1、抗菌肽對錦鯉生長和非特異性免疫的影響摘 要： 在一種實用飼料配方的基礎上，分別添加0、75、150和225mg/kg抗菌肽配制成4種等能等氮（CP 32%, GE 14.8 MJ/Kg）的試驗飼料。在室內循環水簇缸內飼喂錦鯉(體重10g±0.16)9周，研究抗菌肽對錦鯉生長和非特異性免疫的影響。結果表明：不同水平抗菌肽對錦鯉的生長和非特異性免疫均有顯著的影響(P<0.05)。150mg/kg水平組錦鯉的末重和瞬間生長率均顯著高于對照組（0mg/kg）和高劑量組（225mg/kg），與75mg/kg水平無差異(P>0.05)。各實驗組飼料系數、蛋白質效和攝食率均無顯著差異(

2、P>0.05)。各實驗組錦鯉的成活率均為100%。150、225mg/kg水平組錦鯉的臟體比、肝體比顯著低于0和75mg/kg水平。而各實驗組錦鯉的肥滿度無顯著差異(P>0.05)。隨著抗菌肽水平的增加，錦鯉腸道Na+/K+-ATPase活力顯著升高(P<0.05)。150、225mg/kg水平組錦鯉血清的CAT、SOD和AKP活性顯著高于0和75mg/kg水平。而各實驗組血清溶菌酶活性無顯著差異(P>0.05)。維氏氣單胞菌攻毒后各試驗組發病率為60%左右，顯著低于對照組的90% (P < 0.05)。總的來看，飼料中添加適量的抗菌肽對錦鯉有一定的促生長作用，并

3、能提高錦鯉的免疫相關指標和抗病力，其適宜添加量為150mg/kg。關鍵詞: 錦鯉；抗菌肽；生長；非特異性免疫 隨著集約化養殖模式的推廣，我國魚類養殖業得到了迅猛發展。然而，由于高密度養殖、投飼頻率增加以及水體污染等問題，加之魚類種質資源退化，養殖魚類抗病力降低，感染疾病的幾率大大升高，給養殖業造成了巨大損失。因此，如何提高魚類免疫抗病力是保證我國水產養殖業可持續發展的有效途徑。抗菌肽(antibacterial peptides) 是生物體產生的一種具有強抗菌活性的陽離子多肽， 是生物先天性免疫的重要組成成分。抗菌肽不僅具有廣譜的抗細菌活性，還具有高效的抗真菌、病毒和原蟲的活性，其抗菌機理獨特

4、，不易產生耐藥性，同時能提高機體的免疫力。大量的研究證實，抗菌肽是一種安全、無殘留、環保的飼料添加劑，并已在畜牧業中得到應用。目前，有關抗菌肽在水產養殖生產的研究較少。為此，本研究以錦鯉為對象，在飼料中分別添加不同劑量的天蠶素抗菌肽，觀察其對錦鯉生長性能、腸道吸收能力和免疫相關酶活性的影響，并確定飼料中抗菌肽的最適添加量，為抗菌肽在錦鯉飼料中的合理應用提供依據。 1 材料和方法1.1 試驗飼料以魚粉(秘魯直火烘干紅魚粉)、豆粕、菜粕和棉粕(預壓浸提)作為蛋白源；以豆油和米糠(含粗脂肪14.6%)作為脂肪源，配制一種基礎飼料配方，分別添加0、75、150和225mg/kg天蠶素抗菌肽（由國家飼料

5、工程技術研究中心提供）配制成4種等能等氮（CP32%, GE14.8 MJ/Kg）的試驗飼料（Diet1(對照組, 0mg/kg)、Diet2(75mg/kg)、Diet3 (150mg/kg)和 Diet4(225%)），配方組成見表1。飼料原料均粉碎過40目篩，飼料調質溫度為80oC，分別制成2.0的硬顆粒飼料。60烘干后，保存于-15冰柜中備用。表1 試驗飼料組成及營養水平（風干基礎） Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis, g/kg)原料 Ingredients (g/k

6、g)Diet1Diet2Diet3Diet4魚粉 Fish meal (645 g/kg protein)60606060豆粕 Soybean meal (430g/kg protein, solvent extracted)220220220220菜籽粕 Rapeseed meal (370 g/kg protein, solvent extracted)250250250250棉籽粕 Cottonseed meal (420 g/kg protein, solvent extracted)160160160160次粉 Wheat middlings200200200200米皮糠 Rice

7、bran70707070豆油 Soybean oil10101010氯化膽堿 Choline chloride1111天蠶素抗菌肽cecropin00.0750.150.225維生素預混料 Vitamin premix1)15151515礦物質預混料Mineral premix2)30303030營養水平 Nutrient levels (g/kg dry matter )粗蛋白質 Crude protein323324324323粗脂肪 Crude lipid38.939.238.738.8粗灰分 Crude ash55.454.354.154.7總能 Gorss energy (MJ/kg

8、)14.8314.8314.8214.861) 維生素預混料為每千克飼料提供 Vitamin premix provided per kg of diet：VA 25 mg，VD3 5 mg，VE 40 mg，VC 500 mg，VB1 12 mg，VB6 6 mg，VB12 0.05 mg，VK3 5 mg，核黃素 riboflavin 5 mg，肌醇 inositol 100 mg，泛酸 pantothenic acid 30 mg，煙酸 niacin 35 mg，葉酸 folic acid 2 mg，生物素 biotin 0.06 mg，乙氧基喹啉 ethoxyquin 150 mg，次

9、粉 wheat middling 14.09 g。2) 礦物質預混料為每千克飼料提供 Mineral premix provided per kg of diet：KCl 200 mg，KI 60 mg，CoCl2·6H2O 7 mg，CuSO4·5H2O 14 mg，FeSO4·H2O 400 mg，ZnSO4·H2O 200 mg，MnSO4·H2O 80 mg，Na2SeO3·5H2O 65 mg，MgSO4·7H2O 3 000 mg，Ca(H2PO4)2·H2O 20 g，NaCl 136 mg。1.2

10、飼養管理試驗魚選用當年培育的錦鯉。試驗魚馴食適應環境10天后，選取體質健壯、規格整齊、平均體重為10g的錦鯉560尾，隨機分成4組，每組下設4個重復，每個重復35尾魚，飼養在室內淡水循環玻璃水族箱(有效體積為300 L)中。日投喂率為體重的4%6%，每天08：30、12：30和17：30各投喂1次，每2周稱重1次，調整投飼量。每天早上清除箱內糞便，并換水1/4。飼養時間為8周。養殖水源為曝氣自來水，試驗期間定時對水質進行監控，養殖全程水溫為(27.6±2.2) ，pH為7.2±0.4，溶解氧為>6.3mg/L，氨氮<0.48 mg/L，亞硝酸鹽氮<0.06

11、 mg /L。1.3 樣品制備與分析飼養試驗結束，禁食24h后稱重，每箱取4尾魚作全魚樣品；每箱取5尾魚的肌肉、腸道和肝胰臟作樣品;每箱取5尾魚于尾鰭靜脈竇取血, 靜置2h, 以10 000×g 4 條件下離心15 min , 得到空腹血清樣品,置- 20 冰箱待用。取出肝胰臟和腸道，立即放入液氮罐中速凍，然后轉入80 低溫冰箱保存。肝胰臟和腸道勻漿液在6000×g 4 條件下離心10 min，取上清液作為酶活性分析樣品，20 保存備用。飼料原料及魚體樣品均在105 烘干至恒重，然后進行營養成分測定。采用凱氏定氮法測定樣品的總氮含量，將測定結果乘以6.25即得粗蛋白質含量，

12、粗脂肪含量采用索氏抽提法，粗灰分含量采用高溫（550 ）灰化法測定。腸道Na+/K+-ATP酶、血清溶菌酶、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、堿性磷酸酶（AKP）和過氧化氫酶（CAT）活性采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒進行測定。組織中蛋白含量采用考馬斯亮蘭法測定。1.4 攻毒試驗 養殖實驗結束并取樣后, 再穩定7d (期間投喂各組飼料)后每桶取8 尾魚（每個處理32尾）進行維氏氣單胞菌攻毒試驗。攻毒期間各處理均投喂對照組(Diet1)飼料。將培養好的維氏氣單胞菌稀釋到6×108 cfu /ml, 按照每尾注射0.3ml 的劑量將維氏氣單胞菌注射到錦鯉的背鰭基部。注射24h以后,

13、 開始記錄死亡魚的數量和時間, 共14d。攻毒試驗期間, 記錄死亡和未死亡魚的病癥。1.5計算公式特定生長率(specific growth rate，SGR，%d)=100×ln末重（g）ln初重（g）/試驗天數(d)；蛋白質效率(protein efficiency ratio，PER，%)=100×魚體增重(g)/蛋白質攝人量(g)；飼料系數(feed conversion ratio，FCR)=總干物質攝食量(g)/魚體總增重(g)；臟體比(viscerosomatic index，VSI，%)=100×內臟重（g）/魚體重（g）；肝體比（hepatoso

14、matic index，HSI，%)=100×肝胰臟重(g)/魚體重(g)。1.6 數據處理與分析除成活率外，數據均以平均值±標準誤表示，采用SPSS 11.0對所得數據進行單因素方差分析（One-way ANOVA），若差異達到顯著，則進行Duncan多重比較，顯著性水平為P<0.05。2 結果與分析2.1 抗菌肽對錦鯉生長性能的影響由表2可見，不同水平抗菌肽對錦鯉的生長均有顯著的影響(P<0.05)。150mg/kg水平組錦鯉的末重和瞬間生長率均顯著高于對照組（0mg/kg）和高劑量組（225mg/kg），與75mg/kg水平無差異(P>0.05)。各

15、實驗組飼料系數、蛋白質效和攝食率均無顯著差異(P>0.05)。各實驗組錦鯉的成活率均為100%。表2 抗菌肽對錦鯉生長性能的影響Table 2 Effect of ferment cottonseed protein on growth performance of koi項 目 ItemsDiet1Diet2Diet3Diet4S.E.M.P-Value初重 IBW/g10.310.310.310.20.0470.876末重 FBW/g41.1b42.5 ab42.9 a41.2 b0.2980.040特定生長率 SGR/ (%/d)2.19 b2.24 ab2.29 a2.21 b0

16、.0110.033飼料系數FCR/%1.95 1.84 1.711.82 0.0410.222蛋白質效率 PER/%1.61 1.70 1.831.720.0380.206攝食率 FI/%(g100 g -1BWday-1)3.67 3.473.333.430.0560.187成活率Survival rate/%100100100100同行數據肩注不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.

17、05). 2.2 抗菌肽對錦鯉形體指標的影響由表3可知，150、225mg/kg水平組錦鯉的臟體比、肝體比顯著低于0和75mg/kg水平。而各實驗組錦鯉的肥滿度無顯著差異(P>0.05)。表3 抗菌肽對錦鯉形體指標的影響Table 3 Effect of ferment cottonseed protein on growth performance of koi項 目 ItemsDiet1Diet2Diet3Diet4S.E.M.P-Value臟體比 (濕重基礎)VSI (wet matter basis)7.56 a7.44 a7.24 b7.26 b0.0450.007肝體比 (濕

18、重基礎)HSI (wet matter basis)1.46 a1.35 b1.27 c1.25 c0.0260.001肥滿度 (濕重基礎)CF (wet matter basis)2.832.862.892.850.0120.413同行數據肩注不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). 2.3 抗菌肽對錦鯉腸道吸收能力的影響不同水平抗菌肽對錦鯉腸道的吸收能力有顯著的影響，見圖1。隨著抗菌肽水平的增加，錦鯉腸道Na+/K+-ATPase活力顯著升高(P<0.05)。2.4 抗菌肽對錦鯉血清非特異性免疫的影響不同水平抗菌肽對錦鯉血清非特異免疫產生不同的影響，見圖2-5。150、225mg/kg水平組錦鯉血清的CAT、SOD和AKP活性顯著高于0和75mg/kg水平(P<0.05)（圖3,4,5）。而各實驗組血清溶菌酶活性無顯著差異(P>0.05)(圖2)。2.5 細菌攻毒試驗表4 維氏氣單胞菌注射攻毒后錦鯉的外觀癥狀時 間對照組75mg組150mg