 在紅光下觀察，直到膠片上的樣品點不再變化為止（1.5分鐘），取出膠片在水中涮洗一下（此步驟避免顯影液與定影液混合，降低定影液使用 效率）

7、，再放入定影液中，當膠片本底呈現藍色透明后，即可取出膠片進行流水沖洗， 洗凈后晾干即可。此實驗中的注意事項：（1）在整個操作過程中，手不能直接接觸硝酸纖維素膜，以免蛋白污染或造成蛋白降解；（2）脫脂奶粉封避一定要充分，否則容易造成膜與蛋白的非特異性結合，導致結果片中出 現雜點或假陽性，干擾試驗結果。（3）一抗濃度與二抗濃度不宜過高，否則容易造成高背景或者雜點。適宜濃度的選擇，可 以通過不同濃度組合的預試驗進行確定。（4） 暗室一定要確保其不漏光，否則容易造成X光片跑光，整個光片全黑的情況。（5）曝光時，時間的確定應該具體情況具體分析，需要一定的實踐經驗積累。ELISA1、雙抗體夾心法：本法適用

8、于樣品含量低靈敏度要求高的定量分析， 簡述如下。先用選定的第一抗體（單抗原結合點的單抗為首選）在堿 性條件下（一般PH=8.08.5碳酸鹽緩沖液）包裹96孑板，置4C過 夜或者室溫1小時。然后用排槍或真空吸管吸出一抗，再用 BSA或 稀釋的奶粉封閉45至60分鐘。封閉后用洗滌液洗板2次。加入待測 抗原樣品（條件培養液）和標準品（PBS稀釋）。用洗滌液洗板2次。 加入標記好的相應抗體室溫1小時。用洗滌液洗板2次。如果不是標 記的抗體，可再用標記的抗一抗抗體（二抗）重復以上步驟再加入底物 液顯色和上機讀數。2、間接法：適用于靈敏度要求低，樣品含量高的分析方法，步驟如 下。將制備好的標準品及樣品，加

9、至 96孔酶標板，置4C過夜，或室 溫放置3小時。用洗滌液PBS-T配制的1%BSA溶液加至板內，37C 放置1小時。將封閉好的酶標板用洗滌液洗板 2次。將一抗加至板內， 同時加入兩孔空白對照（稀釋液），37 C放置1小時。用稀釋液稀釋 HRP酶標記的第二抗體加至板內，37C放置1小時。用洗滌液洗板2 次。加入底物液顯色和上機讀數。注：終止液可加可不加。3、結合競爭法：放射免疫法是典型的競爭法。它利用同位素標記抗原（I-125）與非標記抗原競爭結合抗體。非標記抗原或者樣品中的 抗原越多標記的抗原（I-125）與抗體結合的越少。一定濃度的 PEG 可以沉淀抗體結合的標記的抗原（即抗原-抗體復合物

10、），但不可以 沉淀游離的抗體或抗原（即非結合的抗原或者抗體）。沉淀的抗原 - 抗體復合物離心后吸出上清中的非結合的抗原或者抗體可以經過放 射性計數定量。標準品或樣品中的待測抗原越少計數越高。根據這個道理可以畫出標準曲線和查出相應標準品中的抗原含量。此法靈敏度高于其它方法，可達到10-100pg/ml水平，適用于血漿和組織藥物濃 度的動力學研究（藥物PK study）。4、新方法的建立原則1）以上所有方法的建立主要取決于抗體質量的好壞，因此多試幾個商品化的抗體有必要。2)般情況下，先決定所測樣本中抗原量的最低和最高限度,即測定范圍。原則上要求抗原和抗體的濃度等量，比如新方法要求檢測抗原濃度在11

11、0mg/L范圍內，靈敏度要求是1mg/ml，最高濃度 10 mg/ml，高于10 mg/ml使用樣品倍比稀釋的方法來解決。此時， 檢測抗原濃度在1mg/L,假設需要100%抗原抗體結合的有效抗體稀 釋度為1: 8000,又假設需要100%抗原抗體結合的有效抗體稀釋度 為1: 4000。因此決定此法有效抗體稀釋度在 1: 8000到1: 4000 之間。我們的結論是一般情況下抗原的濃度降低則抗體的相對濃度也 降低。如果想提高方法的抗原探測靈敏度，一般使用相對低濃度的抗體。如果想降低方法的抗原探測靈敏度，一般使用相對高濃度的抗體。3） 分析方法的變異范圍（代表可靠程度）一般用CV （Coeffic

12、ient variant）來計算。CV=SD （標準差）/X（平均值）X100%。一般批內（intra-assa的CV要小于批間（inter-assay）的CV。例如N 個（N至少要大于6）同一代測標本在一次方法分析中相差會很小，即CV很小（CV=5-10%可以接受）。又如N個同一代測標本在多次 方法分析中相差會很大，即 CV很大（CV=10-30%可以接受）。批內 和批間變異是最常用的定量分析控制方法。一般低溫（-30 C或以上） 長期貯存的質量控制用標準品在每次方法分析中都要使用， 這就是常 用的定量分析方法的質量控制。附：單克隆抗體制備原理單克隆抗體的制備過程包括經典的細胞克隆化步驟理解

13、單克隆抗體的制備不但有助于理解細胞克隆化的方法，還有助于理解分析方 法中抗體的選用。簡單地說，將一定濃度的抗原免疫小鼠，取小鼠脾臟，無菌磨碎， 取懸浮的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞在體外在一定濃度PEG的作用下（PEG可將2個或多個細胞融合在一起）融合形成雜交瘤細胞。經過 HAT培養液在96孔細胞培養板中篩選，死亡者為未融合的小鼠骨髓 瘤細胞（HAT培養液可殺死小鼠骨髓瘤細胞）和不能傳代生長的小 鼠脾臟細胞（高度分化細胞不能傳代生長）。幸存者（即可在HAT培養液中生長的細胞）為融合的雜交瘤細胞。雜交瘤細胞具有小鼠脾 臟細胞和小鼠骨髓瘤細胞共同的特性，因此可以在HAT培養液中傳代生長。使用簡單的抗體抗原結合的方法可以測定 96孔板中每孔中雜交 瘤細胞的抗體分泌量。選出分泌量最高的雜交瘤進行細胞擴增， 再克 隆，鑒定抗體的類型和親和力，IgG為首選。以上就是單克隆抗體制 備的簡單過程。附：多克隆抗體制備原理將一定濃度的抗原免疫大鼠或兔羊馬的起初產生的免疫球蛋白為IgA IgM,后期大量產生IgG, IgG可分為IgGi I