1、1 主講：鄭萍主講：鄭萍 高級工程師，高級工程師， 執業藥師執業藥師化學化工學院化學化工學院2 液相色譜分析是在經典的液體柱色液相色譜分析是在經典的液體柱色譜基礎上，引入了氣相色譜的理論；在譜基礎上，引入了氣相色譜的理論；在技術上采用了技術上采用了高壓泵、高效固定相和高高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，實現了分析速度快、分靈敏度檢測器，實現了分析速度快、分離效率高和操作自動化，這種柱色譜技離效率高和操作自動化，這種柱色譜技術被稱做高效液相色譜法。術被稱做高效液相色譜法。3慢慢中等中等快快Temporal course淋洗液淋洗液4 葉綠素的柱色譜葉綠素的柱色譜5三組分混合物的分離三組分混合物

2、的分離6在在C18C18柱中，三組分混合物流出色譜柱中，三組分混合物流出色譜柱的順序為：萘，聯二苯、蒽。柱的順序為：萘，聯二苯、蒽。 當試樣混合物進入色譜柱后，就在固定相和流當試樣混合物進入色譜柱后，就在固定相和流動相之間不斷地進行分配平衡。不同的化合物，分動相之間不斷地進行分配平衡。不同的化合物，分子結構不同，存在理化性質的差異，所以在兩相中子結構不同，存在理化性質的差異，所以在兩相中存在的濃度也各不相同。固定相中存在量多的化合存在的濃度也各不相同。固定相中存在量多的化合物，沖洗出柱子的時間就長，反之則短。這與分配物，沖洗出柱子的時間就長，反之則短。這與分配系數有關：系數有關： K K =

3、= 化合物在固定相中的濃度化合物在固定相中的濃度C C固固 化合物在流動相中的濃度化合物在流動相中的濃度C C流流 K K值小，先流出柱子，值小，先流出柱子，K K值大的，保留作用強，后值大的，保留作用強，后流出柱子。流出柱子。78 鍵合相鍵合相-反相色譜反相色譜91. 概 述色譜法：色譜法：(chromatography)(chromatography)： 以試樣組分在固定相和流動相間的溶解、以試樣組分在固定相和流動相間的溶解、吸附、分配、離子交換或其他親和作用的差吸附、分配、離子交換或其他親和作用的差異為依據而建立起來的各種分離分析方法稱異為依據而建立起來的各種分離分析方法稱色譜法。色譜法

4、。幾個概念幾個概念色譜柱：進行色譜分離用的細長管。色譜柱：進行色譜分離用的細長管。固定相：管內保持固定相：管內保持固定、起分離固定、起分離作用的填充物。作用的填充物。流動相：流經固定相的空隙或表面的沖洗劑。流動相：流經固定相的空隙或表面的沖洗劑。101-4 1-4 高效液相色譜法的特點高效液相色譜法的特點一一 高壓高壓 液相色譜以液體作為流動相（液相色譜以液體作為流動相（稱為載液稱為載液），），液體流經色譜柱時，受到的阻力較大，為了能液體流經色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。在迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。在現代液體色譜中供液壓力和進樣壓力都很高，現

5、代液體色譜中供液壓力和進樣壓力都很高，一般可達到一般可達到150300kgcm2，甚至可達，甚至可達700kcm2以上。以上。11二二 高速高速 高效液相色譜所需的分析時間較之經高效液相色譜所需的分析時間較之經典液體色譜快得多，一般可達典液體色譜快得多，一般可達l10mLmin， 個別可高達個別可高達100mLmin以上，這以上，這已近似于氣相色譜的流速。已近似于氣相色譜的流速。 三三 高效高效 氣相色譜的分離效能很高，高效液相氣相色譜的分離效能很高，高效液相色譜的柱效則更高，一般約可達色譜的柱效則更高，一般約可達 60000理理論塔板米論塔板米；12四四 高靈敏度高靈敏度 紫外檢測器的最紫外

6、檢測器的最小檢小檢測量可達測量可達毫微克毫微克數量級數量級(10-9 g)；熒光檢測器的靈敏度可達；熒光檢測器的靈敏度可達10-11g。高效液相色譜的高靈敏度還表現在。高效液相色譜的高靈敏度還表現在所需試樣很少；微升數量級的樣品就足以所需試樣很少；微升數量級的樣品就足以進行全分析。進行全分析。 131-5 1-5 高效液相色譜流程和設備高效液相色譜流程和設備 高效液相色譜儀一般可分為高效液相色譜儀一般可分為5 5個主要部分：個主要部分：高壓輸液系統，進樣系統，分離系統和檢測系高壓輸液系統，進樣系統，分離系統和檢測系統。統。此外還配有此外還配有輔助裝置輔助裝置：如梯度淋洗，自動：如梯度淋洗，自動

7、進樣及進樣及數據處理數據處理等。其工作過程如下：等。其工作過程如下： 首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經過進首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當注入欲分離的樣品時，流經進樣器貯液器的當注入欲分離的樣品時，流經進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。 1415樣品吸收度測定吸收池示圖16紫外檢測器工作原理紫外檢測器

8、工作原理1718 廢廢液液樣樣品品 淋洗液淋洗液 至分離柱至分離柱進樣閥進樣閥 樣樣品品 廢廢液液 淋洗液淋洗液至分離柱至分離柱 定量定量（）（）（）（） 樣樣品品環環19液相色譜動畫演示液相色譜動畫演示20二、色譜圖二、色譜圖 試樣中各組分經色譜柱分離后，按先后次序試樣中各組分經色譜柱分離后，按先后次序經過檢測器時，檢測器就將流動相中各組分濃度經過檢測器時，檢測器就將流動相中各組分濃度變化轉變為相應的電信號，由記錄儀所記錄下的變化轉變為相應的電信號，由記錄儀所記錄下的信號信號時間曲線或信號時間曲線或信號流動相體積曲線，流動相體積曲線，稱為色譜流出曲線，或色譜圖。如圖稱為色譜流出曲線，或色譜圖

9、。如圖12-212-2常用術語：常用術語：1. 1. 基線基線 : : 在操作條件下，僅有在操作條件下，僅有純流動相純流動相進入進入檢測器時的流出曲線。檢測器時的流出曲線。212. 2. 色譜峰色譜峰: : 當組分隨流動相進入檢測當組分隨流動相進入檢測器時，其響應信號大小隨時間變化所形器時，其響應信號大小隨時間變化所形成的峰形曲線。正常的色譜峰呈正態分成的峰形曲線。正常的色譜峰呈正態分布布。. .峰高與峰面積峰高與峰面積峰高：色譜峰頂點與峰底之間的垂直距峰高：色譜峰頂點與峰底之間的垂直距離稱為峰高離稱為峰高(peak height)(peak height)。用。用h h表示。表示。峰面積：峰

10、與峰底之間的面積稱為峰面峰面積：峰與峰底之間的面積稱為峰面積積(peak area)(peak area)，用，用A A表示。表示。2221 保保 留留 值值 一、保留時間（一、保留時間（tR） 從進樣開始到柱后出現樣品的濃度極大從進樣開始到柱后出現樣品的濃度極大值所需的時間為保留時間，用值所需的時間為保留時間，用tR表示。表示。232-2 2-2 色譜柱的分離效率及柱效能的評價色譜柱的分離效率及柱效能的評價 一、塔板理論一、塔板理論 塔板理論認為，一根柱子可以分為塔板理論認為，一根柱子可以分為n段，段，在每段內組分在兩相間很快達到平衡，把每在每段內組分在兩相間很快達到平衡，把每一段稱為一塊理

11、論塔板。設柱長為一段稱為一塊理論塔板。設柱長為L，理論塔，理論塔板高度為板高度為H，則，則 H=L/n式中式中n為理論塔板數。為理論塔板數。24 色譜柱的分離效率（簡稱柱效），色譜柱的分離效率（簡稱柱效），可定量地用理論塔板數可定量地用理論塔板數N來表示。來表示。 理論塔板數一理論塔板數一N還與柱長有關，當還與柱長有關，當比較兩不同長度的色譜柱的柱效時，比較兩不同長度的色譜柱的柱效時，應當比較它們在相同柱長下的應當比較它們在相同柱長下的V值。值。25 可用半峰高處的峰寬可用半峰高處的峰寬(半峰寬）和保留時間半峰寬）和保留時間的關系來表示理論塔板數的關系來表示理論塔板數N，這時關系式為：，這時關

12、系式為： N554 ( tR / Wt1/2 ) 2 2式中式中： Wt1/2 -半峰寬半峰寬例如，從圖例如，從圖2-3，測得，測得tR=105mm、 Wt1/2 =4mm，求得求得N=3789，若此柱長為，若此柱長為250mm,折成每米的理論折成每米的理論塔板數約為塔板數約為15200. 262-3 分離度及影響因素分離度及影響因素一一 分離度（分辨率分離度（分辨率) 研究色譜中有關分離問題時，首先就研究色譜中有關分離問題時，首先就是要能定量地確定相鄰兩峰的分離程度。是要能定量地確定相鄰兩峰的分離程度。 從圖從圖8-3可以看出，為了獲得較好的分可以看出，為了獲得較好的分離，就離，就必須使最大

13、峰值之間的距離增加，必須使最大峰值之間的距離增加，峰寬減小。峰寬減小。2728 一般用一般用Rs來定量表達相鄰兩峰的分離來定量表達相鄰兩峰的分離程度，所以程度，所以Rs是色譜中兩個組分分離好壞是色譜中兩個組分分離好壞程度的標志。要求程度的標志。要求RS1.5 tR1 tR2 Rs = 1/2(W1+W2) 式中式中 tR1、tR2 分別為兩組分的保留時間，分別為兩組分的保留時間， W1 、W2為色譜峰的峰底寬度為色譜峰的峰底寬度 . 295 5 高效液相色譜的定性和定量分析高效液相色譜的定性和定量分析 5-1 5-1 定性分析定性分析 在液相色譜中保留值定性的方法主要是用在液相色譜中保留值定性

14、的方法主要是用直接與已知標準物對照的方法。當未知峰的直接與已知標準物對照的方法。當未知峰的保留值（保留值（t Rt R或或V R V R ）與某一已知標準）與某一已知標準物完全相同時，則未知峰可能與此已知標準物完全相同時，則未知峰可能與此已知標準物是同一物質，特別是在改變色譜柱或改變物是同一物質，特別是在改變色譜柱或改變洗脫液的組成時，未知峰的保留值與已知標洗脫液的組成時，未知峰的保留值與已知標準物的保留值仍能完全相同，則可以基本上準物的保留值仍能完全相同，則可以基本上認定未知峰與標準物是同一物質。認定未知峰與標準物是同一物質。 305-2 5-2 定量分析定量分析 HPLC色譜定量的基本方法

15、有色譜定量的基本方法有內標內標法、外標法等。法、外標法等。 外標法外標法標準曲線法標準曲線法 是一種簡便、快速的是一種簡便、快速的絕對絕對定量方定量方法（歸一化法則是法（歸一化法則是相對相對定量方法）。定量方法）。首先用欲測組分的標準樣品繪制標首先用欲測組分的標準樣品繪制標準工作曲線準工作曲線。31具體作法是具體作法是： 用標準樣品配制成不同濃度的標用標準樣品配制成不同濃度的標準系列，在與欲測組分相同的色譜條準系列，在與欲測組分相同的色譜條件下，等體積準確量進樣，測量各峰件下，等體積準確量進樣，測量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對樣品濃度繪制標準工作曲線，此

16、標準樣品濃度繪制標準工作曲線，此標準工作曲線應是通過原點的直線。工作曲線應是通過原點的直線。若標若標準工作曲線不通過原點，說明測定方準工作曲線不通過原點，說明測定方法存在系統誤差。標準工作曲線的斜法存在系統誤差。標準工作曲線的斜率即為絕對校正因子。率即為絕對校正因子。32 目前已普及于幾乎所有重要的分析學科目前已普及于幾乎所有重要的分析學科領域和許多科研生產部門，高效液相色譜能領域和許多科研生產部門，高效液相色譜能較理想地分離和分析與生物醫學有關的大分較理想地分離和分析與生物醫學有關的大分子和離子型物質，易變質的天然產物，各種子和離子型物質，易變質的天然產物，各種高分子化合物和不穩定化合物。高分子化合物和不穩定化合物。 例如例如：蛋白質、核酸、氨基酸、多糖、顏蛋白質、核酸、氨基酸、多糖、顏料極性類脂肪化合物、藥物、染料、表面料極性類脂肪化合物、藥物、染料、表面活性劑、農藥、甾