1、第七屆云南省大中專學生課外學術科技作品競賽參賽作品灰霉菌胞外大分子毒素分離及其是否為糖蛋白的定性鑒定摘要：灰霉菌（Botrytis cinerea）能侵染1000多種植物，危害多種糧食和經濟作物，造成極大的經濟損失。灰霉菌產生的毒素可導致植物萎蔫、褪綠和組織壞死等病癥，而目前報道的灰霉菌毒素大多數為小分子物質，對灰霉菌分泌的大分子毒素了解不多。因此，分離純化灰霉菌分泌的大分子毒素，鑒定其性質對于認識灰霉菌致病的分子機制具有重要意義。本研究利用過濾、離心、透析和冷凍干燥等方法對灰霉菌培養液中的大分子物質進行了提取分離，并對其進行了植物毒性鑒定。用聚丙烯酰胺凝膠電泳法，對分離出來的大分子毒素進行了

2、純化，回收蛋白條帶，滲入植物葉片進行毒素鑒定，將有毒性的條帶進行二次聚丙烯酰胺凝膠電泳并用高碘酸-希夫試劑進行染色鑒定是否為糖蛋白的蛋白性質。結果表明，灰霉菌胞外的大分子毒素為糖蛋白。關鍵詞：灰霉菌；擬南芥；胞外毒素；糖蛋白Purification of High-Molecular Toxins from Culture of Botrytis cinerea and Their Glycoprotein Property IdentificationAbstract:Botrytis cinerea can infect more than 1000 species of plants.

3、And it harms a variety of food and economic crops, which could cause great economic loss. The toxic compounds produced by Botrytis cinerea can cause wilting, chlorosis and tissue necrosis etc, disease symptom in plants. Previous literature showed that a number of toxic metabolites have been isolated

4、 from Botrytis cinerea, but these toxins mostly are low molecule organic substances. The high-molecules toxins from Botrytis cinerea are poorly understood. The molecular mechanisms of pathogenicity by this fungal. In this study, the macromolecule compounds from culture of Botrytis cinerea were extra

5、cted and separated by using methods of filtration, centrifugal, freeze, dialysis and drying. The plant toxicity of these extracts was identified. Next, these toxinic compounds were purified using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). The glycoprotein banding were recollected, and were infiltrat

6、ed into plant leaves to check their toxicity. Next,protein toxins are polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) again and these protein toxins are glycoprotein or not were checked with periodic acid-Schif(PAS) regent. The results showed that the macromolecular toxins produced by Botrytis cinerea are

7、 kinds of glycoprotein.Key words :Botrytis cinerea,;Arabidopsis thaliana; extracellular toxin; glycoprotein灰霉菌又名灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）是灰霉病的病原物，屬于半知菌亞門，絲孢目，淡色孢科，葡萄孢屬是一種腐生型病原菌。近年來隨著保護地蔬菜種植面積的擴大，其發生危害有嚴重的趨勢，產量損失很大，特別是在生產田中或產后貯藏過程中蔓延速度快，灰霉病成為生產上一種世界性的主要病害1Williamson B. Tudzynski B. Tudzynski P. et al.

8、2007, Botrytis cinerea: the cause of grey mould disease. Molecular Plant Pathology 8:561580.。灰霉菌屬于壞死營養型病原菌，其侵染植物的方式存在兩種可能，或是先分解寄主的表面細胞壁，以便更為有利地進入寄主細胞內寄生；或是一開始就分泌毒素，將周圍的細胞殺死，然后以此作為生存的養分2Elad Y., Kohl J., Fokkema N.J. Control of infection and sporulation of Botrytis cinerea on bean and tomato by sapro

9、phytic yeasts. Phytopathology,1994,84(10):1193-1200。在植物病程中，植物病原菌產生的次生代謝產物統稱為植物毒素，其中起決定作用的有毒物質主要包括非蛋白質氨基酸、生物堿、蛋白質毒素、不含氮毒素和生氰糖苷類毒素等五類3楊紅玉,李湘,張一凡,李然.灰霉菌培養及其對擬南芥的侵染J.西南農業學報,2005,18(4): 431-434.。迄今已經分離出大約17種灰霉菌毒素，均為低分子量的有機化合物。我們的研究主要集中于灰霉菌分泌的大分子毒素，對其進行了分離和純化，并對其是否為糖蛋白的蛋白性質進行了鑒定，這項研究對于了解灰霉菌產生哪些植物毒素以及他們是如何

10、危害植物的具有一定意義。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 灰霉菌（Botrytis cinerea）：由中國著名大學植物生理實驗室提供；1.1.2 擬南芥（Arabidopsis thaliana）Columbia生態型種子：由美國Lehle seeds公司提供；1.2 儀器設備恒溫培養振蕩箱：TS-100B Shaker incubator（上海天星實驗儀器制造有限公司）、循環水式多用真空泵：SHB-（鄭州長城科工貿有限公司）離心機：LD4-2A（北京醫用離心機廠）、Eppendorf centrifuge 5415D高速冷凍離心機：Eppendorf centrifuge 5804 R

11、超凈工作臺：Air Tech（蘇凈集團安泰公司制造）磁力加熱攪拌器：90-2型恒溫磁力攪拌器電子天平：METTLER TOLEDO AL204（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）電熱恒溫水浴鍋：HH·S11-2、HH·S21-4（北京長安科學儀器廠）透析袋：壓平寬度（半周長）34mm，截留分子量14000，pH穩定范圍5-9，5米/卷（USA）電泳設備：蛋白電泳槽Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System，電泳儀Power/pAC 300（Bio-Rad微型凝膠電泳系統）冰箱（Haier）、超低溫冰箱368升立式（Czech Repub

12、lic JOUAN SA）濾膜濾器（milipore）：上海申越公司提供1.3 方法1.3.1 擬南芥培養 取適量的擬南芥種子于1.5ml的離心管中，加入1ml無菌水浸泡30分鐘，然后分別用1ml95%酒精和0.1%HgCl消毒5分鐘，無菌水洗滌5次。然后將消毒好的種子均勻散到滅過菌的MS培養基上，封口膜封口，標上日期，放到4度冰箱春化2天。將培養皿置于光照培養箱中（12h光照，22°C）培養直到長出2片真葉時將幼苗移栽到裝有滅菌腐殖土的小花盆中，花盆放在托盤中，托盤內盛有水，用保鮮膜覆蓋小花盆4天后揭開保鮮膜。溫度保持在22左右，光照時間為12h/d。1.3.2 灰霉菌的培養將灰霉

13、菌菌種接到馬鈴薯培養基中22，黑暗，倒置培養10天，將馬鈴薯培養基上生長的灰霉菌接種于裝有馬鈴薯培養液的三角瓶中，用棉塞封口置于180轉/分振蕩恒溫培養箱中培養5天，溫度保持在25-28。1.3.3 灰霉大分子毒素的提取將三角瓶中的培養液于4，5000r/min離心15分鐘，收集上清液，用布氏漏斗、真空水循環泵和定性濾紙（快、中、慢各一次）抽濾上清液，濾出液-80冷凍干燥，然后用無菌水溶解，溶解液在4滅菌水中透析2天，其中每8h換一次水，截留分子量大于14,000Da的大分子物質,透析袋里的即為大分子毒素。1.3.4 大分子毒素的濃縮由于透析袋中存留大量的水分，我們采用兩種方法去除：方法一：將

14、灰霉大分子毒素經濾膜濾器慮過后放到冷凍干燥儀冷凍干燥2天，得到濃縮的蛋白。方法二:用蔗糖包埋透析袋。1.3.5灰霉菌胞外大分子毒素的毒性鑒定我們采用針刺滲入法來進行胞外大分子毒素的毒素鑒定。首先選擇生長到4周齡并且長勢大致相同的健康的擬南芥植株兩株，每株5片葉片，用沾有75% 酒精的棉球輕輕擦拭擬南芥葉片，進行表面消毒，然后用解剖針在一株擬南芥的兩片大小大致相同的葉片上的相同位置各扎一個小孔，再用兩個量程為10微升的微量注射器分別吸取10微升的胞外大分子毒素粗提液和10微升的無菌蒸餾水（作為對照），分別滲入到剛才扎有孔的葉片中，分別做上標記，另一株擬南芥也是進行相同的處理，接種后的擬南芥用黑布

15、蓋住，黑暗培養一天后，轉到光照培養室培養，溫度控制在2224，光照時間12h/d，觀察并記錄照相。獨立重復3次實驗。1.3.6 灰霉菌胞外毒素蛋白的糖蛋白定性染色鑒定1.3.6.1 工作液配制（1）溶液A(丙烯酰胺儲存液)：稱30g丙烯酰胺和0.8g雙丙烯酰胺用超純水配成100ml,在通風櫥內操作；（2）溶液B（4×分離緩沖液）即5mol/LTris-HCl（PH=8.8）：18.2gTris溶于40ml蒸餾水中，用鹽酸調PH至8.8后加蒸餾水至100ml；(3)溶液C（4×堆積緩沖液）即5mol/LTris-HCl（PH=6.8）：6.0gTris溶于40ml蒸餾水中，用

16、鹽酸調PH至8.8后加蒸餾水至100ml；（4）10%過硫酸銨；（5）電泳緩沖液（PH=8.8）：3gTris和14.4g甘氨酸加蒸餾水至1L；（6）5×樣品緩沖液：5ml甘油，0.5ml 1%溴酚藍，3.1ml 1mol/L Tris-HCl(PH=6.8)加蒸餾水至10ml。1.3.6.2 制膠步驟4汪家政,范明.蛋白質技術手冊M.科學出版社,2000,8:111-122.清洗制膠板，烘干；組裝凝膠模具。分離膠：將A液3.3ml、B液2.5ml、蒸餾水4.2ml在50ml三角瓶中混合，加入10%過硫酸銨50µl、TEMED 5µl，輕輕攪拌；用1000

17、1;l槍將液體沿隔片緩慢加入模具內，無氣泡，距梳子齒約0.5cm；輕輕加入15mm水層，使凝膠表面平整；等待3060min（與小燒杯中的作對照），凝膠聚合，出現清晰界面，微微傾斜，檢測凝膠是否聚合，吸盡覆蓋在分離膠上的水。濃縮膠：將A液0.67ml、C液1.0ml、蒸餾水2.3ml在50ml三角瓶中混合。加入10%過硫酸銨30µl、TEMED 5µl，輕輕攪拌使其混合；用1000µl槍將濃縮膠加至分離膠上面，直至達玻璃板頂端；將梳子插入凝膠內，無氣泡；等待30min凝膠聚合；拔出梳子放入電泳槽內；將電泳緩沖液加入內、外電泳槽中，使凝膠的上、下端均浸泡在緩沖液中，接

18、好Bio-Rad微型凝膠系統電極。檢查：加樣孔無氣泡，凝膠底部無氣泡，保持電流暢通；加樣前用電泳緩沖液沖一下加樣孔，去污物。1.3.6.3 上樣取組分樣品20µl于Eppendorf管中，加入5µl 5×樣品緩沖液；水浴100加熱210min；離心1s，有大量碎片則延長離心時間；用微量注射器將樣品加入樣品孔中，無氣泡（蒸餾水、緩沖液沖洗注射器）；在最外側加樣孔中加入蛋白質分子量標準品；保持相同上樣量10µl。1.3.6.4 電泳將電極插頭與對應的電極相接，電流應流向陽極。電壓調至200V（保持恒壓）兩塊0.75mm膠，電流開始時100mA，結束時60mA

19、；（約5h）；關閉電源，從電極上拔掉電極插頭；從電泳槽中取出凝膠玻璃板；小心移動兩玻璃板之間的隔片，將隔片插入玻璃板一角。輕輕撬開，使凝膠在一板上。1.3.6.5 染色將其中一塊凝膠固定液（50%乙醇）中固定30min,蒸餾水漂洗5次，再放入0.1%偏重亞硫酸鈉+10mmol/L鹽酸溶液中漂洗2次，每次10min,放入希夫試劑中避光染色1h,再放入0.1%偏重亞硫酸鈉+10mmol/L鹽酸溶液中避光漂洗1h,最后用0.5%偏重亞硫酸鈉溶液漂洗3次，每次20min5張世雄,程立均.一種改進的糖蛋白染色鑒別方法的建立J.中國生物制品學雜志,2012,25(1):108-110. 另一塊凝膠置考馬斯

20、亮藍染液中浸搖24h，棄去染液后，將凝膠在超純水中漂洗數次；加入考馬斯亮藍脫色液（約50ml），震蕩脫色3d，期間更換數次脫色液，直到背景顏色脫凈為止。倒掉脫色液用超純水清洗，繼續搖蕩至條帶清楚為止。1.3.7 電泳凝膠上蛋白質的回收使用PAGE膠蛋白微量回收試劑盒，將凝膠上清晰的蛋白質條帶回收。產品組成：溶液A、溶液B、干粉、DTT（DL-Dithiothreitol，二硫蘇糖醇）。試劑配制：使用前將干粉和DTT完全溶解于溶液A中，使用完后4保存，每次使用時30加熱，混合好的溶液A用于實驗操作。操作方法：用手術刀片將膠塊中含有目的條帶部分切下，放入1.5ml的離心管中，用研磨杵將離心管中的膠

21、體研磨成細小的碎片，加入400µl的溶液A，在室溫條件下，脫色搖床上震蕩過夜（1618小時），期間取出，偶爾震蕩幾次。室溫12000rpm，離心15分鐘，轉移上清液到另外一個2ml的離心管中，加入2ml的4預冷的溶液B，混勻，4放置30分鐘。室溫12000rpm，離心15分鐘，去除上清，再將離心管放置在通風櫥中，待殘留的液體揮發干凈。選用緩沖液溶解沉淀的蛋白質，得到蛋白回收液。1.3.8 回收蛋白質的致病性檢驗蛋白質致病性檢測方法：先用 75% 酒精對擬南芥葉片表面消毒，后采用針刺滲入接種法，即用微量注射器沿針刺創面將蛋白質滲入擬南芥葉片，每片葉子滲入10µl，以等量無蛋白

22、質條帶的凝膠回收液滲入擬南芥葉片實驗作為對照，觀察擬南芥致病性。2 結果與分析2.1 灰霉菌胞外大分子物質粗提液的毒性鑒定我們采用針刺滲入法將灰霉菌胞外毒素粗提液滲入到擬南芥葉片內，在48小時后觀察植物葉片的病癥，結果如圖2.1。圖2.1 A為滲入無菌水的對照實驗，48h后擬南芥葉片無明顯變化；而圖B為滲入胞外大分子粗提液48h，可見沿滲入部位出現黃白色“枯斑”和輕微的卷曲。 圖2.1灰霉菌胞外大分子毒素粗提液對擬南芥葉片的影響A：為滲入無菌水；B：為滲入粗提液2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白條帶的糖蛋白定性鑒定預實驗希夫（Schiff）試劑能與醛基反應生成紅色不溶性復合物，若PAGE膠染色后蛋

23、白質的條帶若出現紫紅色或者粉紅色，則可以說明該蛋白質為糖蛋白；若不顯色，則說明不是糖蛋白。為了摸索用希夫試劑染色的濃度、時間以及蔗糖包埋對糖蛋白定性鑒定的影響，我們選擇了典型的糖蛋白辣根過氧化物酶，非糖蛋白但經過蔗糖包埋濃縮的牛血清蛋白質、未經蔗糖包埋的牛血清蛋白質、細胞色素C、溶菌酶等，用凝膠濃度為10%的SDS-PAGE進行電泳，然后用Schiff試劑染色進行染色。實驗結果顯示，只有辣根過氧化物酶被染上了紫紅色，而其他的非糖蛋白細（胞色素C、溶菌酶和有或沒有經過蔗糖包埋的牛血清蛋白等）都沒有染上紫紅色（圖2.2所示）,說明Schiff試劑能夠很好地指示糖蛋白，因此可以用來檢測胞外毒素蛋白是

24、否是糖蛋白。54321圖2.2 Schiff試劑對經聚丙烯酰胺電泳的不同蛋白質的染色泳道1：蔗糖包埋過的牛血清蛋白質；泳道2：未經蔗糖包埋的牛血清蛋白質；泳道3：細胞色素C；泳道4：辣根過氧化物酶；泳道5：溶菌酶。2.3 灰霉菌胞外毒素蛋白是否為糖蛋白的染色鑒定 我們采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法，將經過分離的灰霉菌胞外毒素大分子進一步分離純化。電泳開始上樣前，在同一塊凝膠上將毒素樣品的點樣重復一次，電泳結束后，將凝膠切開，得到兩個重復膠塊，然后分別用考馬斯亮藍染液和Schiff試劑進行染色。結果如圖2.3所示，辣根過氧化物酶和經電泳分離的灰霉菌胞外大分子中有4條蛋白帶被染成紅色，而標準蛋白沒有被染

25、成紅色，說明這4條蛋白為糖蛋白。AB圖2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳圖圖A： 希夫試劑染色；圖B：考馬斯亮藍染色泳道1、2：大分子毒素分離樣品經考馬斯亮藍染色，泳道3：辣根過氧化物酶，泳道4：標準蛋白，泳道5、6：大分子毒素分離樣品經希夫試劑染色，泳道7：辣根過氧化物酶經希夫試劑染色。分子量的測定：電泳、染色結束后，測量蛋白質及示蹤染料的遷移距離，并計算遷移率Rf值。Rf = 蛋白質的遷移距離/示蹤染料的遷移距離（注：蛋白質的遷移距離是指從分離膠的起始位到蛋白質條帶的前緣；示蹤染料的遷移距離是從點樣孔到蛋白質條帶的前緣。）根據表2.3數據，以蛋白質分子量為縱坐標，Rf為橫坐標繪圖，得到一條直線；通

26、過測定未知蛋白質的Rf值，便可在標準曲線上讀出它的分子量，見圖2.4。表2.3 蛋白質的遷移距離分子量（KDa） 20011697.266.444.3遷移率0.30.480.550.650.74 圖2.4 分子量及其遷移距離標準曲線灰霉毒素蛋白被希夫試劑染成紅色的四條條帶的遷移率分別是0.54、0.57、0.62、0.64，根據y=-352.27x+296.42公式求得四條條帶的蛋白分子量大約為106.2KD、95.6KD、78KD、71KD。2.4 毒素糖蛋白的回收使用PAGE膠蛋白微量回收試劑盒，將前述的凝膠上前三條糖蛋白條帶進行回收。試劑盒組成：溶液A、溶液B、干粉、DTT（DL-Dithiothreitol，二硫蘇糖醇）。用手術刀片將膠塊中前三條條帶依次切下，分別放入1.5ml的離心管中，用研磨杵將離心管中的膠體研磨成細小的碎片，加入400µl的溶液A，在室溫條件下，脫色搖床上震蕩過夜（1618小時），期間取出，偶爾震蕩幾次。室溫12000rpm，離心15分鐘，轉移上清液到另外一個2ml的離心管中，加入2ml的4預冷的溶液B，混勻，4放置30分鐘。室溫12000rpm，離心15分鐘，去除上清，再將離心管放置在通風櫥中，待殘留的液體揮發干凈。選用緩沖液溶解沉淀的蛋白質，得到蛋白回收液。將回收液經PAG