1、分類號vdcmu密級碩士學位論文ykl-40作為腫瘤標志物對肝細胞癌的iia.診斷價值ykl-40 expression in humanhepatocellular carcinoma:a potentialbiomarker?作者姓名：李群芳答辯委員會主學科專業：傳染病學 學院（系、所）：湘雅二醫院 導師：陳軍副教授論文答辯日期中南大學二o一年五月原創性聲明本人聲明，所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究 工作及取得的研究成果。盡我所知，除了論文中特別加以標注和致謝 的地方外，論文中不包含其他人已經發表或撰寫過的研究成果，也不 包含為獲得中南大學或其他單位的學位或證書而使用過的材料。

2、與我 共同工作的同志對本研究所作的貢獻均已在論文中作了明確的說明。作者簽名：日期：洌年上月習日學位論文版權使用授權書本人了解中南大學有關保留、使用學位論文的規定，即：學校有權保留學位論文并根據國家或湖南省有關部門規定送交學位論文, 允許學位論文被查閱和借閱；學校可以公布學位論文的全部或部分內 容，可以采用復印、縮印或其它手段保存學位論文。同時授權中國科 學技術信息研究所將本學位論文收錄到中國學位論文全文數據庫, 并通過網絡向社會公眾提供信息服務。制年r月習日女q四ykl-40作為腫瘤標志物對肝細胞癌的診斷價值摘要背景與目的：ykl4）是一種新發現在多種惡性腫瘤中具有診 斷價值的腫瘤標志物。肝細

3、胞癌在我國高發惡性腫瘤之一，要早期診 斷肝癌，需要有高靈敏度及特異度的診斷指標。ykl40能否作為診 斷肝細胞癌新的腫瘤標志物仍不明確。本研究的目的是檢測ykl40 在肝細胞癌患者血清、肝癌組織中，以及在肝癌細胞株中的表達，從 而評價ykl40作為腫瘤標志物對肝細胞癌的診斷價值。方法：選取2006年在美國加州大學hillcrest醫院經外科肝癌切 除術的8名肝細胞癌患者，免疫組織化學染色檢測ykl40在肝癌組 織及癌旁肝組織中的表達；收集2007年至2009年在湘雅二醫院診療 的30例肝細胞癌患者、30例肝硬化患者及30例肝功能正常的乙型 肝炎病毒攜帶者，酶聯免疫吸附試驗檢測各患者血清ykl4

4、0濃度； 應用rt-pcr檢測三種不同肝癌細胞株及兩種正常肝細胞株中 ykl-40 mrna 的表達。結果：u免疫組織化學染色顯示，肝細胞癌患者肝癌組織中ykl/0 表達明顯高于癌旁肝組織。2、酶聯免疫吸附檢測顯示，與乙型肝炎病毒攜帶者相比，肝細 胞癌組與肝硬化組患者血清ykl40濃度均明顯增高；但是肝細胞癌 組與肝碩化組間的ykl-40水平無顯著差異。3、rt-pcr檢測顯示，三種肝癌細胞株（hepg2、huh7、lm-3）中的ykl-40 mrna水平表達明顯高于兩種正常肝細胞株 （qsg力01、lx-2 ）o結論：ykl40在肝細胞癌分子、細胞及組織水平均高度表達。但是，肝細胞癌患者與肝

5、硬化患者血清ykl40水平無明顯差別，因 此，ykl/0作為一種新的腫瘤標志物在肝細胞癌診斷中尚無明確診 斷價值。關鍵詞：人類軟骨糖蛋白39 （ykl4）；肝細胞癌；肝硬化ykl-40 expression in human hepatocellular carcinoma:apotential biomarker?abstractbackground: ykl-40 is a new biomarker with a diagnostic value in many different cancers. whether it may serve as a biomarker for hepa

6、tocellular carcinoma (hcc) is still unclear to examine the expression of ykl-40 in the serum and liver tissues of hepatocellular carcinoma (hcc) patients and in hcc cell lines, in comparison with that in non-hcc liver disease patients and non-tumor hepatic cell lines, respectively.methods: immunohis

7、tochemical staining was used to detect j. ykl-40 protein expression in liver biopsy specimens from 8 hcc patients. elisa was used to detect the serum ykl-40 level in 30 hcc patients, 30 inactive hbsag carrier (ihc) patients with normal liver functions, and 30 liver cinhosis patients. rt-pcr was empl

8、oyed to examine ykl-40 mrna expression in three hcc cell lines and two non-tumor hepatic cell linesresults:immunohistochemcal staining of liver biopsy specimens from hcc patients showed that ykl-40 protein expression in tumor tissue was higher than that in adjacent normal tissues. elisa revealed tha

9、t the ykl-40 serum level in the hcc group was significantly higherinthan that in the ihc group (p<0.01), but without significant difference from that in the cirrhosis group (p>0.05). rt-pcr showed that ykl40 mrna levels in hcc cell lines were significantly higher than those in non-tumor hepati

10、c cells (p<0.01).conclusion: ykl-40 is highly expressed in hcc at the molecular, cellular and tissue levels. however, it may not serve as a serum biomarker for hcc because detection of the serum ykl-40 level can not distinguish hcc from cirrhosis.keywords: ykl-40; hepatocellular carcinoma; cirrho

11、sis目錄摘要iabstractill縮略詞vi第一章前言1f第二章材料與方法32.1主要試劑32.2主要儀器 42.3主要溶液配制.52.4研究對象62.5免疫組織化學實驗62.6酶聯免疫吸附試驗82.7 rt-pcr92.8統計學方法12第三章結果133.1肝癌組織及癌旁肝組織ykl40的表達 133.2三種不同肝病患者血清ykl40濃度143.3不同肝癌及肝細胞株ykl40mrna的表達16第四章討論18第五章結論21參考文獻22附錄25綜述26致謝36一縮略詞abbreviations縮略詞英文全稱中文全稱afpa-fetoprotein甲胎蛋白albalbumin白蛋白altalan

12、ine aminotransferase谷丙轉氨酶bpbase pair堿基對cdnacomplementary deoxyribonucleic acid互補脫氧核糖核酸ctcomputed tomography電子計算機x射線斷層 掃描技術depcdiethyl pyrocarbonate二乙基焦磷酰胺dmemdulbecco*s modified eagle's medium達爾伯克（氏）改良伊格 爾（氏）培養基dntpdeoxy-ribonucleoside triphosphate三磷酸脫氧核糖核昔dnadeoxyribonucleic acid脫氧核糖核酸dsadigita

13、l subtraction angiography數字減影血管造彩edtaethylenediamine tetraacetic acid乙二胺四乙酸fbsfetal biovine serum胎牛血清gapdhglyceraldehyde phosphate dehydrogenase磷酸甘油醛脫氫酶gloglobulin球蛋白hahyaluronic acid透明質酸hbvhepatitis b virus乙型肝炎病毒hcchepatocellular carcinoma肝細胞癌lnlaminin層粘連蛋白m-mlvmoloney murine leukemia virus reverse

14、 transcriptase莫洛尼鼠白血病反轉錄 酶mrimagnetic resonance imaging核磁共振成像mrnamessenger rna(ribonucleic acid)信使rna0doptical densiny光密度pbsphosphate buffered saline磷酸鹽緩沖液pcrpolymerase chain reaction聚合酶鏈式反應rpmrevolutions per minute每分鐘轉數rtreverse transcription逆轉錄rnaribonucleic acid核糖核酸rnaseribonuclease核糖核酸酶rnasinrib

15、onuclease inhibitor核糖核酸酶抑制劑rt-pcrreverse transcription polymerase reactionchain逆轉錄聚合酶鏈反應tbetris/borate electrophoresis buffertris/硼酸電泳緩沖液tristris(hydroxymethyl)aminomethane三羥甲基氨基甲烷ykl-40human cartilage gp-39人軟骨糖蛋白39ykl-40作為腫瘤標志物對肝細胞癌的診斷價值第一章前言肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, hcc）是臨床上常見的惡性腫瘤之一，在 全球其發病率

16、居第六位，死亡率居第三位，每年約60萬人死于原發性肝癌，在腫 瘤相關死亡中僅次于肺癌及胃癌。其中大多數病例以發展中國家為主，尤其以我 國、東南亞和非洲國家的發病率最高，在我國，肝癌發病人數約占全球的55%。 早期確診肝細胞癌并對患者進行有效的臨床治療能明顯延長患者生存期囚。由于 hcc早期臨床癥狀及體征不明顯，大多數患者就診時腫瘤已進展至中晚期，故肝 癌治療效果及預后差，死亡率高。因此，早期發現、早期診斷、早期治療是提高 肝細胞癌患者治療療效、降低肝癌死亡率、延長患者生存期的關鍵。hcc的診斷標準包括病理學診斷標準和臨床診斷標準。診斷方法包括血清 腫瘤標志物甲胎蛋白（afp）檢測、肝臟影像學檢

17、査（包括超聲顯像、ct、mri 和dsa血管造影等）以及病理組織學檢査（主要是肝組織活檢）。而腫瘤標 志物檢測相較于彩像學檢查來說，其費用低：相較于病理活檢來說無創傷，患者 更易于接受，便于推廣。因此腫瘤標志物可廣泛應用于癌癥的篩査、早期診斷、 療效檢測，預后判斷等。長期以來，腫瘤標志物檢測是用于hcc篩査及診斷中 最有效的方法之一，其中甲胎蛋白（afp）是迄今為止發現最早而又應用最廣的 肝癌腫瘤標志物。大多數臨床研究結果表明，甲胎蛋白（afp）在診斷hcc的 敏感度為41%-65%,特異度為80%-94%（4,#盡管afp作為篩査及診斷hcc主 要的腫瘤標志物，但是最近有文獻報道分析顯示了

18、afp在篩査和診斷hcc的局 限性。在80%小肝癌中afp值并不升高,研究表明當肝癌腫瘤組織直徑大于3cm 時，afp的敏感度為52%,腫瘤直徑小于3cm是，敏感度降至25%,其診斷敏 感度和特異性也存在不足。afp在肝癌的早期診斷中仍有40%的假陰性率，因 此造成了臨床上肝癌的漏診。目前，除了甲胎蛋白（afp）作為肝癌篩査及診斷的腫瘤標志物，在臨床上 用于hcc診斷的腫瘤標志物主要有：afp異構體（afpl3）、al巖藻糖甘 （afu）、廠谷氨酰轉肽酶（y-gt）及其同工酶、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 （gpc3）、去廠竣基凝血素（dcp）等。但它們均為非器官特異性的腫瘤標志物，其敏感 性及特異性

19、不高。因此，需要發現其他敏感性髙及特異度好的肝癌相關腫瘤標志 物，為確診肝癌提供重要的輔助診斷依據。ykl40是一種新發現在多種惡性腫瘤中具有診斷價值的腫瘤標志物。ykl40是一種肝素和幾丁質結合糖蛋白，又稱人類軟骨糖蛋白39叫是哺乳動物18糖基水解酶家族成員之一.基于該蛋白的肽鏈氨基端起始三個氨基酸為酪（y）、賴氨酸（k）和亮氨酸（l）,以及它的相對分子量為40kda,故命名為ykl-4019人類ykldo基因位于1號染色體q31-q32±,包含了 10個外 顯子和跨越了 8kb的基因組dnap0jo根據美國國家生物技術信息中心的表達序列標記數據庫的數據，在對ykl40蛋白的研究中

20、，發現許多不同類型的實體腫瘤均表達ykl4）,如乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、肺癌.胰腺癌.結腸癌、10志甲狀腺癌，骨肉瘤，神經膠質瘤、腎癌、前列腺癌、以及生殖細胞腫瘤患者血清 中濃度明顯增高，同時，血清高濃度ykl40的患者總體生存期短、預后差】。 目前研究證明，它是一種在多種惡性腫瘤中高度表達及分泌的蛋白，在腫瘤細胞 的增殖、分化及腫瘤周圍炎癥及血管發生、細胞外基質重塑等方面發揮著重要作 用。在本研究中，擬對肝細胞癌患者術前血清ykl40進行檢測，并研究肝癌組 織中ykl4）的表達以及yklmomrna在肝癌細胞株中的表達，從而研究 ykl40作為一種新的腫瘤標志物在肝細胞癌中的診斷價值。第

21、二章2.1主要試劑材料與方法主要試劑來源ykl-40 elisa kit美國metre生物公司dmem細胞培養液美國gibico/brl公司胎牛血清(fbs)美國gibco公司胰蛋白酶美國sigma公司鼠抗人ykl-40抗體美國加州大學生物系professor, phd paul a惠贈抗生物素標記羊抗鼠igg丹麥 dakocytomation 公司depc(焦碳酸二乙酯)北京鼎國生物科技有限公司trizol© reagent美國invitrogen公司m-mlv逆轉錄酶美國promega公司dna多聚酶美國promega公司dntps美國promega公司瓊脂糖粉上海基因技術公司e

22、dta北京鼎國生物科技有限公司硼酸北京鼎國生物科技有限公司氯仿、異丙醇、無水乙醇湖南師大試劑廠tritonx100北京鼎國生物科技有限公司trisbase北京鼎國生物科技有限公司漠乙錠華美生物工程公司dab染色試劑盒北京中杉金橋公司revert aid first strand cdnasynthesis kit美國fermentas公司2xpcr master mix美國fermentas公司dna marker： 1 oobp dna ladder上海天根公司碩士學位論文第一章材料與方法2.2主要儀器主要儀器來源ronshen 冰箱廣東海信公司bio-rad基準酶標儀美國bio-rad公司

23、石蠟切片機德國leica公司tg16-ws臺式離心機湘儀公司tdl-16臺式高速冷凍離心機長沙平凡儀器恒溫c02培養箱德國former公司超凈工作臺、江蘇安泰公司倒置光學顯微鏡日本olympus公司fr-2000成像分析系統上海復日公司電泳裝置美國bio-rad公司ay120電子天平日本島津公司ptc-100pcr 擴增儀美國 mj research.inc 公司bds160電熱恒溫三用水箱北京醫療器械廠t6新世紀紫外分光光度計北京普析通用儀器公司xw-80a旋渦混合器上海精科實業公司恒溫振蕩器國華企業電熱干燥箱長沙儀器儀表廠2.3主要溶液配制（1）磷酸鹽緩沖生理鹽水（pbs）kcl0.2gk

24、h2po40.24gnacl&0gna2hpo412h2o3.63g加蒸憾水至1000ml（2 ） 200inmovl谷氨酰胺液谷氨酰胺2.922g三蒸水100ml過濾除菌，分裝后20c保存備用<4） 0.25%胰蛋白酶-0.03%edta溶液胰蛋白酶（1： 250）250mgedta 4na30mg平衡鹽溶液（無ca2+、mg2*）100mlnahcch或hci調節ph至7.2,過濾除菌，分裝后代儲存（5）6x凝膠加樣緩沖液二甲苯青ff0.25%溟酚藍0.25%甘油水溶液30%（6）5xtbe電泳緩沖液tris54g硼酸27.5g0.5mol/l edta20ml加蒸館水至10

25、00ml2.4研究對象1組織標本選取2006年在美國加州大學hillcrest醫院行外科肝癌切除術的8名肝細胞 癌患者肝癌組織標本（術前患者均未行放療化療或生物治療，經病理學檢査明確 為原發性肝細胞癌患者）；同時，選取接受手術治療肝癌患者的癌旁肝組織標本 作為對照組.2血清標本收集2007年至2009年在中南大學湘雅二醫院就診經臨床和病理確診為肝細 胞癌患者3附（未行放療或化療治療），肝硬化患者30例，非祜創厭型肝炎病 毒攜帶者30例，所選患者均除外骨關節病及其他腫瘤病史。所有肝細咆癌患者均 經過外科手術切除病理切片確診，肝硬化患者及慢性乙型肝炎患者經卄活檢行病 理診斷確診。肝癌患者于術前收取

26、靜脈血液標本，肝硬化患者及非活動期乙型肝炎病毒攜 帶者于肝活檢前收取標本。所有靜脈血液標本采用非抗凝管收集抽取靜脈血，室 溫下自然凝固，4000rpm離心5min,吸取上層血清，將血清移至1.5mlep管中， 做好標記，4小時內放入冰箱20° c凍存，所有血清標本避免溶血和及復凍融。3細胞標本qsg7701細胞株：為正常肝臟上皮細胞株，由湖南國獅基因生物科技公司 惠贈。lx2細胞株：為肝星狀細胞株，購于中南大學湘雅細胞中心。hepg2細胞株：為肝癌細胞株，購于中南大學湘雅細胞中心。huh7細胞株：為肝癌細胞株，購于中南大學湘雅細胞中心。lm3細胞株：為肝癌細胞株，購于中南大學湘雅細胞

27、中心。2.5免疫組織化學實驗1組織常規脫蠟.水化步驟（1）組織脫水：按 70%-80%-85%-90%-95%.100%-100%度酒楙脫水，各 15分鐘。(2) 組織透明：二甲苯浸泡10分鐘，共兩次。(3) 組織浸蠟：浸泡2小時。(4) 組織包埋。(5) 蠟塊冰凍后切片。(6) 烘烤：60。(?恒溫箱放置2小時。(7) 脫蠟、水化:二甲苯浸泡15分鐘，各2次;按梯度酒精100%100%95%> 95%-85%-80%-70%-水浸泡水化，各2分鐘。2免疫組化染色步驟(1) 組織切片常規脫蠟、水化。(2) pbs洗滌3次，每次3分鐘。(3) 3%h2o2滴加在組織上，室溫孵育10分鐘。(

28、4) pbs洗滌3次，每次3分鐘。(5) 抗原修復：加枸椽酸鈉換緩沖液(ph6.0)浸泡組織，微波加熱至沸騰, 煮沸后冷卻5分鐘，再次煮沸后冷卻至室溫。(6) pbs洗滌3次，每次3分鐘。(7) 滴加蛋白阻斷工作液a液(正常山羊血清封閉液)，室溫孵育5分鐘, 甩去多余阻斷液。(8) 滴加生物素化1抗工作液50ul,室溫孵育1小時。(9) pbs洗滌3次，每次3分鐘。(10) 滴加生物素化2抗工作液b液50ul,室溫孵育10分鐘。(11) pbs洗滌3次，每次3分鐘。(12) 滴加溶液3 (辣根過氧化酶標記的鏈霉卵白素工作液)，室溫孵育10 分鐘。(13) pbs洗滌3次，每次3分鐘。(14)

29、dab染色510分鐘，顯微鏡下觀察掌握染色程度。(15) pbs沖洗10分鐘。(16) 蘇木精復染10分鐘。(17) pbs 沖洗。（18）干燥、封片、鏡檢、拍片。質量控制：設立陽性對照和陰性對照，以pbs代替一抗作為陰性對照。結果判定：ykl40蛋白免疫組化陽性反應表現為胞質棕色顆粒狀物質， ykl40的表達水平判斷基于染色陽性細胞百分比。每片觀察5個40h0倍的視野, 每個視野計數陽性細胞的百分數，取其平均值。0分：陽性細胞百分比5%以下； 1分：陽性細胞百分tt5%-25%； 2分：陽性細胞百分比25%-50%； 3分：陽性細胞 百分tt5o%-75%； 4分：陽性細胞百分比75%及以上

30、.2.6酶聯免疫吸附試驗（1）實驗前20分鐘從冰箱取出試劑盒及待測血清樣本，平衡至室溫。（2）建立標準曲線：設標準管8孔，每孔中各加入樣品稀釋液100u1,第一 孔加標本品looul,混勻后用加樣器吸出looul,移至第二孔。如此反復對倍稀釋 至第七孔，最后，從第七管中吸出looul棄去，使之體積均為100ulo第八孔為空 白對照。（3）加樣：待測品孔中每孔各加入待測樣品looul.（4）將反應板置37。（： 120分鐘。（5）洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌6次，向濾紙上印干。（6）每孔中加入第一抗體工作液50ul。（7）將反應板充分混勻后置37°c 60分鐘。（8）洗板：用洗滌液將

31、反應板充分洗滌6次，向濾紙上印干。（9）每孔中加入酶標抗體工作液looul。（10）將反應板置37°c 120分鐘。（11）洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌6次，向濾紙上印干。（12）每孔中加入底物工作液looul,置37。（：暗處10分鐘。（13）每孔加入50ul終止液混勻。（14）在450nm處測吸光值。以標準品濃度為橫坐標，od值為縱坐標，將不同稀釋濃度標準品od值減空 白對照od值繪制成曲線，平滑曲線連接各標準品的坐標點。以標本od值減空白對照0d值，所得值在標準曲線上得出相應ykl40濃度。2.7 rt-pcr1細胞培養三種肝癌細胞株及兩種正常肝細胞株分別在10%胎牛血清的d

32、mem培養液 中于5%co2、37°c培養箱培養，待細胞生長鋪滿培養皿底后，0.25%胰蛋白酶 消化傳代種植于六孔培養板中，72小時后待細胞達8090%融合時收集細胞。2細胞rna的提取采用trizol® reagent提取細胞總rna的方法具體如下：(1) 所有用品均經0.1%depc水處理并高壓蒸汽滅菌(包括eppendorf管/ep 管，tip頭等)，所有操作均在無菌操作臺進行。(2) 在每一個培養孔中加lmltrizol® reagent,用tip頭吹打，將底部的細胞均溶解在溶液中，再將溶液移入1.5mlep管中，室溫靜置5分鐘。(3) 加入0.2ml氯仿

33、，上下振蕩15秒混勻，冰置5分鐘。(4) 12000rmp 4°c 離心 15 分鐘。 收上清于1.5mlep管，加等量異丙醇振蕩混勻，室溫靜置10分鐘。(6) 12000rmp4°c離心10分鐘，棄上清，留下rna沉淀。(7)加70%的乙lml,顛倒混勻，7500rmp 4°c離心5分鐘。(8) 棄乙醇，室溫空氣中晾干1015分鐘，至微量乙醇揮發干凈，加入20u1depc處理的滅菌去離子水溶解rna,3 rna的測定紫外分光度計掃描測定rna濃度和純度：吸取5ulrna的樣品加depc處 理的滅菌去離子水2.95ml稀釋至3ml,以3ml稀釋用水效正分光光度計的

34、零點, 在260nm及280nm兩個波長下讀數，在260nm的讀數用于記數樣品中的核酸濃 度，根據od260/od280的值估計核酸的純度。樣品rna濃度(g/ml)計算公式 為:a260 x稀釋倍數x40 g/ml, rna純樣品的od260/od280值分別為2.0。如 果樣品中有蛋白質或酚污染，其od260/280將明顯低于此值，此時無法對樣品 中的核酸進行精確定量。4引物(1) ykl40引物：ykl-40 正向引物：5' ggatggaactttgggtctca 丁。ykl-40反向引物：5gctgtttgtctctccgtcca3,引物自身不含互 補或發夾結構，擴增片段長度

35、為175bpo(2) gapdh 引物：gapdh 正向引物:5' ccacccatggcaaattccatg-3gapdh 反向引物:5，tctagacggcaggtcaggtccacc丁，擴增片段 長度為598bp°引物設計后，由上海生工生物工程技術服務有限公司dna合成部合成，合 成后的引物用滅菌去離子水配成10umol/l濃度。5 rt-pcr按照revert aid first strand cdna synthesis kit說明書進行。先在逆轉錄酶 的作用下，用已提取的mrna為模板合成互補的cdna,再以此cdna為模板 進行pcr反應，獲取雙鏈dna。rtp

36、cr中的關鍵步驟是rna的逆轉錄，要求 rna模板必須是完整的，且不含dna、蛋白質等雜質。(1) cdna鏈的合成：在反應體系中依次加入：depc處理水9uloligo(dt)15primer(0.5ug/ul)2ul樣品rna4ul15ul混勻，瞬時離心后7(tc加熱5分鐘,立即置冰上冷卻，再依次加入depc處理水0.5ul5><m-mlv reverse transcription buffer5uldntpmix(lomm)2.5ulribolock rnasin inhibitorlulm-mlv reverse transcriptaselul10ultotal vol

37、ume25ul混勻，瞬時離心后42c30分鐘，99*c5分鐘滅活逆轉錄酶，冰上放置5分鐘。(2) pcr擴增在中號ep管中依次加入下列成分ddh2olul2xpcr master mix12.5ulprimer( 1 oumol/l)2ulprimer(10umol/l)2ulfirst strand cdna7.5ul25ultotal volumepcr反應條件:94*c3分鐘94r30 秒，60*c 30 秒，72*c30 秒共 35cycles72 *c7分鐘35cycles94x? f 94cf 60°cf 72*c 72cf 4*c 3min 30sec 30sec 30

38、sec 7min(3) ykl40 mrna pcr 產物鑒定取ykl-40 mrna pcr產物5ul,在2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測擴增結果， 以內對照gapdh引物擴增的pcr (反應條件同前)作為內對照，并用dna分 子量標準檢査特異性擴增條帶大小。2.8統計學方法采用spss13.0軟件進行分析，采用單因素方差分析及完全隨機多個獨立樣 本kruskal-wallis h檢驗比較分析肝細胞癌組、肝硬化組與乙型肝炎病毒攜帶組 間血清ykl-40濃度，采用roc曲線來評價ykj40對肝細胞癌中的診斷價值。 p<0.05為有統計學意義。第三章結果3.1肝癌患者肝癌組織及癌旁肝組織ykl40

39、的表達ykl40免疫組織化學染色陽性表現為胞質棕色顆粒狀物質（見圖1）。肝細 胞癌患者肝癌切除術后，免疫組織化學染色顯示8例肝癌患者肝癌組織ykl40表達明顯高于癌旁肝組織（p<0.01）ob圖1肝癌組織及癌旁組織ykl40免疫組織化學染色a： ykl40陽性免疫染色呈現出胞質棕色顆粒狀物質；b：無染色肝細胞。表1顯示，在8例肝癌患者肝臟組織中，大部分肝癌組織陽性細胞與所有細胞 比值大于50% （7/8, 87.5%）,而所有癌旁肝組織的陽性細胞比值低于50%（8/8, 100%）；另一方面，肝癌組織的陽性細胞總分值為28分，顯著高于對照組癌旁肝 組織總分值為7分（pv0.01）。表1肝

40、癌組織及癌旁組織ykl-40免疫組織化學染色分析組別ykl-40陽性細胞分值總分值*01234肝癌組織1 2528癌旁組織25170分（陽性細胞百分比5%以下）、1分（陽性細胞百分比5%-25%） . 2分（陽性細胞百分比25%-50%）、3分（陽性細胞百分比50%-75%）. 4分（陽性細胞百分比75%及以上）；總分值 為所有患者陽性細胞百分比所占分值總和，相比于癌旁肝組織，肝癌組織的總分值有明顯差異(p<0.01) 3.2研究對象一般情況及生化參數表2顯示了肝細胞癌組、肝硬化組、非活動期乙型肝炎病毒攜帶組三組間的 年齡差異及性別特征無統計學意義（px）.o5）:肝硬化組患者肝纖四項比

41、肝細胞 癌組及非活動期乙型肝炎病毒攜帶組明顯增高（pv0.05）；而肝細胞癌組患者甲 胎蛋白明顯高于肝硬化組和非活動期乙型肝炎病毒攜帶組患者（pv0.05） o表2三種不同肝病患者的一般情況及生化特征生化待征肝細胞癌組非活動期乙型肝炎病莓攜帶組肝硬化組病例數303030年齡（歲）45.81±18.0943.90±21.4539.8h19.56性別（男性）272828alt(u/l)215.84±125.7028.7h16.58*189.34±34.89glo(gzl)34.8u21.8025.73±19.14*35.25h7.66alb(g/l

42、)38.95±15.1139.91±21.9930.h17.4phinp(pg/l)15.6q±8.4314.74±2.3225.0w07"ha(>ig/l)187.1±s&06715±43.7137639±23112"ivco!(gg/l)184.7±76.6988.h45.0828709±16545"ln（嶼）189.4±75.8167.1 ±34.593%21±176血"afp(ng/ml)57809±32

43、113"21.55±18.4156.75±34.24virological markerhbvhbvhbvalt：谷丙轉氨酶；glo：球蛋白；alb：白蛋白：pfflnp： iii型前膠原肽：ha：透明質 酸；ivcol : iv型膠原質；ln：層粘連蛋白：hbv：乙型肝炎病毒：afp：甲胎蛋白： virological marker :病毒學標志；p<0.05有統計學意義（粗體顯示）；與肝細胞癌組或肝 硬化組相比,pv0.05；"與非活動期乙型肝炎病毒攜帶組或肝細胞癌組相比p<0.05；與非活動期乙型肝炎病毒攜帶組或肝硬化組相比p<0

44、.05>表3顯示了三種不同肝病患者血清中的ykl-40濃度，肝硬化患者及肝細胞癌患者血清的ykl40濃度明顯高于非活動期乙型肝炎病毒攜帶患者血清的ykl40濃（p<0.01）；然而肝硬化患者與肝細胞癌患者兩組間血清ykl40濃度沒走有差異（px）05）。我們定義血清ykl40濃度大于100ng/ml為高ykl4o水平患者，40肝硬化患者及肝細胞癌患者高ykl40水平患者百分比明顯高于對照組非活動期乙型肝炎病毒攜帶患者（p<0.01）。表3 三種不同肝病患者血清ykl-40濃度組別病例數ykl40濃度(ng/ml)高ykl-40水平患者百分比非活動期乙型肝炎病毒攜帶者3061.

45、35±46686(20%)肝硬化30196.4i47.61 28(93%廣肝細胞癌30193.86±48.76 28(93% 尸肝硬化患者及肝細胞癌患者血清ykl40濃度和高ykl40患者百分比，與慢性乙型肝炎 患者相比，有顯著性差異（p<0.01）；但是肝細胞癌患者與肝硬化患者相比，兩者之間的血清 ykl-40濃度和高yki.-40患者百分比無顯著性差異（px）.o5）。roc曲線分析結果顯示，肝癌組（a）、肝硬化組（b）及非活動期乙型肝 炎病毒攜帶者（c）組roc曲線下面積（auroc）分別為0.716、0.742及0.046 （見圖2）,所得的結果有統計學意義（

46、p<0.001）o不同肝病患者血清ykl40濃 度的roc曲線下面積（auroc）、敏感度及特異度（見表4）。圖2 roc曲統分析ykl40診斷價值肝癌組血清ykl40濃度roc曲線下面積為0.716；肝硬化組roc曲線下面積為0.742；乙型肝炎病毒攜帶者組roc曲線下面積為0.046,乙型肝炎攜帶組曲 線下面積相較于肝癌組及肝硬化組明顯偏小。roc曲線下面積分析ykl-40對肝 細胞癌及肝硬化具有一定的診斷價值，但對乙型肝炎病毒攜帶者不具有診斷意 義。表4不同患者roc曲線下面積、靈敏度及特異度組別auroc靈敏度（）特異度（）肝細胞癌0.71689.753.3肝硬化0.742833

47、61非活動期乙型肝炎病毒攜帶者0.954»933拿89.8*曲線f面積越小，其排除診斷亦有意義。3.3不同肝癌及肝細胞株ykl-40 mrna的表達k:狀lrt-pcr檢測三種肝癌細胞株hepg2> huh-7. lm-3及人正常肝細胞株qsg-770l人肝星狀細胞株lx2中ykl-10mrna的表達。結果如圖3,正常肝 細胞株qsg-7701.肝星狀細胞株lx2幾乎沒有ykl-40 mrna表達：而肝癌細胞株hepg2、lm3、h訕7均有ykl-40 mrna表達。1、人正常肝細胞株qsg-77012、人肝星狀細胞株lx23、肝細胞癌細胞株hepg2gapdhykl-404、

48、肝細胞癌細胞株lm35、肝細胞癌細胞株huh7內參gapdh表5顯示了qsg-7701細胞、lx2細胞、hepg2細胞、lm3細胞、huh7細胞 中ykl40的灰度值，使用gapdh作為對照參數，肝癌細胞株中的ykl40灰度 值均在60以上，而正常肝細胞株中的ykl40灰度值在6以下。表5各細胞株ykl-40 mrna水平灰度值及指數qsg-7701lx-2hepg2lm3hun-7ykl-4097.9693.39142.25102.66176.66gapdh215.19201.62149.14109.19207.74指數5.782.3688.2064.5573.43ykl-40mrna 灰度

49、值指數二（ykl-4o-背景）xioo/（gapdh背景）。正常肝細胞株：qsg-7701. lx-2；肝細胞癌細胞株：hepg2、huh-7 . lm-3.第四章討論肝細胞癌(hcc)發病率在男性中位列第五位，女性中在第八位，hcc的發 病率和病死率基本相當，五年生存率在3%>5%.hcc患者的存活率很低，在 臨床上，大部分患者就診時已是腫瘤晚期，已失去治療的最佳時機，因此早期診 斷就顯得尤為重要。目前臨床上主要運用甲胎蛋白(afp)結合彩像學及病理學 檢査進行肝癌的早期診斷，但是afp對于肝癌篩査的敏感度及特異性均不十分理 想。在我國hcc的診斷包括病理學診斷標準和臨床診斷標準。肝癌

50、的臨床診斷標 準包括：af400ug/l,能排除妊娠.生殖系胚胎源性腫瘤、活動性肝病及轉移 性肝癌，ct/mri檢査有肝癌特征的占位性病變者；afpv400ag/l能排除妊娠、 生殖系胚胎源性腫瘤、活動性肝病及轉移性肝癌，并有兩種影像學檢査有肝癌特 征的占位性病變或有病理確診的肝外轉移病灶(包括肉眼可見的血性腹水或在其 中發現癌細胞)。腫瘤標記物是癌細胞生長過程中產生的一種或幾種正常情況下沒有的或含 量很低的特異性物質，或是宿主細胞因癌細胞入侵而過量產生的正常細胞組分 腫瘤標記物及其相關基因的檢測，將有助于hcc的早期發現和診斷，并能有效 用于腫瘤病變程度及預后判斷，為治療方案選擇和病情動態觀

51、察提供依據。隨著 分子診斷技術的發展，對hcc診斷具有價值的腫瘤標記物正逐漸被人們發現， 這些標志物涉及肝癌的蛋白質抗原、酶和同工酶、細胞因子、相關基因等幾個方 面，然而在單項測定這些腫瘤標記物時其靈敏性、特異性，或在臨床運用的實用 性等方面或多或少都存在一定的局限性。甲殼質酶蛋白40 (ykl-40),是于1992年johansen等【刃在一項骨蛋白的體 外研究實驗中，發現人骨肉瘤細胞系mg63的體外培養能大量分泌一種蛋白。ykl40(基因庫編號：m80927)屬于哺乳動物蛋白質組，其一組氨基酸序列類似于細菌幾丁質酶18糖基水解酶組叫johansen等在一系列正常組織類型的cdna庫中發現y

52、kl40基因：脂肪、腎上腺髓質、骨骼、骨齟、腦組織、軟骨、子宮頸、大腸、內分泌腺、眼睛、胃腸道、泌尿生殖器、生殖細胞、腎臟、肝臟、 肺、淋巴結、乳腺、神經組織、卵巢.胰腺、垂體、胎盤、視網膜、脾、骨膜和 子宮吻。在體外試驗中，下列人類細胞株均分泌ykl40：骨肉瘤，惡性膠質瘤,神經膠質瘤，前列腺癌和惡性黑色素瘤。免疫組化研究證實，ykl40蛋白高度表達于乳腺癌、結腸癌及神經膠質瘤活檢癌細胞中卩戮在慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎以及酒精性肝病中，血清ykl40濃度與肝 纖維化及肝硬化程度相關【心刃。在乙型肝炎病毒感染者中，慢性肝炎患者與乙型 肝炎肝硬化患者血清ykljo水平有明顯差別。在丙型肝炎病毒

53、感染者中，血清 ykl.40水平與丙型肝炎病毒所致的肝纖維化嚴重程度有關"1,同時，ykl-40 在評估肝纖維化程度以及預測干擾素抗病毒治療療效中，可能是一種有效的非血 管侵入性檢査指標皿忙在酒精性肝硬化、肝炎后肝硬化及肝炎后肝纖維化患者 中，血清ykl40濃度明顯高于正常人及脂肪肝患者。camilla等研究了370例 酒精性肝病患者，隨訪470天，其血清ykl4）和puinp水平均顯著升高，這與酒 精性肝病患者出現肝纖維化相關，也提示了這類患者預后不佳。ykl40生物學功能不完全明確，但它被認為通過生長因子樣活性參與炎癥 介質活動和細胞外基質重建。此外，一些研究表明ykl40在腫瘤

54、細胞増殖及侵 襲發揮著重要作用【。另有許多研究報道血清ykl40作為腫瘤標志物在預測癌 癥患者預后生存期有明確價值卻。ykl40能否在肝細胞癌診斷中作為一種新 的腫瘤標志物仍不明確。到目前為止，本研究是首次報道ykl40在肝細胞癌患 者中的表達，本研究結果表明ykl40在肝癌組織中的表達明顯高于癌旁肝組織。 相較于非活動期乙型肝炎病毒攜帶者，肝細胞癌患者血清ykl40水平顯著升高， 93%的肝癌患者血清ykl40水平在100ng/ml以上（見表3）。這些結果表明ykl40 在肝細胞癌組織及血清中均高度表達。因此，ykl40作為一種新的腫瘤標志物 可能在檢測肝細胞癌具有一定的潛在價值。）濃 其

55、類在肝病中ykj40的細胞來源不是很明確，目前推測與肝纖維化密切相關的 肝星狀細胞可能分泌ykl40。肝星狀細胞在肝纖維化形成中發揮著重要的作用， 它們在diss腔與肝細胞及內皮細胞有密切接觸紹。但是在本研究中，結果表明人 肝星狀細胞株lx2幾乎不表達ykl40mrna （見表3）,這可能是由于lx2細 胞僅具有早期未活化星狀細胞的形態學特征，而不具備星狀細胞生化功能有關 卩叫肝星狀細胞是否是ykl-40細胞來源需進一步證實。在我們的研究中，肝細 胞癌hepg2、lm3和huh7細胞株能表達高水平ykl-40 mrna. lau等通過基 因芯片檢測，在原發性肝細胞癌h2p細胞株研究中證實了簇生因子能明顯上調 ykl40基因表達，提示cluy