1、第四章第四章 沉淀法沉淀法生物分離過程的一般流程生物分離過程的一般流程原料液原料液細胞分離細胞分離( (離心，過濾離心，過濾) )細胞胞內產物細胞胞內產物路線一路線一路線二路線二細胞破碎細胞破碎碎片分離碎片分離路線一路線一A A路線一路線一B B清液胞外產物清液胞外產物粗分離粗分離( (鹽析、萃取、超過濾等鹽析、萃取、超過濾等) )純化純化( (層析、電泳層析、電泳) )脫鹽脫鹽( (凝膠過濾、超過濾凝膠過濾、超過濾) )濃縮濃縮( (超過濾超過濾) )精制精制( (結晶、干燥結晶、干燥) )包含體包含體溶解溶解( (加鹽酸胍、脲加鹽酸胍、脲) )復性復性 與化學產品的分離制備相比較，生物大分

2、子的制備與化學產品的分離制備相比較，生物大分子的制備有以下主要特點：有以下主要特點： 生物材料的組成極其復雜，常常包含有數百種乃生物材料的組成極其復雜，常常包含有數百種乃至幾千種化合物。至幾千種化合物。 許多生物大分子在生物材料中的含量極微，分離許多生物大分子在生物材料中的含量極微，分離純化的步驟繁多，流程長。純化的步驟繁多，流程長。 第一節第一節 概述概述許多生物大分子一旦離開了生物體內的環境時許多生物大分子一旦離開了生物體內的環境時就極易失活，因此分離過程中如何防止其失活，就極易失活，因此分離過程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制備最困難之處。就是生物大分子提取制備最困難之處。生物大分

3、子的制備幾乎都是在溶液中進行的，生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進行的，溫度、溫度、pHpH值、離子強度等各種參數對溶液中各值、離子強度等各種參數對溶液中各種組成的綜合影響，很難準確估計和判斷。種組成的綜合影響，很難準確估計和判斷。基本概念基本概念 通過加入某種試劑或改變溶液條件，使生化產物以通過加入某種試劑或改變溶液條件，使生化產物以固體形式（沉淀和晶體）從溶液中沉降析出的分離純化固體形式（沉淀和晶體）從溶液中沉降析出的分離純化技術稱為技術稱為固相析出技術固相析出技術。 結晶法結晶法：在固相析出過程中，析出物為：在固相析出過程中，析出物為晶體晶體時稱為時稱為結晶法。結晶法。 沉淀法沉淀法：在

4、固相析出過程中，析出物為：在固相析出過程中，析出物為無定形固體無定形固體時則稱為沉淀法。常用的沉淀法主要有時則稱為沉淀法。常用的沉淀法主要有鹽析法鹽析法、有機溶有機溶劑沉淀法劑沉淀法和和等電點沉淀法等電點沉淀法等。等。 沉淀法（即溶解度法）操作簡便，成本低廉，不僅用沉淀法（即溶解度法）操作簡便，成本低廉，不僅用于實驗室中，也用于某些生產目的的制備過程，是分于實驗室中，也用于某些生產目的的制備過程，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質和酶時最常用離純化生物大分子，特別是制備蛋白質和酶時最常用的方法。的方法。 通過沉淀達到通過沉淀達到濃縮濃縮的目的，或者通過沉淀，固液分的目的，或者通過沉淀，固液

5、分相后，除去留在液相或沉積在固體中的非必要成分；相后，除去留在液相或沉積在固體中的非必要成分；沉淀可以將已純化的產品由液態變成固態，加以保存沉淀可以將已純化的產品由液態變成固態，加以保存或進一步處理。沉淀方法用于分離純化是有選擇性的，或進一步處理。沉淀方法用于分離純化是有選擇性的，即即有選擇地沉淀雜質或有選擇地沉淀雜質或有有選擇地沉淀所需成分。選擇地沉淀所需成分。沉淀分離在生物分離過程中應用相當廣泛。一般情況沉淀分離在生物分離過程中應用相當廣泛。一般情況下，沉淀分離方法在生物下游加工過程中通常作為下，沉淀分離方法在生物下游加工過程中通常作為初初級分離技術級分離技術加以使用，但在實際過程中也有僅

6、通過沉加以使用，但在實際過程中也有僅通過沉淀分離得到目標產品的工業實例。淀分離得到目標產品的工業實例。 根據不同物質在溶劑中的溶解度不同而達到分離根據不同物質在溶劑中的溶解度不同而達到分離的目的，不同溶解度的產生是由于溶質分子之間及溶的目的，不同溶解度的產生是由于溶質分子之間及溶質與溶劑分子之間親和力的差異而引起的，溶解度的質與溶劑分子之間親和力的差異而引起的，溶解度的大小與溶質和溶劑的化學性質及結構有關，溶劑組分大小與溶質和溶劑的化學性質及結構有關，溶劑組分的改變或加入某些沉淀劑以及改變溶液的的改變或加入某些沉淀劑以及改變溶液的pHpH值、離子值、離子強度和極性都會使溶質的溶解度產生明顯的改

7、變。強度和極性都會使溶質的溶解度產生明顯的改變。 在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法是：在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法是： 中性鹽沉淀（鹽析法）中性鹽沉淀（鹽析法）：多用于各種蛋白質和酶：多用于各種蛋白質和酶的分離純化。的分離純化。 有機溶劑沉淀有機溶劑沉淀：多用于蛋白質和酶、多糖、核酸：多用于蛋白質和酶、多糖、核酸以及以及生物小分子生物小分子的分離純化。的分離純化。 選擇性沉淀選擇性沉淀（熱變性沉淀和酸堿變性沉淀）：多（熱變性沉淀和酸堿變性沉淀）：多用于除去某些不耐熱的和在一定用于除去某些不耐熱的和在一定pHpH值下易變性的雜值下易變性的雜蛋白。蛋白。 等電點沉淀等電點沉淀：用于

8、氨基酸、蛋白質及其他兩性物：用于氨基酸、蛋白質及其他兩性物質的沉淀，但此法單獨應用較少，多與其他方法結合質的沉淀，但此法單獨應用較少，多與其他方法結合使用。使用。 有機聚合物沉淀有機聚合物沉淀： 是發展較快的一種新方法，是發展較快的一種新方法， 主要使用主要使用PEGPEG聚乙二醇（聚乙二醇（PolyethyenePolyethyene glycol glycol）作為）作為沉淀劑。沉淀劑。n蛋白質組成蛋白質組成 2020種氨基酸構成的兩性高分子電解質，包括疏水種氨基酸構成的兩性高分子電解質，包括疏水性氨基酸和親水性氨基酸性氨基酸和親水性氨基酸n蛋白質折疊趨勢蛋白質折疊趨勢 疏水性氨基酸：疏水

9、性氨基酸：向內部折疊的趨勢向內部折疊的趨勢 親水性氨基酸：親水性氨基酸：分布于蛋白質外表面的趨勢分布于蛋白質外表面的趨勢 n結果結果 在蛋白質三維結構中仍會有部分疏水性氨基酸殘在蛋白質三維結構中仍會有部分疏水性氨基酸殘基暴露于表面，在蛋白質表面形成一定的疏水區基暴露于表面，在蛋白質表面形成一定的疏水區第二節第二節 蛋白質的表面特性蛋白質的表面特性n蛋白質表面由不均勻分布的荷電基團形成蛋白質表面由不均勻分布的荷電基團形成荷電區、荷電區、親水區親水區和和疏水區疏水區構成。構成。n蛋白質的溶解行為是一個獨特的性質，由其組成、蛋白質的溶解行為是一個獨特的性質，由其組成、構象以及分子周圍的環境所決定。構

10、象以及分子周圍的環境所決定。n一般而言，小分子蛋白質比起在化學上類似的大分一般而言，小分子蛋白質比起在化學上類似的大分子蛋白質更易溶解。子蛋白質更易溶解。防止蛋白質凝聚沉淀的屏障防止蛋白質凝聚沉淀的屏障蛋白質周圍的蛋白質周圍的水化層水化層（hydration shell)hydration shell) 可以使蛋白質形成穩定的膠體溶液。可以使蛋白質形成穩定的膠體溶液。蛋白質分子間蛋白質分子間靜電排斥作用靜電排斥作用。（存在雙電層）。（存在雙電層） 膠體的定義膠體的定義n膠體是一種尺寸在膠體是一種尺寸在1 1100 nm100 nm以以至至1000 nm1000 nm的分散體。它既非大的分散體。

11、它既非大塊固體，又不是分子分散的液體，塊固體，又不是分子分散的液體，而是具有兩相的微不均勻分散體而是具有兩相的微不均勻分散體系。系。 -被遺忘了尺寸的世界Wilhelm Friedrich Ostwald (1853 1932) 蛋白質膠體溶液的穩定性蛋白質膠體溶液的穩定性n蛋白質可以看作是一個表面分布有正、負電荷的球蛋白質可以看作是一個表面分布有正、負電荷的球體，這種正、負電荷是由氨基和羧基的離子化形成體，這種正、負電荷是由氨基和羧基的離子化形成的，換句話說，該球體是帶有均衡電荷分布的膠體的，換句話說，該球體是帶有均衡電荷分布的膠體顆粒。因此，蛋白質的沉淀，實際上與膠體顆粒的顆粒。因此，蛋白

12、質的沉淀，實際上與膠體顆粒的凝聚和絮凝現象相似。凝聚和絮凝現象相似。靜電斥力靜電斥力吸引力吸引力蛋白質蛋白質/ /膠體顆粒的凝聚和絮凝現象相似膠體顆粒的凝聚和絮凝現象相似n蛋白質粒子在水溶液中是帶電的，帶電的原因主要蛋白質粒子在水溶液中是帶電的，帶電的原因主要是吸附溶液中的離子或自身基團的電離。因溶液是是吸附溶液中的離子或自身基團的電離。因溶液是電中性的，水中應有等當量的反離子存在。蛋白質電中性的，水中應有等當量的反離子存在。蛋白質表面的電荷與溶液中反離子的電荷構成雙電層。表面的電荷與溶液中反離子的電荷構成雙電層。吸引力n顆粒間的相互作用顆粒間的相互作用n顆粒間的相互作用的位能取決于離子強度。

13、顆粒間的相互作用的位能取決于離子強度。nVan Van derder Waals Waals 力力nKeesonKeeson 引力（偶極力）引力（偶極力）nDebye Debye 引力引力 （誘導力）（誘導力）nLondon London 引力引力 （色散力）是最重要的一種引力，因（色散力）是最重要的一種引力，因為所有分子都是可以被極化的，所以它是普遍存在為所有分子都是可以被極化的，所以它是普遍存在的。的。DLVODLVO理論理論n顆粒間的相互作用的位能取決于離子強度。顆粒間的相互作用的位能取決于離子強度。在低離子強度時，顆在低離子強度時，顆粒距離處在中間狀態，雙電層斥力占優勢粒距離處在中間狀

14、態，雙電層斥力占優勢，可看為一個凝聚的勢，可看為一個凝聚的勢壘；在壘；在高離子強度時，吸引力超過排斥力，相互間的總位能表現高離子強度時，吸引力超過排斥力，相互間的總位能表現為吸引位能為吸引位能。沉淀策略及方法沉淀策略及方法n策略策略 破壞蛋白質周圍的水化層破壞蛋白質周圍的水化層 降低雙電層厚度降低雙電層厚度（電位）電位）n沉淀方法沉淀方法 改變溶液改變溶液pH值值 加入無機鹽或改變無機鹽種類加入無機鹽或改變無機鹽種類 加入水溶性有機溶劑加入水溶性有機溶劑 添加脫水劑添加脫水劑 定義：定義：n蛋白質在高離子強度的溶液蛋白質在高離子強度的溶液中溶解度降低、發生沉淀的中溶解度降低、發生沉淀的現象稱為

15、現象稱為“鹽析鹽析”。第三節第三節 鹽析法鹽析法兩種現象：兩種現象：鹽溶鹽溶：低鹽情況，鹽離子強：低鹽情況，鹽離子強度的增高，蛋白質溶解度度的增高，蛋白質溶解度增大。增大。鹽析鹽析：高鹽，鹽離子強度增：高鹽，鹽離子強度增加，蛋白質加，蛋白質溶解度減小溶解度減小。2.52.01.51.00.50-0.5-1.0-1.51 2 3 4 5 6logSS0應用：應用：n蛋白質和酶分離提純蛋白質和酶分離提純n多肽、多糖和核酸也可以用鹽析法進行沉淀分多肽、多糖和核酸也可以用鹽析法進行沉淀分離離q20204040飽和度的硫酸銨可以使許多病毒沉飽和度的硫酸銨可以使許多病毒沉淀淀q4343飽和度的硫酸銨可以使

16、飽和度的硫酸銨可以使DNADNA和和rRNArRNA沉淀，沉淀，而而tRNAtRNA保留在上清。保留在上清。一、鹽析法的原理及特點一、鹽析法的原理及特點原理原理n形成形成離子對離子對，部分中和了蛋白質的電性，排斥，部分中和了蛋白質的電性，排斥作用減弱而能相互靠攏，聚集起來。作用減弱而能相互靠攏，聚集起來。n中性鹽的親水性比蛋白質大，使蛋白質脫去了中性鹽的親水性比蛋白質大，使蛋白質脫去了水化膜水化膜，使其沉淀。，使其沉淀。 Cohn方程式n現在常用現在常用 CohnCohn經驗式來表示蛋白質的溶解度與鹽的濃度之間經驗式來表示蛋白質的溶解度與鹽的濃度之間的關系：的關系：n S= S= s s n式

17、中式中SS蛋白質的溶解度蛋白質的溶解度，g/L;g/L;n I I一離子強度等于一離子強度等于 I=1/2mI=1/2mi iz zi i2 2; ;n m mi i離子離子 i i的摩爾濃度；的摩爾濃度；n ZiZi所帶電荷；所帶電荷；n n常數，與鹽的種類無關，但與溫度、常數，與鹽的種類無關，但與溫度、pHpH和蛋白質種類有和蛋白質種類有關關; ;nKsKs鹽析常數鹽析常數，與溫度和與溫度和PHPH無關，但與蛋白質和鹽的種類有無關，但與蛋白質和鹽的種類有關。關。用鹽析法分離蛋白質的二種方法用鹽析法分離蛋白質的二種方法在一定的在一定的 pHpH值及溫度條件下，改變鹽的濃度（即值及溫度條件下，

18、改變鹽的濃度（即離子強度）達到沉淀的目的，稱為離子強度）達到沉淀的目的，稱為“s”s”分級鹽分級鹽析法。析法。（KsKs鹽析鹽析：固定：固定pH, pH, 溫度，改變鹽濃度）溫度，改變鹽濃度）在一定的離子強度下，改變溶液的在一定的離子強度下，改變溶液的pHpH值及溫度，達值及溫度，達到沉淀的目的，稱為到沉淀的目的，稱為“”分級鹽析法。分級鹽析法。（鹽析：鹽析：固定離子強度，改變固定離子強度，改變pHpH及溫度。）及溫度。） 成本低，不需要特別昂貴的設備。成本低，不需要特別昂貴的設備。 操作簡單、安全。操作簡單、安全。 對許多生物活性物質具有穩定作用，對許多生物活性物質具有穩定作用，不易引起不易

19、引起蛋白質變性蛋白質變性 優點優點缺點缺點鹽析法分辨率不高，適合于生化物質粗提純鹽析法分辨率不高，適合于生化物質粗提純階段，需和其它方法交替使用。階段，需和其它方法交替使用。二、影響鹽析的因素二、影響鹽析的因素（一）離子強度和類型（一）離子強度和類型n一般說來，離子強度越大，蛋白質的溶解度越低。一般說來，離子強度越大，蛋白質的溶解度越低。在進行分離的時候，一般從低離子強度到高離子強在進行分離的時候，一般從低離子強度到高離子強度順次進行。每一組分被鹽析出來后，經過過濾或度順次進行。每一組分被鹽析出來后，經過過濾或冷凍離心收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和冷凍離心收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的

20、飽和度，使另一種蛋白質組分鹽析出來。度，使另一種蛋白質組分鹽析出來。 n鹽析能力：半徑小的高價離子在鹽析時的作用鹽析能力：半徑小的高價離子在鹽析時的作用較強，較強，陰離子的鹽析效果比陽離子好陰離子的鹽析效果比陽離子好，尤其以，尤其以高價陰離子更為明顯。高價陰離子更為明顯。n PO4 3-SO42-CH3COO-Cl-NO3-I-nNH4+K+Na+Li+ n鹽析用鹽要考慮幾個因素：常用鹽析用鹽要考慮幾個因素：常用硫酸銨硫酸銨( (二）溶質（蛋白質等）種類的影響二）溶質（蛋白質等）種類的影響血纖維蛋白原碳氧血紅蛋白血清白蛋白擬球蛋白碳氧肌紅蛋白0.500-0.50-1.000 2 4 6 8 1

21、0log S（三）蛋白質濃度的影響（三）蛋白質濃度的影響 在相同的鹽析條件下，在相同的鹽析條件下，蛋蛋白質濃度越大越易沉淀白質濃度越大越易沉淀，但蛋，但蛋白質的濃度愈高，其它蛋白質白質的濃度愈高，其它蛋白質的共沉作用也愈強，從而使分的共沉作用也愈強，從而使分辨率降低，辨率降低，-d dSP10987654321040 50 60 70 80P30g/L 3g/L一般常將蛋白質濃度控制在一般常將蛋白質濃度控制在2 23 3為宜。為宜。相當于相當于25 mg/25 mg/mLmL30mg/mL30mg/mL。（四）溫度的影響：（四）溫度的影響： 溫度的變化會影響溫度的變化會影響 值。值。在無鹽或稀

22、鹽溶液中，大在無鹽或稀鹽溶液中，大多數蛋白質溶解度是隨溫多數蛋白質溶解度是隨溫度升高而增大的，但在度升高而增大的，但在高高鹽溶液中常相反鹽溶液中常相反。210log S2 3 4 250pH6.6 對于某些對溫度敏感的酶，要求在對于某些對溫度敏感的酶，要求在0044下下操作，以避免活力喪失。但有的蛋白質（如血紅蛋操作，以避免活力喪失。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（2525）比）比0 0時溶解度低，更容易鹽析。時溶解度低，更容易鹽析。（五）（五）PHPH的影響：的影響： 蛋白質所帶凈電荷越多，蛋白質所帶凈電荷越多，它的溶解度就越大。

23、改變它的溶解度就越大。改變pHpH值可改變蛋白質的帶電性質，值可改變蛋白質的帶電性質，因而就改變了蛋白質的溶解因而就改變了蛋白質的溶解度。度。在等電點處溶解度小（在等電點處溶解度小（ 值最小）值最小）。 因此用中性鹽沉淀蛋白質時，因此用中性鹽沉淀蛋白質時，pHpH值常選在該值常選在該蛋白質的等電點附近蛋白質的等電點附近三、鹽析常用的鹽三、鹽析常用的鹽 常用的鹽析用鹽主要有硫酸銨、硫酸鈉、常用的鹽析用鹽主要有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉、磷酸鉀等。氯化鈉、磷酸鈉、磷酸鉀等。 （NHNH4 4）2 2SOSO4 4 最常用：最常用： 溶解度大溶解度大：尤其是在低溫時仍有相當高的溶解度，：尤其是在

24、低溫時仍有相當高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由于酶和各種蛋白質通常這是其他鹽類所不具備的。由于酶和各種蛋白質通常是在低溫下穩定，因而鹽析操作也要求在低溫下是在低溫下穩定，因而鹽析操作也要求在低溫下（0 044）進行。由下表可以看到，（）進行。由下表可以看到，（NH4NH4）2SO42SO4在在00時仍有時仍有70.670.6的溶解度，遠遠高于其它鹽類：的溶解度，遠遠高于其它鹽類： 幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100/100毫升水）毫升水）02080100(NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO

25、41.67.893.8101 分離效果好分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一步就可以除去一步就可以除去7575的雜蛋白，純度提高了四倍。的雜蛋白，純度提高了四倍。 不易引起變性，有穩定酶與蛋白質結構的作用不易引起變性，有穩定酶與蛋白質結構的作用。有的酶或蛋白質用有的酶或蛋白質用2 23mol/L3mol/L的（的（NH4NH4）2SO42SO4保存保存可達數年之久。可達數年之久。 價格便宜，廢液不污染環境。價格便宜，廢液不污染環境。n但硫酸銨具腐蝕性且緩沖能力差，飽和溶液但硫酸銨具腐蝕性且緩沖能力差，飽和溶液的的pHpH值在值在4.54.55.55.5之

26、間，使用時多用濃氨水之間，使用時多用濃氨水調整到調整到pH7pH7左右。左右。四、鹽析操作（以硫酸銨為例）四、鹽析操作（以硫酸銨為例） 鹽析時，將鹽加入到溶液中有兩種方式：鹽析時，將鹽加入到溶液中有兩種方式：（1 1）加硫酸銨的飽和溶液：）加硫酸銨的飽和溶液：在實驗室和小規模生產中，在實驗室和小規模生產中，或或(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4 濃度不需太高時，可采用這種方式，它濃度不需太高時，可采用這種方式，它可防止溶液局部過濃，但加量較多時，料液會被稀釋。可防止溶液局部過濃，但加量較多時，料液會被稀釋。（2 2）直接加固體硫酸銨：）直接加固體硫酸銨：工業上常采用這種方法，加工業上

27、常采用這種方法，加入速度不能太快，應分批加入，并充分攪拌，使其完入速度不能太快，應分批加入，并充分攪拌，使其完全溶解和防止局部濃度過高；全溶解和防止局部濃度過高； 常用常用“飽和度飽和度”來表征硫酸銨在溶液中來表征硫酸銨在溶液中的最終濃度，的最終濃度，2525時時(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4的飽和濃度的飽和濃度為為4.1 mol4.1 molL L，定義它為，定義它為100%100%飽和度飽和度。 鹽析曲線的制作鹽析曲線的制作 如果要分離一種新的蛋白質和酶，沒有文獻數據如果要分離一種新的蛋白質和酶，沒有文獻數據可以借鑒，則應先確定沉淀該物質的硫酸銨飽和度。可以借鑒，則應先確定沉

28、淀該物質的硫酸銨飽和度。具體操作方法如下：具體操作方法如下： 取已定量測定蛋白質或酶的活性與濃度的待分取已定量測定蛋白質或酶的活性與濃度的待分離樣品溶液，冷至離樣品溶液，冷至0055，調至該蛋白質穩定的，調至該蛋白質穩定的pHpH值。值。 計算飽和度達到計算飽和度達到20%-100%20%-100%所需加入的硫酸銨量，所需加入的硫酸銨量，邊攪拌邊加入，放置邊攪拌邊加入，放置1h1h以上，使沉淀達到平衡以上，使沉淀達到平衡鹽析操作鹽析操作- -溶解度曲線確定溶解度曲線確定離心分離心分離沉淀物離沉淀物并重新溶并重新溶解測定其解測定其中總蛋白中總蛋白和目標蛋和目標蛋白的濃度白的濃度 以飽和以飽和度為

29、橫坐度為橫坐標，上清標，上清液中總蛋液中總蛋白和目標白和目標蛋白濃度蛋白濃度為縱坐標，為縱坐標，得到蛋白得到蛋白質溶解度質溶解度曲線曲線 第三節第三節 有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法n定義：向水溶液中加入一定量定義：向水溶液中加入一定量親水性親水性的有機溶的有機溶劑，降低溶質的劑，降低溶質的溶解度溶解度，使其沉淀析出的分離，使其沉淀析出的分離純化方法。純化方法。一、有機溶劑沉淀法的原理和特點一、有機溶劑沉淀法的原理和特點n原理原理1 1）加入有機溶劑后，會使水溶液的）加入有機溶劑后，會使水溶液的介電常數介電常數降低降低 ，導致蛋白質分子之間的導致蛋白質分子之間的靜電引力增加靜電引力增加，從而使蛋

30、白質發，從而使蛋白質發生聚集沉淀。生聚集沉淀。 2 2）由于使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解于水的由于使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時同時從蛋白質分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞從蛋白質分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質分子的水膜了蛋白質分子的水膜，因而發生沉淀作用。，因而發生沉淀作用。特點特點 n分辨率高于鹽析；分辨率高于鹽析；n乙醇等有機溶劑沸點低，易揮發除去，不會殘留于成乙醇等有機溶劑沸點低，易揮發除去，不會殘留于成品中，產品更純凈；品中，產品更純凈；n沉淀物與母液間的密度差較大，分離容易。沉淀物與母液間的密度差較大，分離容易。n但有機溶劑沉淀法易使蛋白質等生

31、物大分子變性，操但有機溶劑沉淀法易使蛋白質等生物大分子變性，操作需在作需在低溫低溫下進行；需要耗用大量有機溶劑，成本較下進行；需要耗用大量有機溶劑，成本較高高; ;有機溶劑一般易燃易爆，所以貯存比較困難或麻有機溶劑一般易燃易爆，所以貯存比較困難或麻煩。煩。二、二、 有機溶劑的選擇和濃度的計算有機溶劑的選擇和濃度的計算n用于生化制備的有機溶劑的選擇首先是要能與水互溶。用于生化制備的有機溶劑的選擇首先是要能與水互溶。沉淀蛋白質和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核沉淀蛋白質和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀劑是乙醇。酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀劑是乙醇。 進

32、行沉淀操作時，欲使溶液達到一定的有機溶劑進行沉淀操作時，欲使溶液達到一定的有機溶劑濃度，需要加入的有機溶劑的濃度和體積可按下式計濃度，需要加入的有機溶劑的濃度和體積可按下式計算：算： V = V0 (S2 V = V0 (S2 S1) S1) (100(100S2)S2) 式中：式中： V = V = 需加入需加入100100濃度有機溶劑的體積濃度有機溶劑的體積 V0 = V0 = 原溶液體積原溶液體積 S1 = S1 = 原溶液中有機溶劑的濃度原溶液中有機溶劑的濃度 S2 = S2 = 所要求達到的有機溶劑的濃度所要求達到的有機溶劑的濃度 100100是指加入的有機溶劑濃度為是指加入的有機溶

33、劑濃度為100100，如所加入的有機溶劑的濃度為，如所加入的有機溶劑的濃度為9595，上式的，上式的(100(100S2) S2) 項應改為項應改為 (95(95S2)S2) 。n上式的計算由于未考慮混溶后體積的變化和溶上式的計算由于未考慮混溶后體積的變化和溶劑的揮發情況，實際上存在一定的誤差。有時劑的揮發情況，實際上存在一定的誤差。有時為了獲得沉淀而不著重于進行分離，可用溶液為了獲得沉淀而不著重于進行分離，可用溶液體積的倍數：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的倍數：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的有機溶劑，來進行有機溶劑沉淀。體積的有機溶劑，來進行有機溶劑沉淀。 三、常用的有機溶劑三、常用

34、的有機溶劑 常用于生物大分子沉淀的有機溶劑有乙醇、丙酮和甲常用于生物大分子沉淀的有機溶劑有乙醇、丙酮和甲醇等。其中乙醇是最常用的沉淀劑，因為它具有沉淀作用醇等。其中乙醇是最常用的沉淀劑，因為它具有沉淀作用強、沸點適中、無毒等優點。強、沸點適中、無毒等優點。 四、有機溶劑沉淀法的影響因素四、有機溶劑沉淀法的影響因素 1 1、溫度、溫度 有機溶劑與水混合時，會放出大量的熱量，使有機溶劑與水混合時，會放出大量的熱量，使溶液的溫度顯著升高，從而增加有機溶劑對蛋白質的溶液的溫度顯著升高，從而增加有機溶劑對蛋白質的變性作用。另外，溫度還會影響有機溶劑對蛋白質的變性作用。另外，溫度還會影響有機溶劑對蛋白質的

35、沉淀能力，一般溫度越低，沉淀越完全。因此，在使沉淀能力，一般溫度越低，沉淀越完全。因此，在使用有機溶劑沉淀生物高分子時，整個操作過程應在低用有機溶劑沉淀生物高分子時，整個操作過程應在低溫下進行溫下進行 。2 2、pHpH值值 有機溶劑沉淀適宜的有機溶劑沉淀適宜的pHpH值，要選擇在樣品穩值，要選擇在樣品穩定的定的pHpH值范圍內，而且盡可能選擇樣品溶解度值范圍內，而且盡可能選擇樣品溶解度最低的最低的pHpH值，通常是選在等電點附近，從而提值，通常是選在等電點附近，從而提高此沉淀法的分辨能力。高此沉淀法的分辨能力。 3 3、樣品濃度、樣品濃度 樣品較稀時，將增加有機溶劑投入量和損耗；樣品樣品較稀

36、時，將增加有機溶劑投入量和損耗；樣品太濃會增加共沉作用太濃會增加共沉作用 。一般認為蛋白質的初濃度以。一般認為蛋白質的初濃度以0.50.52 2為好，粘多糖則以為好，粘多糖則以1 12 2較合適。較合適。4 4、中性鹽濃度、中性鹽濃度 較低濃度的中性鹽存在有利于沉淀作用，減少蛋白較低濃度的中性鹽存在有利于沉淀作用，減少蛋白質變性。一般在有機溶劑沉淀時中性鹽濃度以質變性。一般在有機溶劑沉淀時中性鹽濃度以0.010.010.05mol/L0.05mol/L為好，常用的中性鹽為醋酸鈉、醋酸銨、氯化為好，常用的中性鹽為醋酸鈉、醋酸銨、氯化鈉等。鈉等。 5 5、某些金屬離子、某些金屬離子 一些金屬離子如

37、一些金屬離子如CaCa2+2+、ZnZn2+2+等可與某些成陰離子等可與某些成陰離子狀態的蛋白質形成復合物，這種復合物溶解度大大降狀態的蛋白質形成復合物，這種復合物溶解度大大降低而不影響生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶劑低而不影響生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶劑用量。用量。利用蛋白質沉淀大規模提純利用蛋白質沉淀大規模提純白蛋白與免疫球蛋白的工藝白蛋白與免疫球蛋白的工藝 這一方法是利用蛋白質、酶與核酸等生物大分子這一方法是利用蛋白質、酶與核酸等生物大分子與非目的生物大分子在物理化學性質等方面的差異，與非目的生物大分子在物理化學性質等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到

38、選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到分離提純，稱為選擇性變性沉淀法。常用的有分離提純，稱為選擇性變性沉淀法。常用的有熱變性熱變性、選擇性酸堿變性選擇性酸堿變性和和有機溶劑變性有機溶劑變性等。等。第四節第四節 選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法 熱變性熱變性 利用生物大分子對熱的穩定性不同，加熱升利用生物大分子對熱的穩定性不同，加熱升高溫度使某些非目的生物大分子變性沉淀而保留高溫度使某些非目的生物大分子變性沉淀而保留目的物在溶液中。此方法最為簡便，不需消耗任目的物在溶液中。此方法最為簡便，不需消耗任何試劑，但分離效率較低，通常用于生物大分子何試劑，但分離效率較低，通常用于生物大分子的初期

39、分離純化。的初期分離純化。 n酵母干粉中加入酵母干粉中加入0.066 mol/L0.066 mol/L磷酸氫二鈉溶液，磷酸氫二鈉溶液，3737水浴保溫水浴保溫2 h2 h，室溫攪拌，室溫攪拌3 h3 h，離心收集上清液，離心收集上清液，升溫至升溫至5555，保溫，保溫20 min20 min后迅速冷卻離心去除熱變后迅速冷卻離心去除熱變性蛋白，上清液中多為熱穩定性較高的醇脫氫酶。性蛋白，上清液中多為熱穩定性較高的醇脫氫酶。 表面活性劑和有機溶劑變性表面活性劑和有機溶劑變性n分離蛋白質和酶分離蛋白質和酶：對于表面活性劑和有機溶劑的敏：對于表面活性劑和有機溶劑的敏感性雜蛋白變性沉淀，而目的物仍留在溶

40、液中。在感性雜蛋白變性沉淀，而目的物仍留在溶液中。在冰浴或冷室中進行。冰浴或冷室中進行。n分離核酸分離核酸：在核酸提取液中加入氯仿在核酸提取液中加入氯仿- -戊醇或氯仿戊醇或氯仿- -辛醇，振蕩一段時間、使蛋白質在氯仿辛醇，振蕩一段時間、使蛋白質在氯仿- -水的界面上水的界面上形成沉淀而被除去，核酸仍然留在水溶液中。形成沉淀而被除去，核酸仍然留在水溶液中。 在在DNADNA、RNARNA混合溶液中，用異丙醇選擇性地沉混合溶液中，用異丙醇選擇性地沉淀淀DNADNA，而，而RNARNA留在溶液中。留在溶液中。 選擇性酸堿變性選擇性酸堿變性 利用蛋白質和酶等對于溶液中酸堿不同利用蛋白質和酶等對于溶液

41、中酸堿不同pHpH值的穩定性不同而使雜蛋白變性沉淀，通常是值的穩定性不同而使雜蛋白變性沉淀，通常是在分離純化流程中附帶進行的一個分離純化步在分離純化流程中附帶進行的一個分離純化步驟。驟。 等電點沉淀法是利用具有不同等電點的兩性電解等電點沉淀法是利用具有不同等電點的兩性電解質，在達到電中性時溶解度最低，易發生沉淀，從而質，在達到電中性時溶解度最低，易發生沉淀，從而實現分離的方法。實現分離的方法。氨基酸、蛋白質、酶和核酸都是兩氨基酸、蛋白質、酶和核酸都是兩性電解質，可以利用此法進行初步的沉淀分離。但是，性電解質，可以利用此法進行初步的沉淀分離。但是，由于許多蛋白質的等電點十分接近，而且帶有水膜的由

42、于許多蛋白質的等電點十分接近，而且帶有水膜的蛋白質等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉蛋白質等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨使用此法分辨率較低，效果不理淀析出，因此，單獨使用此法分辨率較低，效果不理想。想。第五節第五節 等電點沉淀法等電點沉淀法在調節等電點時，如果采用鹽在調節等電點時，如果采用鹽 酸、氫氧酸、氫氧化鈉等強酸強堿，要注意防止酶的失活或化鈉等強酸強堿，要注意防止酶的失活或蛋白變性。為了使蛋白變性。為了使pHpH緩慢變動，也可用乙緩慢變動，也可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸鈉等弱堿。酸、碳酸等弱酸和碳酸鈉等弱堿。 此法常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或此法常與鹽析法

43、、有機溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。力和分離效果。 此法主要用于在分離純化流程中去除此法主要用于在分離純化流程中去除雜雜蛋白蛋白，而不用于沉淀目的物。，而不用于沉淀目的物。n（1 1）適用于疏水性強的蛋白質）適用于疏水性強的蛋白質n（2 2）中性鹽濃度增大時，等電點向偏酸方向移動，）中性鹽濃度增大時，等電點向偏酸方向移動，同時最低溶解度會有所增大。同時最低溶解度會有所增大。n（3 3）無機酸通常價格便宜，無毒）無機酸通常價格便宜，無毒n（4 4）蛋白質對低）蛋白質對低pH pH 敏感，易失活敏感，易失活等電點沉淀法工業生產胰島

44、素工業生產胰島素(pI5.3) ： 胰島素胰島素 pH8pH8 除去堿性雜蛋白除去堿性雜蛋白 pH3pH3 除去酸性雜蛋白除去酸性雜蛋白 n堿性磷酸酯酶的堿性磷酸酯酶的pIpI沉淀提取沉淀提取：發酵液調：發酵液調pH pH 4.04.0后出現含堿性磷酸酯酶的沉淀物，離心收后出現含堿性磷酸酯酶的沉淀物，離心收集沉淀物。用集沉淀物。用pH 9.0pH 9.0的的0.1 mol/L 0.1 mol/L Tris-HClTris-HCl緩緩沖液重新溶解，加入沖液重新溶解，加入202040%40%飽和度的硫酸銨飽和度的硫酸銨分級，離心收集的沉淀分級，離心收集的沉淀Tris-HClTris-HCl緩沖液再

45、次沉緩沖液再次沉淀，即得較純的堿性磷酸酯酶。淀，即得較純的堿性磷酸酯酶。第六節第六節 其它沉淀法其它沉淀法一、有機聚合物沉淀法一、有機聚合物沉淀法n有機聚合物是六十年代發展起來的一類重要的沉淀劑，有機聚合物是六十年代發展起來的一類重要的沉淀劑，最早應用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細菌和病毒。近最早應用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細菌和病毒。近年來廣泛用于核酸和酶的純化。年來廣泛用于核酸和酶的純化。n應用最多的是應用最多的是聚乙二醇聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n 4)( Polyethylene Glycol 4)( Polye

46、thylene Glycol 簡寫為簡寫為 PEG )PEG )，它的親水性，它的親水性強，溶干水和許多有機溶劑，對熱穩定，有廣泛圍的分強，溶干水和許多有機溶劑，對熱穩定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為200D200D20KD20KD的的 PEGPEG。 nPEGPEG的沉淀效果主要與其本身的濃度和分子的沉淀效果主要與其本身的濃度和分子量有關，同時還受離子強度、溶液量有關，同時還受離子強度、溶液pHpH和溫和溫度等因素的影響。度等因素的影響。n在一定的在一定的pHpH值下，鹽濃度越高，所需值下，鹽濃度越高，所需PEGPE

47、G時時濃度越低，溶液的濃度越低，溶液的pHpH越接近目的物的等電越接近目的物的等電點，沉淀所需點，沉淀所需PEGPEG的濃度越低。在一定范圍的濃度越低。在一定范圍內，高分子量和濃度高的內，高分子量和濃度高的PEGPEG沉淀的效率高。沉淀的效率高。n理論依據：理論依據：n認為沉淀作用是聚合物與生物大分子發生共沉淀作認為沉淀作用是聚合物與生物大分子發生共沉淀作用。用。n由于聚合物有較強的親水性，使生物大分子脫水而由于聚合物有較強的親水性，使生物大分子脫水而發生沉淀。發生沉淀。n聚合物與生物大分子之間以氫鍵相互作用形成復合聚合物與生物大分子之間以氫鍵相互作用形成復合物，在重力作用下形成沉淀析出。物，在重力作用下形成沉淀析出。n通過空間位置排斥，使液體中生物大分子被迫擠聚通過空