1、產(chǎn)蛋白酶 K 畢赤酵母重組菌株高密度發(fā)酵及酶學(xué)性質(zhì)分析姓名：李善軍學(xué)號(hào)：2015304120225院系：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生科院摘要 蛋白酶 K 具有極高的酶活性和廣泛的底物特異性 , 在核酸純化、絲綢、 醫(yī)藥、食品和釀造等領(lǐng)域蛋白酶 K 都有著重要的應(yīng)用。畢赤酵母是近十幾年來(lái) 發(fā)展起來(lái)的真核表達(dá)體系，將蛋白酶 K 在畢赤酵母中重組表達(dá)將是突破其高效 表達(dá)的一個(gè)重要步驟。 本實(shí)驗(yàn)利用產(chǎn)蛋白酶 K 的畢赤酵母基因工程菌進(jìn)行高密度 的液體發(fā)酵， 掌握畢赤酵母菌全自動(dòng)液體發(fā)酵工藝， 同時(shí)對(duì)的到產(chǎn)物酶酶學(xué)性質(zhì) 進(jìn)行分析。經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，畢赤酵母基因工程菌發(fā)酵最高密度達(dá)到濕重 283.97g/L，得到的蛋白酶

2、 K最大酶活為29000U,蛋白酶K的分子質(zhì)量為31ku, 最適溫度為65度，最適PH為8, Na+ K+、Ca+和Mg+寸蛋白酶K酶活有促進(jìn)作 用，而Ni+和Zn+對(duì)酶活反應(yīng)則是抑制作用。關(guān)鍵詞：蛋白酶K、畢赤酵母菌、高密度發(fā)酵、酶學(xué)分析本實(shí)驗(yàn)的蛋白酶 K 屬絲氨酸蛋白酶類，它是林伯氏白色念球產(chǎn)生的一類主 要蛋白酶。因能合成該種蛋白酶的微生物能在以角蛋白為唯一碳氮源的環(huán)境中生 長(zhǎng)，故將其稱作蛋白酶 K 。蛋白酶 K 具有極高的酶活性和廣泛的底物特異性， 能優(yōu)先分與疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸 C 末端鄰接的酯鍵和肽 鍵，常被用于降解蛋白生產(chǎn)短肽。利用其這個(gè)特性，在核酸純化、絲綢、醫(yī)

3、藥、 食品和釀造等領(lǐng)域蛋白酶 K 都有著重要的應(yīng)用。由于林伯氏白色念球菌生長(zhǎng)緩 慢難以達(dá)到高密度培養(yǎng)的目標(biāo)，而且菌體在產(chǎn)生蛋白酶 K 的同時(shí)還會(huì)分泌表達(dá) 其他蛋白酶， 加之對(duì)林伯氏白色念球菌的基因操作比大腸桿菌、 酵母菌和枯草芽 孢桿菌等常用基因工程菌困難許多， 這些都給蛋白酶 K 的高效大規(guī)模生產(chǎn)帶來(lái)困 難。畢赤酵母是近十年來(lái)發(fā)展起來(lái)的真核表達(dá)體系 , 它的生長(zhǎng)環(huán)境除了包括十分環(huán) 保而廉價(jià)的無(wú)機(jī)鹽， 微量元素和必須的碳氮源外， 還要添加生物素， 甲醇能夠作 為它的唯一碳源保證其生長(zhǎng)。將蛋白酶 K 在畢赤酵母中重組表達(dá)將是突破其高 效表達(dá)的一個(gè)重要步驟。 本實(shí)驗(yàn)對(duì)產(chǎn)蛋白酶 K 的畢赤酵母基因工

4、程菌高密度液體 發(fā)酵工藝進(jìn)行探討，并對(duì)產(chǎn)物酶蛋白酶 K 的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，使對(duì)產(chǎn)蛋白酶 K 的畢赤酵母基因工程菌及其產(chǎn)物有一個(gè)較為深刻的理解。1、產(chǎn)蛋白酶 K 的畢赤酵母基因工程菌高密度液體發(fā)酵1.1 種子液培養(yǎng)1.1.1 種子培養(yǎng)基YPD培養(yǎng)基：酵母粉1%蛋白胨2%葡萄糖2% （瓊脂1.5%）YPG培養(yǎng)基：酵母粉1%蛋白胨2%甘油2%1.1.2 培養(yǎng)溫度與菌齡挑取YPD平板上的單菌落（生科院發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室）到8瓶100/500 mLYPG培 養(yǎng)基中，30C, 250 r/min 搖床培養(yǎng)28h。1.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)1.2.1 菌體培養(yǎng)清洗干凈發(fā)酵罐，校正pH DO電極后插入發(fā)酵罐，加入 20LB

5、SM（配方見(jiàn)下 表）無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，115C 20min滅菌，完成后冷卻至30C。通過(guò)補(bǔ)料泵調(diào)節(jié)pH 值為5.0，按4%1 勺接種量接種種子液，并加入頭抱 1g，PTM1為微量鹽87ml（4.35ml/L發(fā)酵液），通氣攪拌發(fā)酵。甘油分批階段完成時(shí),碳源耗盡，DO急劇 上升，時(shí)間為24h。此時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加50%T油進(jìn)入甘油補(bǔ)料階段，時(shí)間為 6h。BSM:CaSO&SOMgSO7H2OKOH磷酸甘油20L18.6g364g298g82.6g500ml500ml1.2.2甲醇誘導(dǎo)開(kāi)始進(jìn)行碳源饑餓0.5h，開(kāi)始補(bǔ)加甲醇進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶階段。同時(shí)注意溫度保持在30度，罐內(nèi)壓0.05MP,轉(zhuǎn)速500r/

6、min,控制甲醇的流速，每6個(gè)小時(shí)取 樣，測(cè)量菌體生物量。2、酶學(xué)性質(zhì)鑒定2.1酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作準(zhǔn)確稱取干燥的酪氨酸，配置0、20、30、40、40、50、60、70、80ug/ml的酪氨酸溶液。用試管分別吸取不同濃度的酪氨酸1ml，各加入0.4ml的碳酸鈉5ml，再加入已稀釋的福林試劑1ml，搖勻放入水浴鍋中。40度保溫發(fā)色20min, 在分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定（660nm，測(cè)3次，取平均值。將各濃度的酪氨酸測(cè)得 OD值減去0ug/ml的酪氨酸OD值得到凈OD值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖1:酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線L Fg 口度濃2.2 確定反應(yīng)最適 ph配制 50 mmol/L pH 6.0 、pH 7.

7、0 、pH 8.0 、pH 9.0 、pH 10.0 、pH 11.0 、pH 12.0、pH 13.0的緩沖液。取1 mL不同pH稀釋合適倍數(shù)的粗酶液，加入 1 mL 用相同pH緩沖液配制的底物，混勻，65C反應(yīng)10 min。以O(shè)D660最高的酶活為 100%，計(jì)算不同 pH 條件下的相對(duì)酶活。2.3 確定反應(yīng)最適溫度1）配制合適的 ph 緩沖液，將粗酶液稀釋合適的倍數(shù) （根據(jù)前面的實(shí)驗(yàn)得到 最適 ph）。2）取稀釋好的酶液1 mL,加入1 mL2%勺酪蛋白底物，分別在20C, 30C, 40C, 50C，60C，65C，70C，80C 中反應(yīng) 10 min,再加入 2 mL TCA 溶液終

8、止反應(yīng)，再保溫 20 min ；3）12000 r/min 離心 2 min。取上清 1 mL，加入 5 mL Na2CO和 1 mL 稀釋 的福林試劑，40C保溫20 min。4）取 3 mL 加到石英比色皿中，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定OD660 ，以 OD660最高的酶活為 100%，計(jì)算不同溫度條件下的相對(duì)酶活。2.4 酶活檢測(cè)取試管 2 支，編號(hào) 1,2 ，每管內(nèi)加入樣品（各個(gè)樣品都需要做）稀釋液（根據(jù)前面實(shí)驗(yàn)得到最佳ph進(jìn)行緩沖）1mL置于65C（得到最佳反應(yīng)溫度）水浴 中預(yù)熱2min,再各加入經(jīng)同樣預(yù)熱的2%各蛋白（緩沖液配制）1mL，精確保溫 10min,時(shí)間到后，立即再各加入 0

9、.4mol三氯乙酸2mL以終止反應(yīng)，繼續(xù)置于 水浴中保溫20min,使殘余蛋白質(zhì)沉淀后離心或過(guò)濾。然后另取試管 2支，編號(hào) l, 2 ，每管內(nèi)加入濾液1mL再加0.4mol碳酸鈉5mL已稀釋的福林試劑1mL 搖勻，40C保溫發(fā)色20min后進(jìn)行光密度（OD）測(cè)定。將實(shí)驗(yàn)組OD值減去對(duì)照組 ODfi得到凈ODfi。將得到凈ODfi帶入公式：樣品蛋白酶活力單位 =A/10*4*N式中：A由樣品測(cè)得OD值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得相當(dāng)?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)（或OD值）;44 毫升反應(yīng)液取出 1ml 測(cè)定（即 4倍）；N酶液稀釋的倍數(shù)；10反應(yīng)時(shí)間10mi n。一個(gè)單位酶活（U定義為：在65C下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生 lu

10、g 酪氨酸所需要的酶量2.4金屬離子對(duì)蛋白酶活性的影響根據(jù)最適pH和2%勺酪蛋白底物配制反應(yīng)體系，并分別添加鈉、鉀、鈣、鎂、 鋅、鎳的金屬離子鹽，使反應(yīng)體系中金屬離子終濃度分別為 1 mmol/L、5 mmol/L、 10 mmol/L，在最適條件下測(cè)定蛋白酶活性2.5 SDS-PAGE 電泳測(cè)取發(fā)酵54h、60h、66h、84、90h和96h粗酶液，加入少量溴酚藍(lán)溶液進(jìn)行點(diǎn) 樣，同時(shí)有標(biāo)準(zhǔn)酶作為對(duì)照。電泳條件：點(diǎn)樣：沸水浴5 min，點(diǎn)樣量10ul （不稀釋）預(yù)跑：30v，5min壓縮膠：80V, 30min ;分離膠：160V,直至溴酚藍(lán)跑出膠的底部3、結(jié)果與分析3.1反應(yīng)最適ph測(cè)定將產(chǎn)

11、物酶在不同ph緩沖液中反應(yīng)，結(jié)果如圖2所示：pH曲線100 I亠*丄*Bo60II211312109876th圖2蛋白酶K最適反應(yīng)ph從結(jié)果可以看出，產(chǎn)物酶在ph8和10時(shí)活性最高，在ph7-11之間，酶的活性 能達(dá)到80%以上，低于ph7或高于ph11時(shí)，酶活性快速下降。3.2反應(yīng)最適溫度將得到的產(chǎn)物酶置于40、50、60、65、70、80度下進(jìn)行反應(yīng)，所測(cè)的相對(duì)酶活結(jié)果如圖3;圖3蛋白酶K最適反應(yīng)溫度從上圖可以看出，蛋白酶最0-70度之間蛋白酶K都有著很高的活性，但到80度是，酶活性急劇下降，下降了約 90%3.3畢赤酵母基因工程菌發(fā)酵生物量與產(chǎn)物酶酶活測(cè)得畢赤酵母基因工程菌在不同發(fā)酵時(shí)間

12、時(shí)的生物量及所在時(shí)間產(chǎn)物酶的 活性大小結(jié)果如圖4;生物量 酶活24303642485460667278849096102 10830000_ 25000 20000U.15000 活酶-10000-50000時(shí)間(h)圖4工程菌生物量與產(chǎn)物酶酶活從上圖可知，在36h之前畢赤基因工程菌保持生殖生長(zhǎng)階段，工程菌數(shù)量快速增 長(zhǎng)，在此階段重組酶基因極少表達(dá)，重組酶極少。 36h之后，工程菌數(shù)量進(jìn)入穩(wěn) 定期，菌株開(kāi)始表達(dá)次級(jí)代謝產(chǎn)物，酶活也不斷增加。3.4粗酶液的SDS-PAG電泳ku 66h60 h 54h M 96h90h84h97.466243.03L021 014.4圖5蛋白酶K的SDS-PAG

13、分析SDS-PAGE電泳結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物的分子質(zhì)量約為 31ku,隨著時(shí)間的推移目標(biāo)蛋 白表達(dá)量趨于穩(wěn)定。3.5金屬離子對(duì)酶活反應(yīng)的影響將粗酶液放置于不同濃度的金屬離子溶液中進(jìn)行反應(yīng)，得到的結(jié)果如下圖所 示。從結(jié)果可知，鈉離子、鉀離子、鈣離子和鎂離子對(duì)酶活反應(yīng)有促進(jìn)作用，只 有在一定濃度范圍內(nèi)促進(jìn)作用明顯， 低于或超過(guò)濃度，促進(jìn)作用會(huì)下降。而鎳離 子和鋅離子對(duì)反應(yīng)有抑制作用，且濃度越高抑制越明顯。金屬離子對(duì)酶活的影響1mmol/L 臼 5mmol/L 10mmol/L100%80%60%40%20%0%-20%-40%-60%-80%-100%4、討論本實(shí)驗(yàn)利用畢赤酵母菌株對(duì)蛋白酶 K進(jìn)行重組

14、表達(dá)，并通過(guò)研究高密度 液體發(fā)酵和酶學(xué)性質(zhì)得到了其最優(yōu)的培養(yǎng)條件和酶活性發(fā)揮的最佳條件。 從結(jié)果可知，在發(fā)酵時(shí)間在96h時(shí)，生物量能達(dá)到282g/ml，說(shuō)明了畢赤酵 母菌在高密度發(fā)酵有著很大發(fā)展空間。本實(shí)驗(yàn)對(duì)得到的蛋白酶K進(jìn)行了一些列的性質(zhì)測(cè)定，包括最適ph、反應(yīng)溫度、金屬離子對(duì)其影響。分析發(fā)現(xiàn)， 重組蛋白酶K最適溫度是65度，但是該酶對(duì)溫度要求并不苛刻，在 30度 -70度的范圍內(nèi)都有酶活性，并能保持在相對(duì)酶活在70%以上，這更好的證明了為什么這種重組蛋白酶 K會(huì)有更廣闊的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)同樣還有一些工作有待完善和改進(jìn)。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了一些畢赤酵母 基因工程菌高密度液體發(fā)酵的參數(shù)，在一定程度上能提高表達(dá)量和酶活， 但結(jié)果并沒(méi)達(dá)到令人滿意的結(jié)果，可以繼續(xù)通過(guò)優(yōu)化菌株和發(fā)酵罐發(fā)酵條 件來(lái)優(yōu)化表達(dá)條件，提高蛋白酶 K的表達(dá)量。5、參考文獻(xiàn)黃君，張昌毅，趙述淼，梁運(yùn)祥 . 黑曲霉內(nèi)切 _1_4_葡聚糖