1、項目名稱：首席科學家:起止年限:抗體-抗原分子識別的結構基礎和功能研究郭亞軍中國人民解放軍第二軍醫大學2010年1月-2014年8月總后勤部衛生部上海市科委依托部門:一、研究內容擬解決的關鍵科學問題包括：1. 抗體研究平臺的系統性抗體分子識別研究的一個重要條件是建立系統的、多層次和多角度的抗體研 究平臺。目前采用生物學方法結合原子層面的結構分析遠遠不能滿足研究的需 要。如何建立一個可針對多狀態（靜態與動態）、多層次（原了一分了一細胞） 和多角度（量子力學、牛頓力學和熱力學）的系統研究平臺是本項目擬解決的一 個關鍵問題。我們采用結構生物學結合計算生物學和功能驗證的策略，建立抗體 “虛擬設計預測和

2、驗證”研究體系，發展和完善已建立的抗體研究生物技術平 臺。2. 抗體抗原特異識別的可模擬性免疫識別和結合是發生在抗體分子與抗原分子特定位置、特定片段之間的互 相匹配和吻合的過程。這種特異性相互作用是完全基于一級序列折疊后的三級結 構，對應的蛋白質空間表面特征是揭示分子識別規律的基礎。在已構建的抗體- 抗原復合物庫（平臺）和前期973所建立的技術平臺基礎上，跨生物學、計算機、 統計、數學等學科，引入地理信息系統（gis）的“空間信息分析與模型分析” 功能，對抗原抗體分子識別進行分析與模擬，并結合其它子課題進行生物學試 驗驗證。3. 抗體抗原分子相互作用的規律性分子識別必然存在著其普遍意義上的規律

3、，在遺傳密碼之外還應該存在著 “結構密碼”，對分子識別規律的了解將能夠大量獲得特定功能的蛋白質。抗體 分子的一系列重要生物學功能均與抗體分子特異性識別有緊密關系，對抗體分子 識別規律的闡明，是本項目需要解決的重要關鍵科學問題。利用已建立的各種生 物抗體庫和抗體虛擬設計平臺，通過抗體的虛擬設計抗體分子的結構，預測抗體 功能，結合生物手段和生物信息技術，解析抗體分子的識別規律。對抗體分子識 別規律的闡明也將為其它牛物大分了識別規律的研究奠定理論基礎。以我們已有 的晶體結構明確的抗原表位為研究模型，在虛擬設計和生物驗證的研究平臺上采 用從生物一一虛擬一一模擬一一生物的策略才有可能準確、全面地研究抗體

4、分子 識別的規律。主要研究內容包括：1. 利用地理信息系統（gis）空間信息分析技術尋找抗體抗原表面結合位點識 別規律：在生物信息大規模抗體虛擬庫和抗體抗原分子識別的結構基礎上，統計抗體 抗原結合界面兩側的空間信息特征和特征，建立基于空間特征的蛋白質抗原空間 表位預測方法，進行抗體抗原分子識別的分子動力學模擬，采用地理信息系統 （gis）的“空間信息分析與模型分析”功能,發展空間比對技術，尋找抗體抗原 表面結合位點識別規律。2. 抗體抗原相互作用結構學基礎：綜合運用結構牛物學、計算生物學、免疫學、分子生物學和生物化學的方法, 以具有重要生物學功能的抗原和抗體分子為研究目標，構建抗原和抗體分子結

5、構 測定平臺，抗原表位測定的技術平臺，以及抗體生物學功能機制的分析平臺。綜 合運用x-射線晶體學、溶液核磁共振、冷凍電鏡、x-射線小角散射等多種結構 生物學手段測定抗體和抗原分子以及它們的復合物的在不同分辨率尺度上和不 同測定方法基礎上的三維結構信息，確定抗原分子上具有重要活性的功能表位， 揭示抗體特異性高效識別靶標抗原的結構基礎，闡明抗體發揮其生物學功能的分 子機理。3. 抗體抗原復合物的分子分布特征及功能識別基礎：利用近場光學顯微術結合熒光量子點標記技術對單個抗原抗體在細胞表面 的動態分布狀態進行可視化研究及數量化分析，結合單分子力譜測量技術和原子 力顯微成像術對抗原抗體分子間結合，解離的

6、動態過程給以精細探討。進一步闡 明在生理條件下抗原抗體相互作用機制，修正已建立的數學理論模型。4. 基于計算生物學的抗體分子設計及功能進化規律研究基于分子動力學（牛頓力學）和周期性邊界條件下的密度泛函理論（量子 力學）探討抗原-抗體相互作用的動態模式，建立基于結構的計算機虛擬突變技 術并用于抗體分子的功能進化。利用de novo建模、微觀組態相互作用理論獲得 抗體模擬多肽結構，設計全新功能性人源抗體分子及雙功能多價抗體分子，在此 基礎上探討抗體分子功能進化規律，為新型抗體分子功能的預測提供理論依據。5、抗體分子識別的功能進化規律：利用現有的人源fab抗體庫和噬菌體抗體庫技術與分子對接矩陣模式，

7、結 合人一人單克隆抗體技術及小鼠雜交瘤技術，進行基于抗體表位的高通量抗體篩 選；收集所產生的功能性抗體分子數據，建立充實“生物抗體數據庫”，結合結 構生物學的數據和計算生物學手段對抗體分子識別特點進行研究，尋找抗體分子 識別和發揮功能的規律。利用分子牛物學、細胞牛物學等方法對通過計算牛物學 獲得的抗體分子進行克隆和表達，在細胞或動物模型上研究抗體分子的生物學功 能，對抗體分子識別的作用規律進行系統研究。二、預期目標總體目標：以建立“抗體結構和功能”的創新研究體系、尋找抗體抗原分子識別的結 構基礎和作用規律為研究目標，本著“突出我國優勢領域、著重解決符合重大需 求的關鍵問題、瞄準國際基礎理論前沿

8、”的原則，在上一個973計劃項目中所建 立的生物信息學、生物大分子立體結構研究、數據挖掘技術以及抗體分子功能研 究等技術平臺上，建立抗體抗原相互作用規律研究的創新體系，探討適用于功能 性抗體分子發現的通用性規律，爭取獲得源頭創新性硏究成果，加快我國牛物信 息學、計算生物學、結構生物學和生物學的銜接和交叉，培養出一批高水平的各 學科交叉型學術研究梯隊。五年預期目標：1. 建立抗體分子識別及作用規律的系統研究平臺，開發并豐富生物信息學 和計算生物學新算法，模擬抗體抗原相互作用進程，發現抗體分子識別及發揮作 用的規律。2. 結合與交叉利用分子生物學，免疫學，結構生物學，計算機科學等眾多 相關領域的基

9、礎理論和技術，通過“表位預測與驗證一抗體分子模擬一結構解析 分子設計及預測一生物功能驗證”這一流程，建立抗原和抗體相互作用研究系 統。3. 基于已建立的生物信息數據庫，通過理論模擬和數理統計方法進行抗體 分子設計及功能預測。采用地理空間信息分析系統和計算生物學等方法抽提推導 抗體與抗原相互作用的規則或模式，從而虛擬設計出與抗原結合的抗體分子結 構，推測其功能，并用可視化手段進行動態檢測和驗證。4. 對“虛擬設計”所得抗體分子采用生物技術實驗手段進行克隆和表達， 分析抗體分子與功能性抗原表位相互作用方式，在細胞和（或）動物模型上研究 抗體分子的生物學功能，對抗體分子“虛擬設計預測體系”進行系統研

10、究，找出 抗體分子識別的通用性規律。5. 在sci收錄的學術期刊上發表論文120篇以上，30篇以上發表在相關領 域的國際權威刊物；取得具有國際彫響的原創性學術成果4-8項，申報發明專利 20項。三、研究方案本研究以闡明“抗體分子識別的結構基礎與作用規律”為冃標，采用地理 空間信息分析技術平臺和掃描探針/量子點標記技術，結合已擁有的抗體生物功 能分析系統，組織計算生物學、結構牛物學、功能基因組學、蛋白質組學和免疫 學等優勢力量，開展多學科綜合性研究。力圖通過對抗體分子識別機制與作用規 律的發現，為快速尋找滿足人們需要的特定功能的蛋白質（抗體）奠定理論基礎。2. 技術途徑：本項n基于前一個973計

11、劃項n已建立的抗體虛擬篩選技術平臺、晶體結構 解析平臺和高通量抗體功能驗證平臺，利用生物信息技術和生物抗體數據庫，總 結抗原抗體相互作用的表面分子特征，預測參與相互作用的關鍵位點，進行抗體 分子模擬，采用多種結構生物學手段，在不同層面和角度解析抗原抗體復合物的 結構，并在此基礎上，利用計算生物學的技術途徑進行分子設計及預測，最后通 過生物、物理、化學等綜合技術手段在細胞水平和動物模型屮進行功能驗證，尋 找適用于功能性抗體分子識別和作用的通用性規律。3. 創新點與特色：1）在前一個973計劃項目研究的基礎上，開創性地建立可針對多狀態（靜態與 動態）、多層次（原子一分子一細胞）和多角度（量子力學、

12、牛頓力學和熱 力學）的抗體結構與功能系統研究平臺。2）在己建立的“抗體生物信息庫”的基礎上，引入地理信息系統（gis）的“空間信息分析與模型分析”功能，對抗原抗體分子識別結構進行分析與模擬， 并對功能進行預測。3）采用結構生物學并結合計算生物學以及功能驗證的策略，建立抗體“虛擬設 計預測和驗證”研究體系，利用de novo建模、微觀組態相互作用理論獲得 抗體模擬多肽結構，設計全新功能性人源抗體分子及雙功能多價抗體分子， 在此基礎上探討抗體分子功能進化規律。4）利用近場光學顯微術結合熒光量子點標記技術對單個抗原抗體在細胞表而的 動態分布狀態進行可視化研究及數量化分析，結合單分子力譜測量技術和原

13、子力顯微成像術對抗原抗體分子間結合，解離的動態過程給以精細探討。闡 明在牛理條件下抗原抗體相互作用機制。5）本項目可為已立項的重大基礎研究項目，如免疫學、蛋口質組學、腫瘤學、 干細胞研究和國家新藥創制重大專項等以及其他前沿技術領域提供有利的 支持。4. 可行性分析：1）研究目標明確：在前一個973計劃項目的支持下己建立的生物信息學、生物 大分子立體結構研究、數據挖掘技術以及抗體分子功能研究等技術平臺的基 礎上，建立擁有自主知識產權的抗體分子與功能研究的創新體系，找出適用 于功能性抗體分子識別的通用性規律，并將研究成果推廣到其它的生物大分 子的研究中，爭取獲得源頭創新性研究成果，加快我國生物信息

14、學、計算生 物學、免疫學、蛋白質組學和功能基因組學的銜接和交叉，培養出一批高水 平的各學科交叉型學術研究梯隊。2）研究隊伍：本項目的科研隊伍主體均為來自國家及部門重點實驗室的優秀中 青年專家，團隊成員包括國家杰出青年基金獲得者、總后科技金星和新星、 教育部新世紀創新人才、上海市“曙光計劃”和“浦江計劃”人才，還擁有 教育部和上海市科技創新團隊。項目組在計算生物學、機構牛物學、生物信 息學及抗體分子功能研究等領域積累了豐富的經驗。3）五年來在前一個973項目的支持下，在相關研究領域取得的工作基礎與積累 為協作攻關奠定了基礎：建立了國際領先水平的抗體信息數據庫和結構分析 及人規模篩選的技術平臺，尤

15、其是利用抗原表位與抗體共結晶進行立體建 模，并在此基礎上利用計算機虛擬突變技術制備高親和力功能性抗體分子。 應用抗體抗原共結晶技術，在國際上首次解析了兩種重要的單抗藥物"rituximab”和"efalizumabv的品體結構，并比較了不同抗體親和力差 異的結構學基礎；闡明了 "rituximab” 與 cd20、"efalizumab” 與 cdlla 結合的結構與作用機制，文章分別發表于jbc和pnaso在此基礎上，設計表 達了全新結構和高效功能的抗cd20四價抗體。文章發表于cancer res.。以 上成果為功能性抗體分子的研究提供了理論基礎和新

16、的技術方法。這些基礎 研究領域的突破為本項目的研究奠定了堅實的基礎。4）國家發改委、國家科技部和上海市科委也相繼投入經費用于本項目相關基礎 設施的建設。本項目的研究單位均具有優良的研究條件，并在計算生物學、 生物信息學、結構生物學及抗體分子研究領域積累了豐富的工作基礎。在前 一個973項目的基礎上，國家發改委批準建立了 “抗體藥物國家工程研究屮 心”，為本項目的順利進行，提供了有力的技術及硬件設備上的支持。通過 多方面協作攻關，形成了一支各學科配置合理，組織協調得力，攻關能力較 強的科研隊伍，為本項目的順利實施奠定了基礎。5、課題設置課題1、基于生物信息學的抗原抗體分子識別與系統模擬預期目標：

17、在己經建立的牛物信息大規模抗體虛擬庫和己知抗原信息的基礎上，解析 抗體抗原分子識別的結構基礎和特征，結合計算生物學、分子動力學技術，引 進地理信息系統（gis）空間信息分析技術來掃描提煉抗體抗原表而結合位點識 別規律，實現蛋白質抗原的空間表位預測以及抗體結合位點模擬預測。研究內容：1. 抗體抗原結合界面兩側的空間信息特征統計研究外界抗原千變萬化，但是抗體在幾個氨基酸上的變化就能特異性識別不同抗 原，抗體識別抗原空間結構的策略具有重要科學意義。目前抗體-抗原的相互作 用研究多集中于對抗體和抗原結合位點一級序列以及二級結構特征的提取，往往 對蛋白質表面三維空間信息特征描述不夠充分，影響進一步的抗體

18、抗原相互作用 本質研究。我們將跨學科收集所有可能的空間結構描述特征，在前期抗體結合界 而的統計基礎上，重點開展結合位點兩側的三維界而微環境分析，包括凸凹性， 相鄰性，構象性，結合片（patch）的化學和物理特征等，結合不同種屬，不同 抗原類別，與非免疫復合物相互作用界面的分析特征進行比較，得出抗原抗體界 而三維特異性.2. 基于空間特征的蛋白質抗原空間表位預測方法基于上面抗原一側空間表位的特性，從中提取出分辨效果較好的特性，用于 不連續表位的計算預測。通過牛物信息學方法將特征進行量化和程序化，并與現 有的各種線性表位特性，包括氨基酸傾向性、疏水性、表面可及性等化學性質結 合，建立新的b細胞不連

19、續抗原表位預測方法。交給其它課題驗證.3. 抗體抗原分子識別的分子動力學模擬與統計研究蛋白相互作用實際上是在溶劑環境下的柔性吸引與對接，抗體抗原的識別與 相互作用其實就是抗原抗體的相互接近與選擇，我們將采用多軌跡的分子動力學 模擬研究抗體抗原全原子的溶劑模型，通過長時間的模擬，然后通過數理統計的 方法研究界而每一殘基在三維空間的疏水與氫鍵相互作用，以及它們出現的幾 率，從而確定穩定抗體抗原識別的一系列關鍵殘基。此外我們將采用高溫下的 分子動力學模擬研究抗原表位與抗體的結合如何影響抗原的折疊，通過動力學與 等高線圖分析確定抗原折疊的時間尺度以及可能的折疊路徑，從而闡明抗體與抗 原分子識別的結構動

20、力學基礎。4. 抗原空間表位相似性搜索，以及與抗體結合界而的空間比對與模擬免疫識別和結合是發生在抗體分子與抗原分子特定位置、特定片段z間的互 相匹配和吻合的過程。這個過程中間，化學性質的匹配和結構特征的匹配起著主 導作用。具有相似結構特征的抗原空間表位與相似抗體虛擬識別的可能性較大。 目前沒有人做過抗原空間表位的相似性搜索分類，也沒有人做過抗原空間表位與 相應抗體結合界而的空間比對。我們計劃在對抗原抗體結合位點結構信息量化， 引入地理信息系統(gis)的“空間信息分析與模型分析”功能，發展空間比對方 法，通過對抗原表位空間結構特征的相似性搜索，在虛擬抗體庫中進行配對篩選 與親和性改造.綜合上述

21、的模擬結果，找出對應識別位點附近的更多特征和規 律，結合一維二維結構和其它生物特征，提煉抗原抗體識別的分子機制。5. 虛擬篩選和模擬結果的實驗驗證與改進選取一些重要的蛋白質抗原及對應抗體(例如11er2及抗體、egfr及抗體等, 以及與人類疾病密切相關的抗體,如sm5-1、anti-cd20> anti-cd25 anti-hiv、 anti-hbv等抗體)，通過虛擬表位預測、空間表位相似性搜索，以及結合界面的 空間比對及虛擬配對篩選，研究其識別和結合的結構基礎，交由實驗室驗證，并 根據實驗結果進一步改進模擬方法。經費比例:15%承擔單位：同濟大學、中國科學院上海生命科學研究院課題負責人

22、：曹志偉學術骨干：黃金艷、杜嘉木、朱瑞新課題2、抗體抗原相互作用規律的結構生物學基礎預期目標：綜合運用結構生物學、計算生物學、免疫學、分子生物學以及生物化學的 方法，以一些具有重要生物學功能的抗原和抗體分子為研究目標，通過研究這些 特異性抗休及其相應抗原分子在不同分辨率水平上的三維結構模型以及功能表 位信息，與其他分題協同合作，從多個層次和方位揭示抗原抗體相互作用的結 構基礎，闡明抗體分子特別是功能性抗體發揮其生物學功能的分子機制。研究內容：（1）具有重要生物學功能的抗原和抗體分子的原子尺度結構研究以一些有重要生物學功能的抗原和抗體分子作為研究對象，進行抗原、抗體 以及抗體抗原復合物的結晶和結

23、構解析工作。在獲得晶體的基礎上，解析它們 的三維空間結構，分析原子尺度上抗體特界性識別抗原的結構基礎。根據結構分 析選擇參與相互作用的潛在關鍵氨基酸，與第4、5分題合作進行突變并對進行 功能驗證，從而最終鎖定抗原抗體相互作用中的關鍵氨基酸，闡明抗體分子高 親和力專一性識別對應抗原分子的分子機制以及特定功能表位的生物學功能。對 于分子量不大而乂難于結晶的抗原分子，用溶液核磁共振技術來測定其溶液狀態 下的三維結構。將所獲得的結構信息作為基于計算生物學的抗體分子設計的模 板，完成抗體分子的優化改造，為探討抗體分子功能進化的規律奠定基礎。同時 將結構信息提供給第一分題，用于抗原抗體結合界面的空間信息特

24、征的統計及 抗體識別分子動力學模擬，總結抗體特異性識別抗原分子的作用規律。(2) 具有重要生物學功能的抗原抗體大分子復合物的分子尺度結構研究一些新型抗體(比如雙功能抗體、多價抗體等)和病毒屮和性抗體功能的發 揮不僅與其在原子尺度上的識別機制有關，更重要的是與它們在分子層面上的結 合模式以及空間效應有關。通過冷凍電鏡和x射線小角散射等結構牛物學手段 對抗體在分子尺度上對抗原的識別機制和空間效應進行研究，揭示這些抗體分子 在整體上發揮特定生物學功能的結構基礎和分子機制。結合局部原子分辨率水平 的結構模型，能夠得到整體復合物在多個層次上更全面的結構信息，為更詳盡地 揭示抗原抗體識別的分子機制提供結構

25、生物學的實驗依據。(3) 抗原抗體識別機制的動態結構研究抗原抗體的識別是一個動態的過程，涉及復雜的分子動力學和熱力學的變 化過程。采用表面等離子共振技術檢測抗原抗體識別過程屮的分子動力學變化； 用等熱滴定方法檢測相互作用過程中的熱力學效應；用溶液核磁共振技術來研究 抗原(或者抗原表位肽段)在被抗休識別過程中各個氨基酸的變化情況，得到抗 原抗體識別在溶液生理狀態下的動態信息。結合靜態晶體結構信息，闡明抗原 被抗體特異性識別的分子動力學機制。與第五分題合作，通過點突變反映抗原或 者抗體上各個氨基酸對于抗原抗體相互作用的分子動力學貢獻和熱力學貢獻，從 而獲得更為詳盡的結合參數。實驗數據可以為計算生物

26、學基礎上的分子設計和結 合規律的探討提供有價值的修正參照。(4) 具有重要生物學意義的功能表位的研究抗原上不同的表位往往代表著不同的牛物學功能活性位點，對于線性表位的 抗體的共結晶實驗，可以采用抗原表位肽段來模擬整個抗原，而簡化結晶和分析 過程，因而我們還計劃開展針對重要抗原分子上有重要生物學意義的抗原表位的 搜索。我們將采取傳統的截斷體構建、噬菌體展示等免疫學方法對線性抗原表位 的搜索；對于難以用傳統免疫學方法鑒定的空間表位，我們計劃采用生物物理學 核磁共振技術，蛋白質組學気氛交換質譜技術，與第4分題合作采用計算生物學 分子模擬和分子對接等新型技術，一起完成重要抗原表位的鑒定。并在此基礎上

27、設計多肽模擬抗原表位，進行抗體多肽復合物的結構研究、抗原表位的生物學 功能的研究以及用核磁技術進行抗原在抗體結合過程中的動力學研究。結果可以 與第1分題進行抗原空間表位相似性數據的匯總分析。(5) 抗原抗體結構的計算機模擬和分子對接結果的驗證第4分題涉及用計算生物學分子模擬和分子對接方法得到的抗原抗體結構 模型，運用冷凍電鏡或者小角散射等方法得到抗原抗體復合物的低分辨率結構 模型對復合物的計算模型開展整體框架上的篩選和驗證，用核磁共振方法來驗證 表位的正確性和動態過程。經費比例：27%承擔單位：中國科學院微生物研究所、第二軍醫大學課題負責人：劉一葦學術骨干：陳勇、李博華、馬穎、周旭宇課題3、抗

28、體抗原復合物的分子分布特征及功能識別基礎預期目標：近場光學顯微術結合熒光量子點標記技術對單個抗原抗體在細胞表面的動 態分布狀態進行可視化研究及數量化分析，結合單分子力譜測量技術和原子力顯 微成像術對抗原抗體分子間結合、解離的動態過程給以精細探討。進一步闡明在 生理條件下抗原抗體相互作用機制，建立抗體分子識別的數學理論模型。研究內容：1 應用原子力顯微成像技術對抗原抗體分子進行單分子探測及可視化研究， 獲取抗原抗體分子在牛物膜上的超微形貌，探討牛理條件下抗體分子識別的結構 特征與功能的關系；2. 應用近場光學顯微技術結合量子點標記技術，對細胞表而抗體分子的分布 狀態進行超高光學分辨率的熒光成像、

29、偏振光成像，深入探討分子分布狀態的生 物學功能并確定抗體分子的空間取向；3. 結合針尖化學、單分子力譜測量技術探測單個抗原抗體分子間的作用力和 離解力，在皮牛頓力量級上精確量化抗原抗體間的作用力，對抗原抗體間的結合、 解離過程進行實時分析，建立抗體分子識別的數學理論模型；4. 在近場光學顯微成像平臺上結合量子點標記技術、電子調諧技術實現對單 細胞表面多種抗原抗體分子高區分度的并行探測，對分子分布狀態在外界條件刺 激下的動態變化進行可視化研究和數量化分析，進一步闡明抗原抗體分子在不同 細胞時期的作用機制。經費比例:14%承擔單位：暨南大學、南開大學課題負責人：蔡繼業學術骨干：陳凌懿、潘運龍、楊培

30、慧、周立新課題4、基于計算生物學的抗體分子設計及功能進化規律研究預期目標：基于分子動力學（牛頓力學）和周期性邊界條件下的密度泛函理論（量子 力學）探討抗原-抗體相互作用的動態模式，建立基于結構的計算機虛擬突變技 術并用于抗體分子的功能進化。利用de novo建模、微觀組態相互作用理論獲得 抗體模擬多肽結構，設計全新功能性人源抗體分子及雙功能多價抗體分子，在此 基礎上探討抗體分子功能進化規律，為新型抗體分子功能的預測提供理論依據。研究內容：1. 通過計算牛物學方法合理模擬在考慮溶劑效應下的抗原-抗體相互作用的動 態模式；進而借助量子化學方法下的密度泛函理論及周期性邊界條件的合理設 定，對牛頓力學

31、下確定的抗原表位關鍵位點的電子結構特征、熱力學參數及振動 光譜的變化進行探討，確定抗原表位構象及理化性質。2. 通過模擬體內微環境，合理判定抗體與抗原作用過程中影響復合物穩定性的 關鍵因素及影響抗原構象的關鍵結構域，為抗體分子模擬設計及功能進化提供理 論依據和技術支持。3通過位點生長、連接方法獲得相應的抗體模擬多肽。利用de novo建模、微觀 組態相互作用理論獲得多肽結構，并利用分子對接、牛頓力學優化獲得多肽抗原 作用模式，在確定抗體模擬多肽生物學功能基礎上，設計構建全新功能性人源抗 體分子及雙功能多價抗體分子。4. 結合本項目其他分題得到的抗體結構數據及生物信息數據庫，對抗原-抗體作 用及

32、解離模式進行分子動力學模擬，建立計算機虛擬突變技術并用于抗體分子的 功能進化。經費比例:16%承擔單位：中國人民解放軍軍事醫學科學院課題負責人：張毅學術骨干：馮健男、毛寧、呂明課題5、基于功能表位的高通量抗體篩選及功能研究預期目標：利用課題組現有的大型人源fab抗體庫和噬菌體抗體庫技術與分子對接矩 陣模式，結合人一人單克隆抗體技術及小鼠雜交瘤技術，進行確定抗體表位的高 通量抗體篩選；收集所產生的功能性抗體分子數據，建立充實“生物抗體數據 庫”，結合結構生物學的數據和計算生物學手段對抗體分子識別特點進行研究， 尋找抗體分子識別和發揮功能的規律。利用分子牛物學、細胞生物學等方法對通 過計算生物學獲

33、得的抗體分子進行克隆和表達，在細胞或動物模型上研究抗體分 子的生物學功能，對抗體分子識別的作用規律進行系統研究。研究內容：1、利用大型人源fab抗體庫和噬菌體抗體庫技術，結合經典的細胞融合雜 交瘤技術，利用親和層析或表位芯片等方法，采用路標選擇和平行篩選等策略， 高通量篩選表位特異的單克隆抗體；采集抗體分子數據，建立并完善“生物抗體 數據庫” o所收集的數據反饋給第一分題進行空間比對和模擬，并可為第四分題 提供計算生物學的原始序列。2、根據牛物抗體信息庫和計算牛物學得到抗體分子序列進行全基因合成、 克隆和表達，利用表面等離子共振技術測定抗體分子的抗原結合活性，并對抗體 分子的親合力常數進行測定

34、。所制備的抗體為第二分題提供抗原抗體共結晶結構 分析的原始材料，并為第四分題計算生物學和第一分題生物信息學為慕礎的抗原 抗體相互作用規律提供印證數據。3、在細胞模型上對基于計算生物學設計合成或模擬篩選獲得的抗體分子進 行功能活性檢測，分析它們具有的激動、中和或是抑制功能，結合分題三抗體在 生理狀態下的分子識別規律，印證基于生物信息學和計算生物學的抗體功能模擬 預測。通過動物模型對抗體的體內生物學功能進行驗證，從而對基于“抗體分子 識別規律”的抗體結構與功能預測的有效性和準確性進行分析。以進一步闡明抗 體分了識別的作用機制。經費比例：28%承擔單位：中南大學、中國人民解放軍第二軍醫大學課題負責人

35、：郭亞軍學術骨干：戴建新、任彩萍、王皓6、各課題間相互關系以及與項目目標之間的關系本研究在前一個“973項目”取得的進展和建立的技術平臺的基礎上，圍繞 抗體分子識別與作用規律這個關鍵科學問題，組織免疫學、結構生物學，生物信 息學，計算生物學和量子化學等基礎和前沿交叉學科的優勢力量，進行系統的研 究。項冃共設置五個課題：課題一“基于生物信息學的抗原抗體分子識別與系統 模擬”是在前期生物信息大規模抗體虛擬庫和抗體抗原分子識別的結構基礎上， 統計抗體抗原結合界面兩側的空間信息特征和特征，建立基于空間特征的蛋白質 抗原空間表位預測方法，進行抗體抗原分子識別的分子動力學模擬，采用地理信 息系統(g1s)

36、的“空間信息分析與模型分析”功能,發展空間比對技術，尋找抗 體抗原表而結合位點識別規律，并對抗體分子識別的關鍵位點和能力進行預測。 所建立的抗原抗體數據庫，可在本項目各課題組z間共享，所編制的表位預測軟 件、空間構象模擬軟件及預測結果，可為第5分題構建高親和力抗體提供有價值 的線索。也可為第4分題的抗體分子功能進化提供生物信息學參考。課題二“抗 體抗原相互作用結構學基礎”，在前期已經建立的抗原和抗體分子晶體結構測定 平臺的基礎上，綜合運用x-射線晶體學、溶液核磁共振、冷凍電鏡、x-射線小 角散射等多種結構生物學手段測定抗體和抗原分子以及它們的復合物的在不同 分辨率尺度上和不同測定方法基礎上的三

37、維結構信息，確定抗原分子上具有重要 活性的功能表位，揭示抗體特異性高效識別靶標抗原的結構基礎，驗證課題一提 出的抗體分子識別規律和關鍵位點。課題三“抗體抗原復合物的分子分布特征及 功能識別基礎”，利用近場光學顯微術結合熒光量子點標記技術，研究抗體抗原 復合物的分子分布特征及功能識別基礎，以闡明在牛理條件下抗原抗體相互作用 機制；在上述結構生物學研究的基礎上，進行課題四“基于計算生物學的抗體分 子功能進化研究”，建立基于結構的計算機虛擬突變技術并用于抗體分子的功能 進化，利用de novo建模、微觀組態相互作用理論獲得抗體模擬多肽結構，設計 全新功能性人源抗體分子及雙功能多價抗體分子，在此基礎上

38、探討抗體分子功能 進化規律，為新型抗體分子功能的預測提供理論依據；獲得的相關靶蛋白高親和 力抗體可提供第五分題用于進一步的實驗研究，同時相關的模型可提供給第一分 題用于抗原表位預測模型的進一步優化，相關的抗原、抗體結構信息可以與第二 分題進行理論與實驗的相互疊合，進一步優化結構，確定的抗原一抗體作用的微 觀結構信息可對接第三分題，進一步探討其規律性。最后通過課題五“基于功能 表位的高通量抗體篩選及功能研究”結合分子牛物學、細胞牛物學方法，對抗體 分子體內外功能及其相互作用規律進行驗證。收集獲得的生物功能數據，結合課 題4計算生物學、課題2、3結構生物學的信息，通過課題1的生物信息手段的 匯總和

39、分析，總結抗體分子識別規律。上述五個課題，既相對獨立，又密切關聯, 相互交叉為用，結合與交叉，利用分子生物學，免疫學，結構生物學，計算機科 學等眾多相關領域的基礎理論和技術，通過“表位預測與驗證一抗體分子模擬一 結構解析一分子設計及預測一生物功能驗證”這一流程，形成一個有機整合的抗 原和抗體相互作用研究系統。19四、年度計劃第一年研究內容：(1) 利用傳染病、腫瘤和自身免疫病患者及止常人外周血b淋巴細胞，分別建立 人源抗體庫。抗體庫包括全人全抗體細胞庫和噬菌體抗體庫。同時收集100 例左右典型的腫瘤組織，進行組織培養，為下一步的抗體篩選提供抗原載體。(2) 利用已知結構的病毒、毒素腫瘤相關抗原

40、(ha1, e protein, seb, ricin, her2, egfr, cd20、cd25)分析其抗原表位，制備抗原肽，免疫小鼠，制備出一系 列識別相同抗原表位，但具有不同結構和親和活性的抗體。(3) 對我們現有的特異性抗體及抗原對(抗opn、抗seb、抗ricin.抗登革熱e 蛋白抗體等)及相應抗體分子的制備，開始其第一批晶體生長和條件優化工 作和結構分析；開展冷凍電鏡樣品的制備工作。(4) 收集項目所需要的數據，主要從結構數據庫，實驗室和文獻里收集已知的 抗原抗體結合位點結構信息，以及對應抗原，抗體功能等其他信息；根據 收集的數據計算各種結構特征參數，選擇合適的方法對特征參數進行

41、統計分 析。(5) 在金膜上修飾cd3, cd25, cd69抗原，摸索并優化針尖修飾技術將上述抗原 對應的特異性抗體修飾在針尖上并測量抗原抗體間的相互作用力；對cd4+t 細胞的膜蛋白cd4進行在體納米尺度光學成像，研究cd4在cd4+ t細胞上 的分布情況。(6) 利用蛋白質結構數據庫pdb以及第二分題的結構，對靶蛋白(blys. iler3. tnf. her2)空間構象進行理論模擬；借助第五分題獲得的相應功能抗體(抗 tnf. her2)以及木分題通過免疫小鼠獲得的鼠源抗體(抗blys. her3),通 過序列分析、結構模擬獲得其空間結構；利用分子對接、力學優化及動力學 模擬確定抗原一

42、抗體作用的動態模式，初步判定相互識別的關鍵位置，并通 過點突變以及缺失突變技術對確定的靶位進行實驗驗證。第一年預期目標：(1) 制備庫容達到10'的全抗體細胞庫和10“的噬菌體抗體庫，同時具備一定的 多樣性。獲得8種抗原的表位，并建立表位特異的特殊免疫小鼠；完成現 有4 6種抗體抗原對的功能學驗證(2) 完成2-4種大尺度抗原-抗體復合物(如登革熱病毒一抗體)冷凍電鏡樣品 的準備工作； 完成對(抗opn、抗seb、抗ricin.抗登革熱e蛋白抗體等)復合物的結 晶及數據收集工作；(4) 探討抗原一抗體相互識別的動態模式以及影響其相互作用的關鍵因素。確 定四種靶抗原的表位結構特征，并通過

43、實驗進行驗證。(5) 初步完成結構信息的收集和整理，結構特征的抽提以及統計分析；(6) 制備能單層均勻覆蓋金膜表面的抗原膜，初步完成針尖修飾技術的優化， 得出在離體狀態下cd3, cd25, cd69分子的抗原抗體相互作用力。得到cd4 分子在t輔助細胞上的分布情況，分析其與cd4分子功能的關系。(7) 爭取在sci收錄的雜志上發表論文15-20篇。其屮爭取3-5篇發表于該領域權威期刊。中請國家發明專利4項。第二年研究內容：(1) 利用已建立的抗體庫篩選新的全人的抗腫瘤、病毒、自身免疫抗原的特異性 抗體，同時也利用同樣的抗體庫大規模篩選opn, egfr及病毒抗原相關的人源 抗體。制備其它的疾

44、病相關抗原(ige、tnf、vegf等)的抗體雜交瘤。繼續 制備系列性鼠源性抗體，并對所有獲取的單克隆抗體進行基因克隆，以確定 其可變區一級結構信息。(2) 在建立一系列抗體功能檢定體系(包括生物學活性、親和力、結合位點的高 通量檢測方法)的基礎上，進一步驗證抗ige,抗egf,抗tnf,抗il-6抗 體，抗cd20和抗cd52的生物學功能。(3) 開展第二批5種新抗原(cd25, cd44, cd3, cd52, ctla4)、及相應抗體分 子的制備，結晶和晶體結構分析，找出相互作用的關鍵殘基。開展抗體一病 焉復合物冷凍電鏡結構的解析。(4) 在t細胞活化過程中，對其膜蛋白cd3, cd25

45、, cd69進行納米尺度的近場光 學成像，記錄t細胞活化過程中分子的分布情況。利用針尖化學技術在體測 量cd3, cd25, cd69與它們的特異性抗體之間的作用力和離解力。(5) 通過統計分析方法對于結構特征參數實現篩選和分類；對結構特征因子進行 選擇和優化，發現抗原抗體結合界面空間特征的潛在規律。設計算法提高抗 原空間表位預測精度，并以文獻和實驗數據進行校正。(6) 利用抗原表位的宏觀分析方法對靶抗原(egfr、cd3、h1n1流感病毒ha1蛋 白)進行空間構象模擬，并對其功能抗體的空間構象進行理論模擬，并預測 其抗原表位，進而通過分子生物學手段進行表位驗證及分析。(7) 利用周期性邊界條

46、件及微觀計算方法對抗原一抗體相互識別的微觀結構信息 進行計算、分析，結合課題二、三的實驗結果對建立的微觀模型進行優化， 并開展針對靶抗原(blys> her3)的抗體體外親和力成熟預測，通過生物學 實驗進行分析、驗證。第二年預期目標：(1) 篩選出20-40種人源抗體序列，這些抗體序列均應與已知的抗原表位相結 合，具有一定的生物活性。獲取50種以上，集中針對2-3個抗原的鼠源抗體 序列。完成4 6種細胞膜表而分子與其抗體的抗體共晶和結構分析，同時完成2-4 種大尺度抗原-抗體復合物冷凍電鏡結構的解析(如森林腦炎病毒一抗體)，分 辨率達納米級。(3) 得到cd3, cd25, cd69分子

47、在t細胞活化工程中的高分辨光學圖，建立并優 化同時對多種抗體進行探測的技術和方法。得到cd3, cd25, cd69分子的抗 原抗體相互作用力。(4) 初步完成結構特征的篩選和分類；依靠抗原表位結構特征統計分析結果設 計空間表位預測算法和軟件實現；(5) 建立抗原一抗體相互作用動態模式分析平臺技術。確定三種靶抗原的表位構 象特點，并通過實驗進行騎證。獲得微觀條件下抗原一抗體相互識別的結構 模式，并建立相應的預測及分析方法。(6) 在sci收錄的雜志上發表論文20-25篇，其屮爭取46篇發表于該領域權 威期刊。中請國家發明專利4項。第三年研究內容：(1) 對可能獲取的新的抗病毒、抗腫瘤和抗自身免

48、疫病抗體等具有潛在功能的抗 體，進行必要的體內模型驗證。完善抗體結構及功能數據庫。實現抗原抗體 作用位點結構數據與地理信息系統的數據對接，實現地理信息系統處理生物 結構數據；(2) 開展第三批5種可溶性抗原(light, fc e i a , rankl, vegf, egf)及相應 抗體分子的制備、結晶及數據收集。(3) 研究細胞表面的多潛能性相關表面抗原ssea-1和白血病抑制因子受體(lifr)和gpl30抗原在胚胎干細胞在分化過程中分布狀態的變化。(4) 對課題1中歸納總結的抗原抗體作用界面規律，表位預測結果以及動力學模 擬規律所選定的抗體相關重要氨基酸進行點突變，嘗試制備10種以上的改良 抗體，并對其功能進行驗證，信息反饋給課題組課題1和4,以修正其數學 模式和統計規律。(5) 對課題5中的針對靶抗原(tnf、her2)的抗體借助分子動力學方法及改進的 分子力學力場及統一原子模型模擬抗體分子識別和結合抗原分子的動力學特 征。研究不同突變位點對結構功能，識別和結合過程的影響，通過虛擬篩選 及優化獲得高親和力抗體。第三年