1、微生物實驗實驗七測定細菌生長曲線實驗目的1. 了解細菌生長曲線特征，測定細菌繁殖的代時；2. 學習液體培養基的配制以及接種方法；3. 反復練習無菌操作技術；4. 了解不同細菌，不同接種方法在同一培養基上生長速度的不同；5. 掌握利用細菌懸液混濁度間接測定細菌生長的方法實驗原理將一定量的細菌接種在液體培養基內，在一定條件下培養，可觀察到細菌的生長繁殖有一定的規律性， 如以細菌的活菌數的對數作縱坐標，以培養時間作橫坐標，可繪成一條曲線，成為生長曲線（如圖一） 。J11I1111|A1.211 1T0.3ibbin0.471r!11111030507090 110 時間圖一微生物生長曲線示意圖單細胞

2、微生物的發酵具有四個階段，即I調整期（延滯期）、II對數期（生長旺盛期）、川平衡期（穩定期）、W死亡期（衰亡期）。生長曲線可表示細菌從開始生長到死亡的全過程的動態。不同的微生物有不同的生長曲線，同一種微生物在不同的培養條件下，其生長曲線也不一樣。因此，測定微生物的生長曲線對于了解和掌握微生物的生長規律是很有幫助的。測定微生物生長曲線的方法很多，有血球計數板法、平板菌落計數法、稱重法和比濁法等。本實驗采用比濁法測定，由于細菌懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可利用 分光光度計測定細菌懸液的光密度來推知菌液的濃度。將所測得的光密度值（OD600）與其對應的培養時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長

3、曲線。注意，由于光密度表示的是培養液中的總菌數， 包括活菌與死菌，因此所測定的生長曲線的衰亡期不明顯。從生長曲線我們可以算出細胞每分裂一次所需要的時間，即代時，以 G表示。其 計算公式為：(lgW2 lgWi)/lg2式中t1和t2為所取對數期兩點的時間；W1和W2分別為相應時間測得的細胞含量（ g/L）或OD。實驗儀器、材料和用具1. 實驗材料：大腸桿菌，枯草桿菌菌液及平板；2. 培養基：牛肉膏蛋白月東葡萄糖培養基3. 實驗儀器：取液器（5000ul, 1000ul各一支）;培養箱，搖床，722s分光光度計；4, 實驗用具：無菌1000ul吸頭80個;無菌5000ul吸頭2個此色皿9個+共用

4、參比杯一個四、 實驗步驟37C振蕩培養18h,另1. 準備菌種：將細菌接種到牛肉膏蛋白月東葡萄糖三角瓶培養基中,外準備單菌落平板各 1塊2. 分為三個小組:第（1）小組100ml培養基100ml培養基100ml培養基37 C 200rpm37 C 200rpm37 C 200rpm取1.0ml大腸桿菌菌液接種到取3.0ml大腸桿菌菌液接種到取5.0ml大腸桿菌菌液接種到 第（2）小組取一個大腸桿菌菌落接種到100ml培養基， 37 C 200rpm取1.0ml大腸桿菌菌液接種到 100ml培養基，37 C 110rpm30 C 200rpm37 C 200rpm30 C 200rpm37 C

5、110rpm取1.0ml大腸桿菌接種到100ml培 養基, 第（3）小組取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培 養基, 取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培 養基, 取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培 養基,每培養一小時取樣一次（2.5h,3.5h加測1次）.對照組測量起始pH,所有瓶子測量發酵9h結束測pH.3. 測量：選用600nm波長，以蒸儲水作為參比，開始培養前測定每組培養液的 OD值 作為起始點。開始培養后，每小時吸取測定一次OD值。五、 實驗結果及分析1.實驗數據：表一三個小組時間-OD數據開始取樣時間10:5512：0112:3913:1713:53結束取樣時間P 9:55

6、11:0112:0912:4713:2313:59發酵時間1 0122.51 33.5ODt大腸杵菌單菌落0.0040.0240.0270.0270.0250.03637 C 110rpm-0.0100.0490.1640.2550.3120.32730 C 200rpm-0.0100.0430.0880.1580.2420.3611.0mL0.0100.0700.1580.2660.3720.4363.0mL0.0390.0960.2570.3730.4200.4515.0mL0.0670.1340.3020.3610.3340.456草菌 枯桿37 C 200rpm0.0080.0230.

7、0760.1320.1840.25430 C 200rpm0.0130.0320.0520.0880.0910.12537 C 110rpm0.0070.0170.0980.1300.2300.253OD=ODt-OD(大腸單菌落0.0040.0200.0230.0230.0210.03237 C 110rpm-0.0100.0590.1740.2650.3220.33730 C 200rpm-0.0100.0530.0980.1680.2520.3711.0mL0.0100.0600.1480.2560.3620.4263.0mL0.0390.0570.2180.3340.3810.4125

8、.0mL0.0670.0670.2350.2940.2670.389枯草-桿菌-37 C 200rpm0.0080.0150.0680.1240.1760.24630 C 200rpm0.0130.0190.0390.0750.0780.11237 C 110rpm0.0070.0100.0910.1230.2230.246開始取樣時間14:2915:3516:4317:5018:5719:0720:12結束取樣時間P 14:3515:4316:5017:5719:09P 20:0721:12發酵時間45678910ODt大腸杵菌單菌落0.0650.2670.3950.4540.45737 C

9、 110rpm0.3330.3400.3420.3600.36230 C 200rpm0.4390.5660.5700.5880.5861.0mL0.4640.4460.4460.4580.4403.0mL0.4870.4700.4570.4830.4585.0mL0.4690.4570.4640.4820.478草菌 枯桿37 C 200rpm0.3370.4280.5170.5900.6860.7110.71130 C 200rpm0.1710.2610.3700.5400.6280.6060.65237 C 110rpm0.2950.3020.3050.3050.3520.3520.37

10、8OD=ODt-OD 0大腸杵菌單菌落0.0610.2630.3910.4500.453r 37 C 110rpm0.3430.3500.3520.3700.37230 C 200rpm0.4490.5760.5800.5980.5961.0mL0.4540.4360.4360.4480.4303.0mL0.4480.4310.4180.4440.4195.0mL0.4020.3900.3970.4150.411枯早桿菌37 C 200rpm0.3290.4200.5090.5820.6780.7030.70330 C 200rpm0.1580.2480.3570.5270.6150.5930

11、.63937 C 110rpm0.2880.2950.2980.2980.3450.3450.3712.作圖、簡要分析及代時計算：1）取一個大腸桿菌菌落接種到100ml培養基，37 C 200rpm圖一單菌落大腸桿菌生長曲線這條曲線屬于比較標準的“ S”形曲線，很容易看出調整期和對數期，由于單菌落菌較少，而且從固體培養基轉移至液體培養基環境變化較大，所以出現了長達4小時的調整期,但可以看出，調整期之后這瓶菌都生長良好。計算代時：取培養4小時到5小時之間的數據（對數生長期）來計算代時。由代時計算公式,t2 ti=1h Wi=0.061W2=0.263代時G =1h(lgW2 -lgW1)/lg2

12、=0.474h(1g 0.263-lg 0.061)/lg22）取1.0ml大腸桿菌菌液接種到 100ml培養基，37 C 110rpm時間/h人4 5 3 5 2 50.3 5.2O-. 1 0 o o Edom 斜6盅啜4<0010_0 050-0 05圖二大腸桿菌菌生長曲線（取1.0ml大腸桿菌接種到100ml培養基，37 C110rpm）接種后幾乎沒有調整期出現，大腸桿菌很快適應了新的環境并開始呈指數增長，估 計是新的培養環境和原有環境較一致，而且在培養最初的時候溶氧和酸堿度都較為 適宜，但是這瓶菌是穩定期 OD最小的，估計是培養基最初分裝不均產生的。計算代時：取培養 2小時到2

13、.5小時之間的數據（對數生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2 t1=0.5h W1=0.174 W2=0.265代時 G = = = 0.824h（lgW2 - lg叫）/lg2 （lg 0.265 - lg 0.174）/lg23）取1.0ml大腸桿菌菌液接種到 100ml培養基，30 C 200rpm應該是酶活性對細胞復制的影響所致。圖三 大腸桿菌生長曲線 （取1.0ml大腸桿菌接種到100ml培養基，30 C 200rpm） 可以看出溫度對大腸桿菌適應環境產生了一定的影響，使它在調整期滯留了較長的 時間，且在對數期增長較慢，計算代時：取培養2.5小時到3.5小時之間的數據（對數生長期

14、）來計算代時。由代時計算公式,t2 ti=lhWi=0.168W2=0.371t2 -t11h代時G =(lgW2 -lg叫)/lg2 (lg 0.371-lg 0.168)/lg2=0.875h4）取1.0ml大腸桿菌菌液接種到 100ml培養基，37 C 200rpm圖四 大腸桿菌生長曲線（取1.0ml大腸桿菌接種到100ml培養基，37 C 200rpm） 這是大腸桿菌培養的最適調節，可以看出其生長良好，調整期較短，對數期較長。計算代時：取培養 2小時到3小時之間的數據（對數生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2 t1=1h W1=0.148W2=0.362t2 - tl1h代時 &#

15、176; =(igw2 -lg叫)/lg2 一 (lg 0.362 - lg 0.148)/lg2 一 0.775h5）取3.0ml大腸桿菌菌液接種到 100ml培養基，37 C 200rpm(lEM 星成Koo圖五 大腸桿菌生長曲線 （取3.0ml大腸桿菌接種到100ml培養基，37 C 200rpm） 接種量的增加沒有產生太大的影響，生長曲線沒有太大變化。計算代時：取培養 2小時到2.5小時之間的數據（對數生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2 t1=0.5h W1=0.218W2=0.334代時G =(lgW2 - lg叫)/lg2(lg 0.334- lg 0.218)/lg2=0.

16、812h6）取5.0ml大腸桿菌菌液接種到 100ml培養基，37 C 200rpm圖六 大腸桿菌生長曲線（取 5.0ml大腸桿菌菌液接種到 100ml培養基，37 C200rpm）3小時出現了一次明顯的波動，應該是測量過程中沒有搖勻的結果，忽略它之后，這條生長曲線屬于正常形態，比較前兩天生長曲線，發現5mL得到的最大OD反而減小了，說明在一定量的培養基下，初始接種量對最后結果影響不大。最大OD應該是受到了最初添加培養基的影響。計算代時：取培養1小時到2小時之間的數據（對數生長期）來計算代時。由代時計算公式,t2 ti=1h Wi=0.067W2=0.235t2 - t11h代時 G = =

17、= 0 552h(lgW2 - lg叫)/ lg 2 (lg 0.235 - lg 0.067) / lg27）取1.0ml枯早桿園接種到 100ml培養基,37 C 200rpm圖七 枯草桿菌生長曲線 （取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養基，37 C 200rpm） 枯草桿菌的生長曲線包含了調整期、對數期和很小一部分穩定期，雖然穩定期很短，但是已經可以看出停止生長的趨勢，說明枯草桿菌的代時較長。計算代時：取培養 3小時到4小時之間的數據（對數生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2 t1=1h Wi=0.176 W2=0.246t2 -t11h代時G =(lgW2 TgWA)/lg2(

18、lg 0.246 - lg 0.176)/lg2= 1.108h8）取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養基,30 C 200rpm圖八 枯草桿菌生長曲線 （取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養基，30 C 200rpm）溫度降低后，生長變得緩慢了，最后達到的最大OD也更小了，代時加長。計算代時：取培養 4小時到5小時之間的數據（對數生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2 ti=1h Wi=0.158W2=0.248t2 -11h代時 G = = = 1.537h（lgW2 -lg叫）/lg2 （1g 0.248 - 1g 0.158）/1g 29）取1.0ml枯草桿菌接種到 100m

19、l培養基，37 C 110rpm圖九 枯草桿菌生長曲線（取 1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養基，37 C 110rpm）OD值明顯偏小，所7、8小時左右細4小時時，似乎由對數期進入了穩定期，但是對比前兩組數據，此時的 以分析，可能此時突然有外因影響，使細胞進入了調整期，可以看到后來 菌又有增長趨勢。計算代時：取培養 2.5小時到3小時之間的數據（對數生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2 t1=1h Wi=0.123W2=0.223代時G =(lgW2 -lg叫)/lg20.5h(lg 0.223-lg 0.123)/1g 2=0.582h3. 發酵結束pH對照組pH=7.5實驗結束后

20、所有瓶 pH均小于6.4pH全部降低，說明大腸桿菌和枯草桿菌發酵均產生了酸。4. 分析表二不同環境和菌種生長比較培養菌接種量培養溫度/ c搖床轉速/rpm生長曲線狀態代時/min調整期/h對數期/h穩定期OD俶8小時OD大腸桿 菌單菌落37200430.45328.51.0mL37110 1130.37249.41.0mL30200230.59652.51.0mL37200130.43046.53.0mL37200 1120.41948.75.0mL37200120.41133.1枯草桿 菌1.0mL37200260.67866.530200 1350.61592.237110130.3453

21、4.91）接種量對微生物的影響：預期：接種量大，調整期縮短，對數期增長，穩定期 OD增大，代時縮短。原因：接種量大的細胞基數大，因而更快適應環境。實際：調整期影響不大，對數期稍有縮短，穩定期OD減小，代時規律不明顯。分析：生長曲線受各種因素調節，這里實驗結果不同于預期應該是受到培養基的限 制，接種量大對氧氣和原料需求更多，而且產生酸的速度也快，也許對后來的細胞 生長造成了 一定的影響。2）培養溫度對微生物的影響預期：最適溫度下細胞生長應該最快，調整期最短，穩定期 OD最大，代時最短 原因：溫度影響細菌內酶活力和細胞膜的通透性，進而影響新陳代謝，從而影響細 菌的生長繁殖。最適溫度下，細菌酶活性最

22、強，因而能最快適應環境，并取得生長 增殖的最高效率。實際：大腸桿菌37C穩定期OD最大，調整期更短，但代時更長。枯草桿菌 37 C調 整期更短，對數期更長，穩定期OD更大，代時更短。分析：大腸桿菌代時的問題應該來自實驗誤差，如取樣未搖勻、計算時取點不夠準確，或實驗過程中某些操作導致生長和理論不一致。3）搖床轉速對微生物的影響預期：轉速高，調整期短，對數期長，穩定期 OD大，代時短原因：轉速影響溶氧，溶氧高，生長情況應該越好實際：大腸桿菌與預期符合；枯草桿菌轉速快的調整期長，代時長。分析：原因可能有兩點，一是枯草桿菌在溶氧高的環境下生長沒有那么好，說明它 是微好氧生物，但這與實際不符；二是其他條

23、件限制，雖然說兩個培養瓶進行對照 要求其他條件一致，但是由于培養基分配及其其他各種原因，其他條件可能并不一 致而且還產生了比對照條件還要大的影響。4）生長曲線分析兩個菌的生長曲線都包括了調整期、對數期和穩定期，實驗沒有進行到衰亡期因為而沒有觀察到后來的 OD值下降。5）大腸桿菌和枯草桿菌比較大腸桿菌：代時要短一些，溫度對代時的影響比溶氧對代時的影響要大，估計是因 為溶液中細胞不多，所以溶氧的限制作用沒有溫度明顯。枯草桿菌：代時較長，溶氧比溫度對代時的影響要大，但這也可能是實驗操作中其 他因素影響而得出的表觀結果。六、實驗小結這是一個大組合作、小組分工的實驗，每一組的結果都影響了整個大組隊結果的

24、分析，這就要求我們的合作。 和暑期實驗不同，這次實驗在時間上縮短了，但是在內容上卻增多了，由于有很多組的平行比較，所以得到的信息量也相應加大，這些信息中又包含了這種各樣的誤差，所以要求我們自己在處理別人的實驗結果中也加入自己的分析。總的來說，這是個很有意思也很有意義的實驗。七、思考1. 計算出大腸桿菌和枯草芽抱桿菌在牛肉膏蛋白腺葡萄糖培養基中對數生長期中的代時（min）（繁殖一代的時間），為什么比理論時間長好多？代時見表二。經查資料得：大腸桿菌理論代時為37度時18分鐘，而枯草桿菌一般是給 30度下的理論代時為31分鐘，實驗測得代時長于理論值的原因：理論代時是在理想的培養條件下測得，糖分、氧氣等營養物質供應充足，細菌生長 狀況良好，之前的分裂次數較少。實際實驗條件與理論值條件存在差距。如培養過程中 不補料，營養物質有限。單純的振蕩不能保證體系中有足夠的溶氧。對培養液的pH值,氧化還原電勢也未加控制，測量過程中溫度不能保持穩定等等。2. 為什么可用比濁法來表示細菌的相對生長狀況？培養液的渾