1、高壓液相色譜 HPLC培訓教程(一)I 概論一、液相色譜理論發展簡況色譜法的分離原理是：溶于流動相 (mobile phase) 中的各組分經過固定相時，由于與固定相 (stationary phase) 發生作用(吸附、分配、離子吸引、排阻、親和)的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而 先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。色譜法最早是由俄國植物學家茨維特( Tswett )在 1906 年研究用碳酸鈣分離植物色素時發現的，色譜法 (Chromatography) 因之得名。后來在此基礎上發展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在

2、室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經典液相色譜法， 此方法柱效低、時間長(常有幾個小時)。高效液相色譜法 (High performance Liquid Chromatography ，HPLC) 是在經典液相色譜法的基礎上， 于 60 年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。 它與經典液相色譜法的 區別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜 法(High Pressure Liquid Chromatography , HPLC又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(High Speed LiquidChromatography， H

3、SLP)。也稱現代液相色譜。二、HPLC的特點和優點HPLC有以下特點：高壓-壓力可達150300Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。高速-流速為 0.110.0 ml/min 。高效-可達 5000 塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達 100種。高靈敏度 - 紫外檢測器靈敏度可達 0.01ng 。同時消耗樣品少。HPLC與經典液相色譜相比有以下優點：速度快 - 通常分析一個樣品在 1530 min ，有些樣品甚至在 5 min 內即可完成。分辨率高 - 可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。靈敏度高-紫外檢測器可達 0.01 ng，熒光和電化學檢測器可達O.1pg。柱子

4、可反復使用 - 用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收 -樣品經過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。三、色譜法分類按兩相的物理狀態可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色譜法適用于分離揮發性化合物。GC根據固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應用最廣。液相色譜法適用于分離低揮發性或非揮發性、熱穩定性差的物質。LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法（SFC），它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動相（常用CO2，因其擴散系數大，能很快達到平衡，故分析時間短，特別適用

5、于手性化合物的拆分。按原理分為吸附色譜法（AC）、分配色譜法（DC）、離子交換色譜法（IEC）、排阻色譜法（EC,又稱分子篩、凝 膠過濾（GFC）、凝膠滲透色譜法（GPC和親和色譜法，此外還有電泳。按操作形式可分為紙色譜法 （PC）、薄層色 譜法 （TLC） 、柱色譜法。四、色譜分離原理 高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜 法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。1液固色譜法 使用固體吸附劑,被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度510卩m。適用

6、于分離分子量 2001000的組分,大多數用于非離子型化合物,離子型化合物易產生拖尾。常用于分離同分異構體。2液液色譜法 使用將特定的液態物質涂于擔體表面,或化學鍵合于擔體表面而形成的固定相,分離原理是根據被分離的 組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。涂布式固定相應具有良好的惰性；流動相必須預先用固定相飽和,以減少固定相從擔體表面流失；溫度的 變化和不同批號流動相的區別常引起柱子的變化； 另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現在已很少采用。現在多采用的是化學鍵合固定相，女口C18、C&氨基柱、氰基柱和

7、苯基柱。液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法（NPC）和反相色譜法（RPC）。正相色譜法采用極性固定相 （如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相 ） ；流動相為相對非極性的疏水性溶劑 （烷烴類如正已烷、 環已烷）,常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性 較強的化合物 （如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。反相色譜法一般用非極性固定相（如 C18 C8）;流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋 喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用最為廣泛，據統計，它占整個HP

8、LC應用的80%左右。隨著柱填料的快速發展, 反相色譜法的應用范圍逐漸擴大, 現已應用于某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離,常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.57.5 （28）,太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在 pH1.510范圍操作。正相色譜法與反相色譜法比較表反相色譜法正相色譜法固定相極性高中中低流動相極性低中中高組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出從上表可看出，當極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。3離子交換色譜法固定相是離子交換樹脂，常用苯

9、乙烯與二乙烯交聯形成的聚合物骨架，在表面未端芳環上接上羧基、磺酸 基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子 與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷 吸引力而分離。緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關外，它還受流動相的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不利于樣品的解離，導致樣品較快流出。 離子交換色譜法主要用于分析有機酸、氨基酸、多

10、肽及核酸。4離子對色譜法又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化 合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強度大的酸堿物質。分析堿性物質常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也 可與多種堿性樣品形成很強的離子對。分析酸性物質常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。離子對色譜法常用 ODS柱（即C18）,流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入310 mmol/L的離子對試劑, 在一定的pH值范圍內進行分離。 被測組分保時間與離子對性質、 濃度、流動相組成及其pH值、