1、影響PCR反應(yīng)的條件(1)引物：引物就是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則： 引物長度:15-30bp,常用為20bp左右。 引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。 引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別就是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。 引物3端的堿基，特別就是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格

2、要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。 引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。 引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量 ：每條引物的 濃度0、11umol或10100pmol,以最低引物 量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引 起錯配與非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。(2) 酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)，一種就是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2、5U(指總反應(yīng)體積為100ul時)，濃度過高可引起非

3、特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。(3) dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度與 PCR擴增效率有密切關(guān)系,dNTP粉呈顆粒狀如保存不當易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris、HCL的緩沖液將其 PH調(diào)節(jié)到7、07、5,小量分裝，-20 C冰凍保存。多次凍 融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中,dNTP應(yīng)為50200umol/L ,尤其就是注意4種dNTP的濃 度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低),就會引起錯配。濃度過低又會降低 PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度

4、降低。(4) 模板(靶基因)核酸模板核酸的量與純化程度，就是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用 SDS與蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能就是：溶解細 胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜 ，并解離細胞中的核蛋白,SDS還能與 蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別就是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機 溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)與其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消 化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫

5、氰酸胍或蛋白酶K法要防止RNase降解RNA。Mg2+濃度Mg2+對PCR擴增的特異性與產(chǎn)量有顯著的影響 ，在一般的PCR反應(yīng)中，各種 dNTP濃度為200umol/L時,Mg2+濃度為1、52、0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異 性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。(6)溫度與時間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應(yīng)中采用三溫度點法 雙鏈DNA在9095C變性，再迅速冷卻至4060C ,引物退火并結(jié)合到 靶序列上，然后快速升溫至7075 C，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較

6、短靶基因（長度為100300bp時）可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可 合二為一，一般采用94 C變性，65 C左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活 性）。 變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全就是導(dǎo)致 PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93 C94C lmin足以使模板DNA變性,若低于93 C則需延長時間，但溫度不能過高，因為高 溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導(dǎo)致PCR失敗。 退火（復(fù)性）溫度與時間：退火溫度就是影響 PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40C60C，可使引物與模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DN

7、A比引物復(fù)雜得多，引物與模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸,G+C含量約50%的引物，55C為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm 值（解鏈溫度）=4（G+C） + 2（A+T）復(fù)性溫度=Tm值-（510 C ）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物與模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為3060sec,足以使引物與模板之間完全結(jié)合。 延伸溫度與時間:Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：7080 C 150核

8、苷酸/S/酶分子70 C 60核苷酸/S/酶分子55 C 24核苷酸/S/酶分子高于90 C時，DNA合成幾乎不能進行。PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在 7075C之間,常用溫度為72C，過高的延伸溫度不利于引物 與模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定 ，一般1Kb以內(nèi)的DNA 片段，延伸時間1min就是足夠 的。34kb的靶序列需34min;擴增10Kb需延伸至15min。 延伸進間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。（7）循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在3040次之間,

9、循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。影響pcr特異性的因素通過上述內(nèi)容，可以瞧出有許多因素可以影響pcr的特異性，在此我們作一歸納，供大家參考:退火步驟的嚴格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。減短退火 時間及延伸時間可以減少錯誤引發(fā)及錯誤延伸。引物二聚體 就是最常見的副產(chǎn)品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發(fā)，尤其就是引物的二聚化。改變 mgcl2（有時kcl）濃度可 以改進特異性，這可能就是提高反應(yīng)嚴格性或者對 taq酶的直接作用。般認為PCR產(chǎn)物應(yīng)在48h以內(nèi)完成電泳檢測，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型就 會出現(xiàn)不規(guī)則，甚至消失。Trouble sho

10、oti ng guide1假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量，PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。模板:模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有Taq酶抑制劑,模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈 ，特 別就是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。 在酶與引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能就是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了 毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析就是否因為酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致 假陰性。需注意的就是有時 P

11、CR時忘了加Taq酶或電泳時忘了加溴化乙錠。引物:引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度就是否對稱，就是PCR失敗或擴增條帶不理想、 容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不僅要瞧 OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)與引物合成單位協(xié) 商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。引物使用過程中應(yīng) 高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，

12、導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低 PCR擴增的特異性，濃 度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20卩1 30卩、50 或 100卩I應(yīng)用多大體積進 行PCR擴增，就是根據(jù)科研與臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20卩后，再做大體積時，一定要重新摸索條件，否則容易失敗。物理原因：溫度對PCR擴增來說相當重要。如果變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可導(dǎo)致非特異性擴增而降低特異性擴增效率；退

13、火溫度過高，影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下PCR儀或水浴鍋內(nèi) 的變性、退火與延伸溫度，這也就是PCR失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使 引物與模板失去互補序列，其PCR擴增就是不會成功的。2假陽性引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時 擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一就是整個基因組或大片段的交叉污 染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解

14、決：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣 器內(nèi)或濺出離心管外。除了酶及其她不耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及進樣槍頭均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標本前，反應(yīng)管與試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二就是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方 法來減輕或消除。3出現(xiàn)非特異性擴增帶PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因:一就是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形 成二聚體。二就是 Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低 ，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次，就 是酶的質(zhì)與量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶的量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時，重