1、微生物限度檢查法微生物限度檢查法系檢查非規定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括細菌數、霉菌數、酵母菌數及控制菌檢查。微生物限度檢查應在環境潔凈度10000 級下的局部潔凈度100 級的單向流空氣區域內進行。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區域、工作臺面及環境應定期按醫藥工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法 的現行國家標準進行潔凈度驗證。供試品檢查時如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應證明其有效性及對微生物無毒性。除另有規定外，本檢查法中細菌及控制菌培養溫度為3035 ；霉菌、酵母菌培養溫

2、度為2328 。檢驗結果以1g 、lml 、10g 、l0ml 或10cm2 為單位報告，特殊品種可以最小包裝單位報告。檢驗量檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g 、ml 或cm2）。除另有規定外，一般供試品的檢驗量為10g 或10ml；膜劑為100 cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗量應增加20g 或20ml （其中10g或10ml 用于陽性對照試驗）。檢驗時,應從2 個以上最小包裝單位中抽取供試品，膜劑還不得少于4 片。一般應隨機抽取不少于檢驗用星（兩個以上最小包裝單位）的3 倍量供試品。供試液的制備根據供試品的理化特性與生物學特性，采取適宜的方法

3、制備供試液。供試液制備若需加溫時，應均勻加熱，且溫度不應超過45 。供試液從制備至加入檢驗用培養基，不得超過1 小時。除另有規定外，常用的供試液制備方法如下。1.液體供試品取供試品10ml ，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml ，混勻，作為l:10 的供試液。油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80 使供試品分散均勻。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。2.固體、半固體或黏稠性供試品取供試品10g ，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至1OOml ，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為1:10 的供試液。必要時加適量的無菌聚山梨酯80 ，并置水浴中適當加溫使供試品分散均勻。

4、3.需用特殊方法制備供試液的供試品（1）非水溶性供試品方法1   取供試品5g（或5ml ) ，加至含溶化的（溫度不超過45 ）5g司盤80 、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80 無菌混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團后，慢慢加人45 的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml ，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1 : 20 的供試液。方法2 取供試品10g ，加至含20ml 無菌十四烷酸異丙酯（制法見附錄XII A 無菌檢查法中供試品的無菌檢查項下）和無菌玻璃珠的適宜容器中必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然后加入45 的pH7.0無菌

5、氯化鈉-蛋白胨緩沖液10Oml ，振搖510 分鐘，萃取，靜置使油水明顯分層，取其水層作為l : 10 的供試液。（2）膜劑供試品取供試品100cm2，剪碎，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml （必要時可增加稀釋液），浸泡，振搖，作為1:10 的供試液。（3）腸溶及結腸溶制劑供試品取供試品10g ，加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或pH7.6 無菌磷酸鹽緩沖液（用于結腸溶制劑）至100ml ，置45 水浴中，振搖，使溶解，作為1 :10 的供試液。（4）氣霧劑、噴霧劑供試品取規定量供試品，置冰凍室冷凍約1 小時，取出，迅速消毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔，

6、放至室溫，并輕輕轉動容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器吸出全部藥液，加至適量的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（若含非水溶性成分，加適覺的無菌聚山梨酯80 ）中，混勻，取相當于10g或10ml 的供試品，再稀釋成1:10 的供試液。（5）貼劑供試品取規定量供試品，去掉貼劑的保護層，放置在無菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面，以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有表面活性劑（如聚山梨酯80 或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振蕩至少30 分鐘，制成供試液。貼劑也可采用其他適宜的方法制備成供試液。（6）具抑菌活性的供試品當供試品有抑菌活性時，

7、采用下列方法進行處理，以消除供試液的抑菌活性，再依法檢查。常用的方法如下。 培養基稀釋法   取規定量的供試液，至較大量的培養基中，使單位體積內的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測定細菌、霉菌及酵母菌的菌數時，取同稀釋級的供試液2ml ，每1ml供試液可等量分注多個平皿，傾注瓊脂培養基，混勻，凝固，培養，計數。每1ml供試液所注的平皿中生長的菌落數之和即為1ml的菌落數，計算每1ml供試液的平均菌落數，按平皿法計數規則報告菌數；控制菌檢查時，可加大增菌培養基的用量。 離心沉淀法   取一定量的供試液，500 轉分鐘離心3 分鐘，取全部上清液混合。用于細菌

8、檢查。 薄膜過濾法   見細菌、霉菌及酵母菌計數項下的“薄膜過濾法”。 中和法   凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品，可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養基中。細菌、霉菌及酵母菌計數計數培養基的適用性檢查細菌、霉菌及酵母菌計數用的培養基應進行培養基的適用性檢查，成品培養基、由脫水培養基或按處方配制的培養基均應檢查。菌種   試驗用菌株的傳代次數不得超過5 代（從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。大腸埃希菌（Esche

9、richia coliCMCC ( B ) 44l02金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） CMCC ( B ) 26003 枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis  ) CMCC ( B ) 63501 白色念珠菌（Candida albicans ） CMCC ( F ) 98001 黑曲霉（Aspergillus niger) CMCC ( F ) 98003 菌液制備  接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基上，培養18 24 小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改

10、良馬丁瓊脂培養基上，培養2448 小時。上述培養物用0 . 9 無菌氯化鈉溶液制成每lml 含菌數為50100CFU 的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，培養5 7 天，加人3 5ml 含0.05 % ( ml /ml ）聚山梨酯80 的0.9 無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05 % ( ml / ml ）聚山梨酯80 的0.9無菌氯化鈉溶液制成每lml 含孢子數50 100CFU 的孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應在2 小時內使用；若保存在28 ，可在24 小時內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2 8 ，在驗證過的

11、貯存期內使用。適用性檢查 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌各50100CFU ，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2 個平皿，混勻，凝固，置3035 培養48 小時，計數；取白色念珠菌、黑曲霉各50100CFU ，分別注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2 個平皿，混勻，凝固，置23 28 培養72 小時，計數；取白色念珠菌50 100CFU ，注入無菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基平行制備2 個平皿，混勻，凝固，置23 28 培養72 小時，計數。同時，用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗。結果判定

12、0; 若被檢培養基上的菌落平均數不小于對照培養基上的菌落平均數的70 % ，且菌落形態大小與對照培養基上的菌落一致，判該培養基的適用性檢查符合規定。計數方法的驗證當建立產品的微生物限度檢查法時，應進行細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該產品的細菌、霉菌及酵母菌數的測定。若產品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，計數方法應重新驗證。驗證時，按供試液的制備和細菌、霉菌及酵母菌計數所規定的方法及下列要求進行。對各試驗菌的回收率應逐一進行驗證。菌種及菌液制備  同計數培養鑒的適用性檢查。驗證方法 驗證試驗至少應進行3 次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每次

13、試驗的回收率。( l )試驗組   平皿法計數時，取試驗可能用的最低稀釋級供試液lml 和50 100CFU 試驗菌，分別注人平皿中，立即傾注瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2 個平皿，按平皿法測定其菌數。薄膜過濾法計數時，取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加人50100CFU 試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數。( 2 )菌液組   測定所加的試驗菌數。( 3 )供試品對照組   取規定量供試液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數。( 4 )稀釋劑對照組   若供試液制備需要分散

14、、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時，應增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗時，可用相應的稀釋液替代供試品，加入試驗菌，使最終菌濃度為每lml 供試液含50 100CFU ，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數方法測定其菌數。結果判斷  在3 次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌數回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率）應均不低于70 % 。若試驗組的菌數回收率（試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數的值占菌液組的平均菌落數的百分率）均不低于70，照該供試液制備方法和計數法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數；若任一次試驗中試驗

15、組的菌數回收率低于70 % ，應采用培養基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法（常見干擾物的中和劑或滅活方法見表1 ）等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。表l 常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物可選用的中和劑或滅活方法戊二醛亞硫酸氫鈉酚類、乙醇、吸附物稀釋法醛類稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽季銨類化合物（QACs ）、對羥基苯甲酸酯卵磷脂、聚山梨酯 汞類制劑亞硫酸氫鈉、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽雙胍類化合物卵磷脂碘酒、洗必泰類聚山梨酯鹵化物硫代硫酸鹽乙二胺四乙酸（EDTA )鎂或鈣離子磺胺類對氨基苯甲酸-內酰胺類抗生素-內酰胺酶 若沒有適宜的方法消除

16、供試品的抑菌活性，那么驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時表明該供試品不能被試驗菌污染。但是，供試品也可能僅對試驗用菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。因此，根據供試品須符合的微生物限度標準和菌數報告規則，在不影響檢驗結果判斷的前提下，應采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行方法驗證試驗。若驗證試驗符合要求，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢驗。計數方法驗證時，采用上述方法若還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求，那么選擇回收率最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢驗。驗證試驗也可與供試品的細菌、霉菌及酵母菌計數同時進行。供試品檢查

17、計數方法包括平皿法和薄膜過濾法。檢查時，按已驗證的計數方法進行供試品的細菌、霉菌及酵母菌菌數的測定。按計數方法的驗證試驗確認的程序進行供試液制備。用稀釋液稀釋成1 : 10 、1:l02 、l:103 等稀釋級的供試液。1 平皿法根據菌數報告規則取相應稀釋級的供試液lml ，置直徑90mm 的無菌平皿中，注人15 20ml 溫度不超過45 的溶化的營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基，混勻，凝固，倒置培養。每稀釋級每種培養基至少制備2 個平板。陰性對照試驗  取試驗用的稀釋液lml ，置無菌平皿中注入培養基，凝固，倒置培養。每種計數用的培養基各制備2 個平

18、板，均不得有菌生長。培養和計數 除另有規定外，細菌培養3 天，霉菌、酵母菌培養5 天，逐日觀察菌落生長情況，點計菌落數，必要時，可適當延長培養時間至7 天進行菌落計數并報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數。點計菌落數后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數，按菌數報告規則報告菌數。若同稀釋級兩個平板的菌落平均數不小于15 則兩個平板的菌落數不能相差l 倍或以上。一般營養瓊脂培養基用于細菌計數；玫瑰紅鈉瓊脂培養基用于霉菌及酵母菌計數；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基用于酵母菌計數。在特殊情況下若營養瓊脂培養基上長有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養基上長有細菌，則應分別點計霉菌和酵母菌、細菌菌落數。然后將營養

19、瓊脂培養基上的霉菌和酵母菌數或玫瑰紅鈉瓊脂培養基上的細菌數，與玫瑰紅鈉瓊脂培養基中的霉菌和酵母菌數或營養瓊脂培養基中的細菌數進行比較，以菌落數高的培養基中的菌數為計數結果。含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養基測定霉菌數，用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基測定酵母菌數，合并計數。菌數報告規則細菌、酵母菌宜選取平均菌落數小于300CFU 、霉菌宜選取平均菌落數小于100CFU 的稀釋級，作為菌數報告（取兩位有效數字）的依據。以最高的平均菌落數乘以稀釋倍數的值報告1g、lml 或10cm2供試品中所含的菌數。如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數小于1 時，以

20、1 乘以最低稀釋倍數的值報告菌數。2 薄膜過濾法采用薄膜過濾法，濾膜孔徑應不大于0.45m ，直徑一般為50mm ，若采用其他直徑的濾膜沖洗量應進行相應的調整。選擇濾膜材質時應保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應充分干燥。為發揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml 。總沖洗量不得超過1000ml.， 以避免濾膜上的微生物受損傷

21、。取相當于每張濾膜含lg 、lml或10cm2供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品每1g 、lml 或10 cm2所含的菌數較多時，可取適宜稀釋級的供試液lml 進行試驗。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同“計數方法的驗證”。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基平板上培養。每種培養基至少制備一張濾膜。陰性對照試驗取試驗用的稀釋液lml，照上述薄膜過濾法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。培養和計數  培養條件和計數方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數應不超過1

22、00CFU 。菌數報告規則 以相當于1g 、lml或10cm2 供試品的菌落數報告菌數；若濾膜上無菌落生長，以1 報告菌數（每張濾膜過濾1g、lml 或10cm2 供試品），或l 乘以稀釋倍數的值報告菌數。控制菌檢查控制菌檢查用培養基的適用性檢查控制菌檢查用的培養基應進行培養基的適用性檢查，成品培養基、由脫水培養基或按處方配制的培養基均應檢查。菌種 對試驗菌種的要求同計數培養基的適用性檢查。大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC ( B ) 44l02金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） CMCC ( B ) 26003 乙型副傷寒沙門菌（Salmone

23、lla paratyphi B ) CMCC ( B ) 50094 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ） CMCC ( B ) 10104 生孢梭菌（Clostridium sporogenes ) CMCC ( B ) 6494l 白色念珠菌（Candida albicans ） CMCC ( F ) 98001 菌液制備  接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基上，生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，培養18 24 小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬

24、丁瓊脂培養基上，培養24 48 小時。用0.9 無菌氯化鈉溶液制成每lml 含菌數為10 100CFU 的菌懸液。菌懸液在室溫下放置應在2 小時內使用若保存在28 可在24 小時內使用。適用性檢查  控制菌檢查用培養基的適用性檢查項目包括促生長能力、抑制能力及指示能力的檢查。各培養基的檢測項目及所用菌株見表2。表2 控制菌檢查用培養基的促生長能力、抑制能力及指示能力檢查控制菌檢查培養基特性試驗菌株大腸埃希菌膽鹽乳糖培養基促生長能力大腸埃希菌 抑制能力金黃色葡萄球菌4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養基促生長能力+指示能力大腸埃希菌曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養基促生長能力+指示

25、能力大腸埃希菌大腸菌群乳糖膽鹽發酵培養基促生長能力大腸埃希菌 抑制能力金黃色葡萄球菌乳糖發酵培養基促生長能力+指示能力大腸埃希菌曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養基促生長能力+指示能力大腸埃希菌沙門菌營養肉湯培養基促生長能力乙型副傷寒沙門菌四硫磺酸鈉亮綠培養基促生長能力乙型副傷寒沙門菌 抑制能力金黃色葡萄球菌膽鹽硫乳瓊脂培養基或沙門、志賀菌屬瓊脂培養基促生長能力+指示能力乙型副傷寒沙門菌曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養基促生長能力+指示能力乙型副傷寒沙門菌三糖鐵瓊脂培養基指示能力乙型副傷寒沙門菌銅綠假單胞菌膽鹽乳糖培養基促生長能力銅綠假單胞菌 抑制能力金黃色

26、葡萄球菌溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基促生長能力銅綠假單胞菌 抑制能力大腸埃希菌綠膿菌素測定用培養基促生長能力+指示能力銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌亞碲酸鹽肉湯培養基促生長能力金黃色葡萄球菌 抑制能力大腸埃希菌卵黃氯化鈉瓊脂培養基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養基促生長能力金黃色葡萄球菌 抑制能力大腸埃希菌梭菌梭菌增菌培養基促生長能力生孢梭菌哥倫比亞瓊脂培養基促生長能力生孢梭菌白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養基促生長能力白色念珠菌沙氏葡萄糖瓊脂培養基促生長能力+指示能力白色念珠菌念珠菌顯色培養基促生長能力+指示能力白色念珠菌 抑制能力大腸埃希菌1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培

27、養基促生長能力+指示能力白色念珠菌 液體培養基促生長能力檢查  分別接種不大于100CFU 的試驗菌（表2） 于被檢培養基和對照培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最短培養時間下培養。與對照培養基管比較，被檢培養基管試驗菌應生長良好。固體培養墓促生長能力檢查 取試驗菌各0.1ml （含菌數50100CFU ）分別涂布于被檢培養基和對照培養基平板上，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最短培養時間下培養。被檢培養基與對照培養基上生長的菌落大小、形態特征應一致。培養基抑制能力檢查  接種不少于100CFU 的試驗菌（表2 ）于被檢培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養

28、溫度及最長時間下培養，試驗菌應不得生長。固體培養基指示能力檢查 取試驗菌各0.1ml （含菌數不大于100CFU ) （表2 ）分別涂布于被檢培養基和對照培養基平板上，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及時間下培養。被檢培養基上試驗菌生長的菌落大小、形態特征、指示劑反應情況等應與對照培養基一致。液體培養基指示能力檢查  分別接種不大于100CFU 的試驗菌（表2 ）于被檢培養基和對照培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最短培養時間下培養。與對照培養基管比較，被檢培養基管試驗菌生長情況、指示劑反應等應與對照培養基一致。控制菌檢查方法的驗證當建立產品的微生物限度檢查法時，應進行控制菌檢

29、查方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該產品的控制菌檢查。若產品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，檢查方法應重新驗證。驗證時，依各品種項下微生物限度標準中規定檢查的控制菌選擇相應驗證的菌株，驗證大腸菌群檢查法時，采用大腸埃希菌作為驗證菌株。驗證試驗按供試液的制備和控制菌檢查法的規定及下列要求進行。菌種及菌液制備同控制菌檢查用培養基的適用性檢查。驗證方法 取規定量供試液及10 100CFU 試驗菌加入增菌培養基中，依相應控制菌檢查法進行檢查。當采用薄膜過濾法時取規定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入增菌培養荃或取出濾膜接人增菌培養基中。結果判斷 若上述試

30、驗檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查；若未檢出試驗菌，應采用培養基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進行。供試品檢查供試品的控制菌檢查應按已驗證的方法進行。陽性對照試驗  陽性對照試驗方法同供試品的控制菌檢查，對照菌的加菌量為1010OCFU 。陽性對照試驗應檢出相應的控制菌。陰性對照試驗 取稀釋液10ml 照相應控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應無菌生長，（1）大腸埃希菌（Escherichia coli ）   取供

31、試液10ml （相當于供試品lg 、lml 、10cm2 ) ，直接或處理后接種至適量（不少于100ml ）的膽鹽乳糖培養基中，培養18 24 小時，必要時可延長至48 小時。取上述培養物0.2ml ，接種至含5ml MUG 培養基的試管內，培養，于5 小時、24 小時在366nm 紫外光下觀察，同時用未接種的MUG 培養基作本底對照。若管內培養物呈現熒光，為MUG 陽性；不呈現熒光，為MUG 陰性。觀察后，沿培養管的管壁加人數滴靛基質試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質陽性；呈試劑本色，為靛基質陰性。本底對照應為MUG 陰性和靛基質陰性。如MUG 陽性、靛基質陽性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG

32、 陰性、靛基質陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG 陽性、靛基質陰性，或MUG 陰性、靛基質陽性，則應取膽鹽乳糖培養基的培養物劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養基的平板上，培養1824 小時。若平板上無菌落生長或生長的菌落與表3 所列的菌落形態特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長的菌落與表3 所列的菌落形態特征相符或疑似，應進行分離、純化、染色鏡檢和適宜的鑒定試驗，確認是否為大腸埃希菌。表3 大腸埃希菌菌落形態特征培養基菌落形態曙紅亞甲藍瓊脂紫黑色、淺紫色、藍紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，常有金屬光澤麥康凱瓊

33、脂鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤 （2）大腸菌群（Coliform ）   取含適量（不少于10ml ) 的乳糖膽鹽發酵培養基管3 支，分別加入1 :10 的供試液lml（含供試品0.1g或0.1ml）、1: 100 的供試液1ml（含供試品0.01g或0.01ml）、1:1000的供試液1 ml（含供試品0.001g或0.001ml），另取1 支乳糖膽鹽發酵培養基管加人稀釋液1ml作為陰性對照管。培養1824 小時。乳糖膽鹽發酵管若無菌生長或有菌生長但不產酸產氣，判該管未檢出大腸菌群；若產酸產氣，應將發酵管中的培養物分

34、別劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養墓的平板上，培養1824 小時。若平板上無菌落生長，或生長的菌落與表4 所列的菌落形態特征不符或為非革蘭氏陰性無芽抱桿菌，判該管未檢出大腸菌群；若平板上生長的菌落與表4 所列的菌落形態特征相符或疑似，且為革蘭氏陰性無芽抱桿菌，應進行確證試驗。表4 大腸菌群菌落形態特征培養基菌落形態曙紅亞甲藍瓊脂紫黑色、紫紅色、紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊表面光滑，濕潤麥康凱瓊脂鮮桃紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤 確證試驗  從上述分離平板上挑選4 5 個疑似菌落，分別接種于乳糖發酵管中，培養24 48

35、 小時。若產酸產氣，判該乳糖膽鹽發醉管檢出大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。根據大腸菌群的檢出管數，按表5 報告lg 或lml 供試品中的大腸菌群數。表5 可能的大腸菌群數各供試品量的檢出結果可能的大腸菌群數N （個g 或ml )0.1g或0.1ml0.01g或0.01ml0.01g或0.01ml> 103 102 < N < 10310 < N < 102< 10注：代表檢出大腸菌群；代表未檢出大腸菌群（3）沙門菌（salmonella ）   取供試品10g或10ml , 直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營養肉湯培

36、養基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，培養1824 小時。取上述培養物1ml ，接種于10 ml四硫磺酸鈉亮綠培養基中，培養18 24 小時后，分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍瓊脂）培養基的平板上，培養18 24 小時（必要時延長至40 48 小時）。若平板上無菌落生長或生長的菌落不同于表6 所列的特征，判供試品未檢出沙門菌。若平板上生長的菌落與表6 所列的菌落形態特征相符或疑似，用接種針挑選2 3 個菌落分別于三糖鐵瓊脂培養基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養18 24 小時，如斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層無黑色，判供試品未

37、檢出沙門菌。否則，應取三糖鐵瓊脂培養基斜面的培養物進行適宜的鑒定試驗，確認是否為沙門菌。表6沙門菌菌落形態特征培養基菌落形態膽鹽硫乳瓊脂無色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色沙門、志賀菌屬瓊脂無色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時帶黑褐色曙紅亞甲藍瓊脂無色至淺橙色透明或半透明，光滑濕潤的圓形菌落麥康凱瓊脂無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時為暗色（4）銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ）   取供試液10ml （相當于供試品1g 、lml 、10cm2 ) ，直接或處理后接種至適量（不少于100ml ）的膽鹽乳糖培養基中，培

38、養18 24 小時。取上述培養物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基的平板上，培養1824 小時。銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴散、表面濕潤，灰白色，周圍時有藍綠色素擴散。如平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態特征不符，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。如平板生長的菌落與上述菌落形態特征相符或疑似，應挑選2 3 個菌落，分別接種于營養瓊脂培養基斜面上，培養18 24 小時。取斜面培養物進行革蘭氏染色、鏡檢及氧化酶試驗。氧化酶試驗  取潔凈濾紙片置于平皿內，用無菌玻棒取斜面培養物涂于濾紙片上，滴加新配制的1二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30 秒內若培養物呈粉紅色并逐漸變為

39、紫紅色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。若斜面培養物為非革蘭氏陰性無芽抱桿菌或氧化酶試驗陰性，均判供試品未檢出銅綠假單胞菌。否則，應進行綠膿菌素試驗。綠膿菌素（Pyocyanin ）試驗  取斜面培養物接種于PDP 瓊脂培養基斜面上，培養24 小時，加三氯甲烷3 5ml至培養管中，攪碎培養基并充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，加人lmol / L 鹽酸試液約lml ，振搖后，靜置片刻，觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素試驗陽性，否則為陰性。同時用未接種的PDP 瓊脂培養基斜面同法作陰性對照，陰性對照試驗應呈陰性。若上述疑似菌為革蘭氏陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陽

40、性，判供試品槍出銅綠假單胞菌。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陰性，應繼續進行適宜的鑒定試驗，確認是否為銅綠假單胞菌。( 5 )金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）取供試液l0ml （相當于供試品1g、lml 、l0cm2 ) ，直接或處理后接種至適見（不少于100ml）的亞碲酸鈉（鉀）肉湯（或營養肉湯）培養基中，培養18 24 小時，必要時可延長至48 小時。取上述培養物，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養基的平板上，培養24 72 小時。若平板上無菌落生長或生長的菌落不同于表7 所列特征，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。表7

41、金黃色葡萄球菌菌落形態特征培養基菌落形態甘露醇氯化鈉瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環，菌落直徑0.7lmm卵黃氯化鈉瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有卵磷脂分解的乳濁圈，菌落直徑1 2mm 若平板上生長的菌落與表7 所列的菌落特征相符或疑似，應挑選2 3 個菌落，分別接種于營養瓊脂培養基斜面上，培養1824 小時。取營養瓊脂培養基的培養物進行革蘭氏染色并接種于營養肉湯培養基中，培養1824 小時，做血漿凝固酶試驗。血漿凝固酶試驗 取滅菌小試管3 支，各加入血漿和無菌水混合液（1 : 1 ) 0.5ml ，再分別加入可疑菌株的營養肉湯培養物（或由營養瓊脂培養基斜面培養物

42、制備的濃菌懸液）0.5ml 、金黃色葡萄球菌營養肉湯培養物（或由營養瓊脂培養基斜面培養物制備的濃菌懸液）0.5ml 、營養肉湯或0.9無菌氯化鈉溶液0.5ml , 即為試驗管、陽性對照管和陰性對照管。將3 管同時培養，3 小時后開始觀察直至24 小時。陰性對照管的血漿應流動自如，陽性對照管血漿應凝固，若試驗管血漿凝固為血漿凝固酶試驗陽性，否則為陰性。如陽性對照管或陰性對照管不符合規定時，應另制備血漿，重新試驗。若上述疑似菌為非革蘭氏陽性球菌、血漿凝固酶試驗陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。( 6 )梭菌（Clostridium ）   取供試液10ml （相當于供試品1g

43、 、lml 、10cm2 ) 2 份，其中l 份置80 保溫10 分鐘后迅速冷卻。上述2 份供試液直接或處理后分別接種至100ml 的梭菌增菌培養基中。置厭氧條件下培養48 小時。取上述每一培養物0.2ml ，分別涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養基平板上，置厭氧條件下培養4872 小時。若平板上無菌落生長，判供試品未檢出梭菌；若平板上有菌落生長，應挑選2 3 個菌落分別進行革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗。過氧化氫酶試驗 取七述平板上的菌落，置潔凈玻片上，滴加3 過氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產生，為過氧化氫酶試驗陽性，否則為陰性。若上述可疑菌落為革蘭氏陽性梭菌，有或無卵圓形或球形的芽孢，過氧

44、化氫酶試驗陰性，判供試品檢出梭菌，否則判供試品未檢出梭菌。( 7 )白色念珠菌（Candida albicans）  取供試液10ml （相當于供試品1g 、lml 、l0cm2）直接或處理后接種至適量（不少于10Oml）的沙氏葡萄糖液體培養基中，培養48 72 小時。取上述培養物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上，培養24 48 小時（必要時延長至72 小時）。白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的菌落呈乳白色，偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養時間稍久則菌落增大，顏色變深、質地變硬或有皺褶。若平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌。如

45、平板上生長的菌落與上述菌落形態特征相符或疑似，應挑選2 3 個菌落分別接種至念珠菌顯色培養基平板上 ，培養2448 小時（必要時延長至72 小時）。若平板上無綠色或翠綠色的菌落生長，判供試品未檢出白色念珠菌。若平板上生長的菌落為綠色或翠綠色挑取相符或疑似的菌落接種于1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養基上培養2448 小時。取培養物進行染色、鏡檢及芽管試驗。芽管試驗  挑取l聚山梨酯80-玉米瓊脂培養基上的培養物，接種于加有一滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤的平皿內，于35 37 培養1 3 小時，置顯微鏡下觀察孢子上有否長出短小芽管。若上述疑似菌為非革蘭氏陽性菌，顯微鏡下未見厚膜孢子

46、、假菌絲、芽管，判供試品未檢出白色念珠菌。結果判斷供試品檢出控制菌或其他致病菌時，按一次檢出結果為準，不再復試。供試品的細菌數、霉菌和酵母菌數其中任何一項不符合該品種項下的規定，應從同一批樣品中隨機抽樣，獨立復試兩次，以3 次結果的平均值報告菌數。若供試品的細菌數、霉菌和酵母菌數及控制菌三項檢驗結果均符合該品種項下的規定，判供試品符合規定；若其中任何一項不符合該品種項下的規定判供試品不符合規定。稀釋液稀釋液配制后，應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。1 .pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液照無菌檢查法（附錄XII A ）制備。2.pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液按緩沖液（二部附

47、錄XV D ）配制后，過濾，分裝，滅菌。如需要，可在上述稀釋液滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。3.0.9無菌氯化鈉溶液取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml ，過濾，分裝，滅菌。培養基及其制備方法培養基可按以下處方制備，也可使用按該處方生產的符合要求的脫水培養基。配制后，應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。1.營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基、硫乙醇酸鹽流體培養基、改良馬丁培養基及改良馬丁瓊脂培養基照無菌檢查法（附錄XII A ）制備。2.玫瑰紅鈉瓊脂培養基胨           

48、            5.0g玫瑰紅鈉                 0.0133g葡萄糖                   10.0g瓊脂&#

49、160;                    14.0g磷酸二氫鉀               1.0g水             

50、60;         1000ml 硫酸鎂                   0.5g除葡萄糖、玫瑰紅鈉外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過，加入葡萄糖、玫瑰紅鈉，分裝滅菌。3.酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基（YPD ) 胨        

51、0;           10.0g瓊脂                  14.0g酵母浸出粉            5.0g 水       &#

52、160;            1000ml 葡萄糖                20.0g除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，濾過，加人葡萄糖，分裝滅菌。4 膽鹽乳糖培養基(BL ) 胨            &#

53、160;         20.0g磷酸二氫鉀              1.3g 乳糖                    5.0g牛膽鹽     

54、;              2.0g氯化鈉                   5.0g（或去氧膽酸鈉）         ( 0.5g) 磷酸氫二鉀     

55、         4.0g水                      1000ml除乳糖、牛膽鹽或去氧膽酸鈉外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH 值使滅菌后為7.4 ±0.2 ，煮沸，濾清，加人乳糖、牛膽鹽或去氧膽酸鈉，分裝，滅菌。5.乳糖膽鹽發酵培養基胨   &

56、#160;                              20.0g0.04 溴甲酚紫指示液               25ml 乳糖  

57、;                              10.0g 水                    &#

58、160;             l000ml 牛膽鹽                              5.0g除0.04 溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH 值使滅菌后

59、為7.4 ±0.2 ，加人0.04 溴甲酚紫指示液，根據要求的用量分裝于含倒管的試管中。滅菌。所用倒管的規格應保證產氣結果的觀察。6曙紅亞甲藍瓊脂培養基（EMB )營養瓊脂培養基               100ml 曙紅鈉指示液                 2ml 20

60、乳糖溶液                5ml 亞甲藍指示液                 1.31.6ml 取營養瓊脂培養基，加熱溶化后，冷至60 ，按無菌操作加入滅菌的其他3 種溶液，搖勻，傾注平皿。7.麥康凱瓊脂培養基（ MacC）胨    

61、                         20.0g1 中性紅指示液              3ml 乳糖         

62、60;                 10.0g瓊脂                           14.0g牛膽鹽    

63、0;                    5.0g水                             l000ml氯化鈉

64、                         5.0g除乳糖、1 中性紅指示液、牛膽鹽及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH 值使滅菌后為7.2 ±0.2 ，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，分裝，滅菌，冷至約60 ，傾注平皿。8. 4 -甲基傘形酮葡糖昔酸（4-methylumbelliferyl-D-glucuionid

65、e，MUG）培養基胨                                10.0g磷酸二氫鉀（無水）               

66、;  0.9g硫酸錳                            0.5mg 磷酸氫二鈉（無水）                 6.2g硫酸鋅 &#

67、160;                          0.5mg 亞硫酸鈉                      

68、60;   40mg 硫酸鎂                            0.1g去氧膽酸鈉                 &#

69、160;      1.0g氯化鈉                            5.0gMUG              

70、0;               75mg 氯化鈣                            50mg 水      

71、                          l000ml 除MUG 外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH 值使滅菌后為7.3±0.1，加人MUG ，溶解，每管分裝5ml ，滅菌。9.三糖鐵瓊脂培養基（TSI ) 胨         

72、60;            20.0g牛肉浸出粉              5.0g乳糖                    10.0g蔗糖  &

73、#160;                 10.0g葡萄糖                  1.0g氯化鈉             &#

74、160;    5.0g 硫酸亞鐵                0.2g 硫代硫酸鈉              0.2g0.2 酚磺酞指示液        12.5ml瓊脂    

75、;                  12.0g水                        1000ml 除三種糖、0.2酚磺酞指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH 值

76、使滅菌后為7.3±0.1, 加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，分裝，滅菌，制成高底層（2 3cm ）短斜面。10 四硫磺酸鈉亮綠培養基（TTB）胨                      5.0g 硫代硫酸鈉              

77、30.0g牛膽鹽                  1.0g水                      l000ml 碳酸鈣        

78、;          10.0g取上述成分，混合，微溫溶解，滅菌。臨用前，取上述培養基，每10ml 加入碘試液0.2ml 和亮綠試液0.lml ，混勻。11.沙門、志賀菌屬瓊脂培養基（SS）胨                        5.0g硫代硫酸鈉  

79、;              8.5g牛肉浸出粉                5.0g 中性紅指示液              2.5ml 乳糖   

80、0;                  10.0g亮綠試液                  0.33ml 牛膽鹽            &

81、#160;       8.5g瓊脂                      16.0g枸櫞酸鈉                  8.5g水 &#

82、160;                      1000ml 枸櫞酸鐵銨                1.0g除乳糖、中性紅指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH 值使滅菌后為7.2±0.1,濾過，加入瓊脂，加

83、熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，滅菌，冷至60 ，傾注平皿。12 膽鹽硫乳瓊脂培養基（DHL ) 胨                          20.0g枸櫞酸鈉               

84、;     1.0g 牛肉浸出粉                  3.0g枸櫞酸鐵銨                  1.0g乳糖       &

85、#160;                10.0g中性紅指示液                3ml 蔗糖                

86、        10.0g瓊脂                        16.0g去氧膽酸鈉                 

87、; 1.0g水                           l000ml 硫代硫酸鈉                   2.3g除糖、指示液及瓊脂外，

88、取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH 值使滅菌后為7.2±0.1,加入瓊脂，加熱溶化后，再加人其余成分，搖勻，冷至60 ，傾注平皿。13.溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基胨                             10.0g溴化十六烷基三甲銨    

89、0;        0.3g牛肉浸出粉                     3.0g瓊脂                    

90、;       14.0g氯化鈉                         5.0g水                

91、60;            l000ml 除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH 值使滅菌后為7.5±0.1 ，加入瓊脂，加熱溶化后，分裝，滅菌，冷至60 ，傾注平皿。14 亞碲酸鹽肉湯培養基臨用前，取滅菌的營養肉湯培養基，每100ml 中加人新配制的1 亞諦酸鈉（鉀）試液0.2ml ，混勻，即得。15 卵黃氯化鈉瓊脂培養基胨            

92、;               6.0g10 氯化鈉卵黃液           100ml 牛肉浸出粉                   1.8g瓊脂  &#

93、160;                      14.0g氯化鈉                       30.0g水