1、第一節(jié)第一節(jié) 生物傳感器及其在食品檢測生物傳感器及其在食品檢測分析中的應(yīng)用分析中的應(yīng)用 由固定化的具有分子識別功能的生物材料、換由固定化的具有分子識別功能的生物材料、換能器和信號處理放大裝置組成的分析工具或系統(tǒng)。能器和信號處理放大裝置組成的分析工具或系統(tǒng)。（一）生物傳感器的基本組成和分類（一）生物傳感器的基本組成和分類 1.1.生物傳感器的基本組成生物傳感器的基本組成 生物識別元件：生物傳感器中固定化的酶、生物識別元件：生物傳感器中固定化的酶、微生物細胞、抗原抗體和組織切片等具有分子識微生物細胞、抗原抗體和組織切片等具有分子識別能力的生物敏感材料。別能力的生物敏感材料。 換能器：能將在生物敏感

2、材料上進行的生化換能器：能將在生物敏感材料上進行的生化反應(yīng)產(chǎn)生的各種信息轉(zhuǎn)換成電信號的裝置。反應(yīng)產(chǎn)生的各種信息轉(zhuǎn)換成電信號的裝置。 信號處理裝置：負責信號的分析處理和放大信號處理裝置：負責信號的分析處理和放大輸出。輸出。2.2.生物傳感器的分類生物傳感器的分類 根據(jù)生物敏感材料可分為根據(jù)生物敏感材料可分為酶傳感器、微酶傳感器、微生物傳感器、免疫傳感器、細胞傳感器、組生物傳感器、免疫傳感器、細胞傳感器、組織傳感器和織傳感器和DNADNA傳感器。傳感器。 根據(jù)換能器的不同，可分為電化學(xué)傳感根據(jù)換能器的不同，可分為電化學(xué)傳感器、介體生物傳感器、測光型生物傳感器、器、介體生物傳感器、測光型生物傳感器、

3、測熱型生物傳感器等。測熱型生物傳感器等。 具體到某一種傳感器的命名，一般是采具體到某一種傳感器的命名，一般是采用用“功能功能+ +結(jié)構(gòu)特征結(jié)構(gòu)特征”的方法，例如，葡萄的方法，例如，葡萄糖氧化酶光纖傳感器等。糖氧化酶光纖傳感器等。 （二）生物傳感器的工作原理（二）生物傳感器的工作原理 通過生物的分子識別作用，生物傳感通過生物的分子識別作用，生物傳感器中的生物敏感材料和生物樣品中的待測器中的生物敏感材料和生物樣品中的待測物質(zhì)特異性結(jié)合，并進行生物化學(xué)反應(yīng)，物質(zhì)特異性結(jié)合，并進行生物化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生離子、質(zhì)子和質(zhì)量變化等信號，信號產(chǎn)生離子、質(zhì)子和質(zhì)量變化等信號，信號的大小在一定條件下和樣品中被測物質(zhì)的

4、的大小在一定條件下和樣品中被測物質(zhì)的量存在一定的關(guān)系，這些信號經(jīng)換能器轉(zhuǎn)量存在一定的關(guān)系，這些信號經(jīng)換能器轉(zhuǎn)換成電信號，電信號再經(jīng)信號分析處理系換成電信號，電信號再經(jīng)信號分析處理系統(tǒng)處理后輸出，反映出樣品中被測物質(zhì)的統(tǒng)處理后輸出，反映出樣品中被測物質(zhì)的量。量。轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換器敏感元件敏感元件待測物待測物生物傳感器的模型生物傳感器的模型 1.分子識別（分子識別（molecular recognition） 生物傳感器中的分子識別生物傳感器中的分子識別:指生物敏感材料中生指生物敏感材料中生物分子能選擇性地和待測樣品中的待測成分進行特物分子能選擇性地和待測樣品中的待測成分進行特異性（選擇性）結(jié)合的性質(zhì)。

5、生物敏感材料包括酶、異性（選擇性）結(jié)合的性質(zhì)。生物敏感材料包括酶、抗原（體）等免疫物質(zhì)、微生物細胞和抗原（體）等免疫物質(zhì)、微生物細胞和DNA等。等。 酶的分子識別酶的分子識別:指酶分子只能和特定的底物分子指酶分子只能和特定的底物分子進行結(jié)合，而不能和其他分子結(jié)合的特性。酶分子進行結(jié)合，而不能和其他分子結(jié)合的特性。酶分子的識別能力主要是由酶的活性中心決定，其決定了的識別能力主要是由酶的活性中心決定，其決定了以酶為生物敏感材料的生物傳感器的分子識別能力。以酶為生物敏感材料的生物傳感器的分子識別能力。 免疫傳感器的分子識別：由傳感器上的生物敏免疫傳感器的分子識別：由傳感器上的生物敏感材料抗原或抗體物

6、質(zhì)的分子識別能力決定，抗感材料抗原或抗體物質(zhì)的分子識別能力決定，抗原和抗體象酶和底物一樣也能發(fā)生特異性（選擇性）原和抗體象酶和底物一樣也能發(fā)生特異性（選擇性）結(jié)合。結(jié)合。 DNA傳感器的分子識別：由傳感器的分子識別：由DNA分子中堿基分子中堿基對的互補結(jié)合特性決定。對的互補結(jié)合特性決定。 2.生化反應(yīng)中量的變化和信號的轉(zhuǎn)換生化反應(yīng)中量的變化和信號的轉(zhuǎn)換 （1）熱焓的變化及其轉(zhuǎn)換）熱焓的變化及其轉(zhuǎn)換 （2）光效應(yīng)及其轉(zhuǎn)換）光效應(yīng)及其轉(zhuǎn)換 （3）顏色的變化及其轉(zhuǎn)化）顏色的變化及其轉(zhuǎn)化 （4）阻抗的變化及其轉(zhuǎn)換）阻抗的變化及其轉(zhuǎn)換 （5）生化反應(yīng)中其他量的變化及其轉(zhuǎn)）生化反應(yīng)中其他量的變化及其轉(zhuǎn)化化

7、 （6）直接產(chǎn)生電信號）直接產(chǎn)生電信號 將化學(xué)變化轉(zhuǎn)變成電信號將化學(xué)變化轉(zhuǎn)變成電信號 酶傳感器為例酶傳感器為例,酶催化特定底物發(fā)生反應(yīng)酶催化特定底物發(fā)生反應(yīng),從而使特定生成物的量有所增減從而使特定生成物的量有所增減.用能把這類用能把這類物質(zhì)的量的改變轉(zhuǎn)換為電信號的裝置和固定化物質(zhì)的量的改變轉(zhuǎn)換為電信號的裝置和固定化酶耦合酶耦合,即組成酶傳感器即組成酶傳感器.常用轉(zhuǎn)換裝置有氧電常用轉(zhuǎn)換裝置有氧電極、過氧化氫。極、過氧化氫。將熱變化轉(zhuǎn)換成電信號將熱變化轉(zhuǎn)換成電信號 固定化的生物材料與相應(yīng)的被測物作用固定化的生物材料與相應(yīng)的被測物作用時常伴有熱的變化時常伴有熱的變化.例如大多數(shù)酶反應(yīng)的熱例如大多數(shù)酶

8、反應(yīng)的熱焓變化量在焓變化量在25-100kJ/mol的范圍的范圍.這類生物傳這類生物傳感器的工作原理是把反應(yīng)的熱效應(yīng)借熱敏電感器的工作原理是把反應(yīng)的熱效應(yīng)借熱敏電阻轉(zhuǎn)換為阻值的變化阻轉(zhuǎn)換為阻值的變化,后者通過有放大器的后者通過有放大器的電橋輸入到記錄儀中。電橋輸入到記錄儀中。將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枌⒐庑盘栟D(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?過氧化氫酶過氧化氫酶,能催化過氧化氫能催化過氧化氫/魯米諾體系魯米諾體系發(fā)光發(fā)光,因此如設(shè)法將過氧化氫酶膜附著在光纖因此如設(shè)法將過氧化氫酶膜附著在光纖或光敏二極管的前端或光敏二極管的前端,再和光電流測定裝置相再和光電流測定裝置相連連,即可測定過氧化氫含量。即可測定過氧化氫含量。 還

9、有很多細菌能與特定底物發(fā)生反應(yīng)還有很多細菌能與特定底物發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生產(chǎn)生熒光熒光.也可以用這種方法測定底物濃度。也可以用這種方法測定底物濃度。v上述三原理的生物傳感器共同點：上述三原理的生物傳感器共同點： 都是將分子識別元件中的生物敏感物質(zhì)都是將分子識別元件中的生物敏感物質(zhì)與待測物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)與待測物發(fā)生化學(xué)反應(yīng),將反應(yīng)后所產(chǎn)生的化將反應(yīng)后所產(chǎn)生的化學(xué)或物理變化再通過信號轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦艑W(xué)或物理變化再通過信號轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘栠M行測量號進行測量,這種方式統(tǒng)稱為這種方式統(tǒng)稱為間接測量方式間接測量方式.直接產(chǎn)生電信號方式直接產(chǎn)生電信號方式v這種方式可以使酶反應(yīng)伴隨的電子轉(zhuǎn)移、這種方式可以使酶反應(yīng)伴

10、隨的電子轉(zhuǎn)移、微生物細胞的氧化直接微生物細胞的氧化直接(或通過電子遞體或通過電子遞體的作用的作用)在電極表面上發(fā)生在電極表面上發(fā)生.根據(jù)所得的電根據(jù)所得的電流量即可得底物濃度。流量即可得底物濃度。 3.生物放大（生物放大（biological amplification） （1）酶催化放大）酶催化放大 酶是高效專一的催化劑，它可以在很短的時酶是高效專一的催化劑，它可以在很短的時間內(nèi)催化大量底物的轉(zhuǎn)化，通過測定酶所催化反間內(nèi)催化大量底物的轉(zhuǎn)化，通過測定酶所催化反應(yīng)中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量可以推測（判應(yīng)中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量可以推測（判斷）反應(yīng)中比底物減少量或產(chǎn)物增加量少得多的斷）反應(yīng)中

11、比底物減少量或產(chǎn)物增加量少得多的酶量，或與酶相關(guān)聯(lián)的其他物質(zhì)的量，從而實現(xiàn)酶量，或與酶相關(guān)聯(lián)的其他物質(zhì)的量，從而實現(xiàn)生物放大作用。應(yīng)用這一放大原理可以使檢測方生物放大作用。應(yīng)用這一放大原理可以使檢測方法的靈敏度（最小檢出量）比常規(guī)檢測方法提高法的靈敏度（最小檢出量）比常規(guī)檢測方法提高2個數(shù)量級。個數(shù)量級。 （2）底物循環(huán)放大）底物循環(huán)放大 被測物被測物S1或或S2，在酶，在酶E1和酶和酶E2之間不斷循環(huán)，之間不斷循環(huán)，每循環(huán)一次，每循環(huán)一次，E1和和E2都要分別消耗各自的底物都要分別消耗各自的底物C1和和C2，產(chǎn)生對應(yīng)的產(chǎn)物，產(chǎn)生對應(yīng)的產(chǎn)物P1和和P2，而循環(huán)過程，而循環(huán)過程中被測物中被測物S

12、1和和S2的濃度保持不變，通過分析的濃度保持不變，通過分析C1和和C2的消耗量或的消耗量或P1和和P2的增加量就可以測定待測物的增加量就可以測定待測物S1或或S2的量，實現(xiàn)放大效應(yīng)。循環(huán)的次數(shù)越多酶的量，實現(xiàn)放大效應(yīng)。循環(huán)的次數(shù)越多酶消耗的底物和產(chǎn)生的產(chǎn)物越多，放大效率也越高消耗的底物和產(chǎn)生的產(chǎn)物越多，放大效率也越高（圖）。（圖）。 （3）酶級聯(lián)放大）酶級聯(lián)放大 生物體內(nèi)的有些酶（通常為酶原）本身是沒生物體內(nèi)的有些酶（通常為酶原）本身是沒有活性，在輔酶、另外一種酶或酶的變構(gòu)效應(yīng)物有活性，在輔酶、另外一種酶或酶的變構(gòu)效應(yīng)物等激活劑的作用下，酶等激活劑的作用下，酶E1i被激活為酶被激活為酶E1a，

13、E1a激活激活E2i成成E2a，E2a又激活又激活E3i或或E3a，由于酶是，由于酶是催化劑可以連續(xù)使用，這樣經(jīng)過一系列的反應(yīng)，催化劑可以連續(xù)使用，這樣經(jīng)過一系列的反應(yīng)，一個分子的輔酶或變構(gòu)效應(yīng)物等激活劑就能夠產(chǎn)一個分子的輔酶或變構(gòu)效應(yīng)物等激活劑就能夠產(chǎn)生成千上萬分子的生成千上萬分子的E3a，然后，然后E3a催化底物催化底物S3產(chǎn)產(chǎn)生產(chǎn)物生產(chǎn)物P3，通過測定底物的消耗量或產(chǎn)物的生成，通過測定底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量就可以靈敏地測定輔酶或變構(gòu)效應(yīng)物等激活劑量就可以靈敏地測定輔酶或變構(gòu)效應(yīng)物等激活劑的量（圖）。的量（圖）。 優(yōu)點：效率極高，對提高生物傳感器的靈敏度優(yōu)點：效率極高，對提高生物傳感器

14、的靈敏度極為有效。極為有效。 缺點：在生物傳感器中的應(yīng)用條件較為苛刻。缺點：在生物傳感器中的應(yīng)用條件較為苛刻。 （4 4）脂質(zhì)體技術(shù)）脂質(zhì)體技術(shù) 脂質(zhì)體：由類似于細胞膜的脂質(zhì)膜構(gòu)成的微球體，在脂質(zhì)體：由類似于細胞膜的脂質(zhì)膜構(gòu)成的微球體，在微球體的內(nèi)部包含有被酶、熒光素或電活性物質(zhì)標記的抗微球體的內(nèi)部包含有被酶、熒光素或電活性物質(zhì)標記的抗原或抗體等標志物，微球體的外膜上結(jié)合有抗原（抗體），原或抗體等標志物，微球體的外膜上結(jié)合有抗原（抗體），當外膜上的抗原（抗體）與待測的抗體（抗原）發(fā)生反應(yīng)，當外膜上的抗原（抗體）與待測的抗體（抗原）發(fā)生反應(yīng)，并和補體結(jié)合時（或在表面活性劑的作用下），微球體破并和

15、補體結(jié)合時（或在表面活性劑的作用下），微球體破裂，微球體內(nèi)的標志物被釋放。標志物的量大且容易測定，裂，微球體內(nèi)的標志物被釋放。標志物的量大且容易測定，通過測定標志物的釋放量就可以測定出待測抗體（抗原）通過測定標志物的釋放量就可以測定出待測抗體（抗原）的量，從而實現(xiàn)生物放大（圖）。的量，從而實現(xiàn)生物放大（圖）。 缺點：目前還存在著微球體內(nèi)的標志物容易滲漏和脂缺點：目前還存在著微球體內(nèi)的標志物容易滲漏和脂質(zhì)體的穩(wěn)定性較差等不足之處。質(zhì)體的穩(wěn)定性較差等不足之處。 （四）生物傳感器的特點（四）生物傳感器的特點(1)(1)根據(jù)生物反應(yīng)的特異性和多樣性根據(jù)生物反應(yīng)的特異性和多樣性, ,理論上可以制理論上可

16、以制成測定所有生物物質(zhì)的傳感器成測定所有生物物質(zhì)的傳感器, ,因而因而測定范圍廣泛。測定范圍廣泛。(2)(2)一般不需進行樣品的預(yù)處理一般不需進行樣品的預(yù)處理, ,它利用本身具備的它利用本身具備的優(yōu)異選擇性把樣品中被測組分的分離和檢測統(tǒng)一為優(yōu)異選擇性把樣品中被測組分的分離和檢測統(tǒng)一為一體，測定時一般不需另加其他試劑一體，測定時一般不需另加其他試劑, ,使測定過程使測定過程簡便迅速簡便迅速, ,容易實現(xiàn)自動分析。容易實現(xiàn)自動分析。(3)(3)體積小、響應(yīng)快、樣品用量少體積小、響應(yīng)快、樣品用量少, ,可以實現(xiàn)連續(xù)在可以實現(xiàn)連續(xù)在位檢測。位檢測。v(4)(4)通常其敏感材料是固定化生物元件通常其敏感

17、材料是固定化生物元件, ,可反復(fù)多次使用可反復(fù)多次使用v(5)(5)準確度高準確度高, ,一般相對誤差可達到一般相對誤差可達到1%1%以內(nèi)以內(nèi)v(6)(6)可進行活體分析可進行活體分析v(7)(7)傳感器連同測定儀的成本遠低于大型的分析儀傳感器連同測定儀的成本遠低于大型的分析儀, ,因而因而便于推廣普及便于推廣普及v(8)(8)有的微生物傳感器能可靠地指示微生物培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)有的微生物傳感器能可靠地指示微生物培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的供氧狀況和副產(chǎn)物的產(chǎn)生，能得到許多復(fù)雜的物理化的供氧狀況和副產(chǎn)物的產(chǎn)生，能得到許多復(fù)雜的物理化學(xué)傳感器綜合作用才能獲得的信息。學(xué)傳感器綜合作用才能獲得的信息。二、生物傳感器中生物敏

18、感材料的固定化二、生物傳感器中生物敏感材料的固定化和成膜技術(shù)和成膜技術(shù)（一）生物材料的固定化技術(shù)（一）生物材料的固定化技術(shù) 指通過物理或化學(xué)的方法將酶、微生物細胞和抗原抗體指通過物理或化學(xué)的方法將酶、微生物細胞和抗原抗體等生物材料限制在一定的區(qū)間內(nèi)，使生物材料只能在特定的等生物材料限制在一定的區(qū)間內(nèi)，使生物材料只能在特定的區(qū)間進行生化反應(yīng)，而反應(yīng)的底物和產(chǎn)物可以自由擴散的技區(qū)間進行生化反應(yīng)，而反應(yīng)的底物和產(chǎn)物可以自由擴散的技術(shù)。術(shù)。 生物材料常用的固定化方法包括：夾心法、吸附法、包生物材料常用的固定化方法包括：夾心法、吸附法、包埋法、交聯(lián)法、共價結(jié)合法和微膠囊法等（圖）埋法、交聯(lián)法、共價結(jié)合法

19、和微膠囊法等（圖）。 （二）成膜技術(shù)（二）成膜技術(shù) 1.1.半導(dǎo)體生物傳感器中的成膜技術(shù)半導(dǎo)體生物傳感器中的成膜技術(shù) （1 1）紫外線照射法）紫外線照射法 （2 2）光平板印刷法）光平板印刷法 （3 3）噴射法）噴射法 2.L-B2.L-B膜技術(shù)膜技術(shù) 三、生物傳感器在食品安全和品質(zhì)控制中的應(yīng)用三、生物傳感器在食品安全和品質(zhì)控制中的應(yīng)用 （一）農(nóng)藥和抗生素殘留的分析（一）農(nóng)藥和抗生素殘留的分析 1.1.農(nóng)藥殘留的生物傳感器檢測農(nóng)藥殘留的生物傳感器檢測 目前有機磷農(nóng)藥中的馬拉松、甲基馬拉松、目前有機磷農(nóng)藥中的馬拉松、甲基馬拉松、乙基馬拉松、速效磷、久效磷和百治磷等，以及乙基馬拉松、速效磷、久效磷

20、和百治磷等，以及氨基甲酯類農(nóng)藥中的滴滅威、西維因、滅蟲多和氨基甲酯類農(nóng)藥中的滴滅威、西維因、滅蟲多和殘殺威等農(nóng)藥在食品中殘留量的生物傳感器檢測殘殺威等農(nóng)藥在食品中殘留量的生物傳感器檢測都有相應(yīng)的研究報道。都有相應(yīng)的研究報道。 19961996年余孝穎等采用離子敏場效應(yīng)管為基礎(chǔ)年余孝穎等采用離子敏場效應(yīng)管為基礎(chǔ)傳感器（換能器），將乙酰膽堿酯酶通過戊二醛傳感器（換能器），將乙酰膽堿酯酶通過戊二醛共價交聯(lián)固定于場效應(yīng)管上，制備得到了乙酰膽共價交聯(lián)固定于場效應(yīng)管上，制備得到了乙酰膽堿酯酶場效應(yīng)管傳感器，用于分析敵敵畏等有機堿酯酶場效應(yīng)管傳感器，用于分析敵敵畏等有機磷農(nóng)藥的殘留。磷農(nóng)藥的殘留。 原理：乙

21、酰膽堿酯酶能催化乙酰膽堿水解成原理：乙酰膽堿酯酶能催化乙酰膽堿水解成膽堿和乙酸，當存在有機磷農(nóng)藥殘留時，它們能膽堿和乙酸，當存在有機磷農(nóng)藥殘留時，它們能夠抑制夠抑制乙酰膽堿酯酶乙酰膽堿酯酶的活性，從而使底物的分解的活性，從而使底物的分解減少，膽堿和乙酸的產(chǎn)生減少，其中乙酸的減少減少，膽堿和乙酸的產(chǎn)生減少，其中乙酸的減少量可以通過離子場效應(yīng)管來測定，且在一定條件量可以通過離子場效應(yīng)管來測定，且在一定條件下，下，乙酸的減少量和有機磷農(nóng)藥的量之間存在一乙酸的減少量和有機磷農(nóng)藥的量之間存在一定的比例關(guān)系，定的比例關(guān)系，因此根據(jù)乙酸的減少量就可以計因此根據(jù)乙酸的減少量就可以計算出有機磷農(nóng)藥的殘留。算出有

22、機磷農(nóng)藥的殘留。 2. 2.抗生素殘留的分析抗生素殘留的分析 青霉素和磺胺是獸藥中常用的抗生素，其殘青霉素和磺胺是獸藥中常用的抗生素，其殘留會污染動物性食品，從而對人類的健康造成危留會污染動物性食品，從而對人類的健康造成危害。害。 SternesioesSternesioes等人采用免疫傳感器測定了牛等人采用免疫傳感器測定了牛奶中硫胺二甲嘧啶的含量，靈敏度達到奶中硫胺二甲嘧啶的含量，靈敏度達到1ng1ngg g，傳感器表面經(jīng)傳感器表面經(jīng)NaOHNaOH和和HClHCl處理后可以重復(fù)使用。處理后可以重復(fù)使用。 AvonAvon等用抗體酶共軛物為敏感材料結(jié)合光度等用抗體酶共軛物為敏感材料結(jié)合光度分

23、析法檢測了牛奶中青霉素的含量。分析法檢測了牛奶中青霉素的含量。 （二）食品添加劑的分析（二）食品添加劑的分析 亞硫酸鹽亞硫酸鹽是常用的食品防腐劑和漂白劑，但是亞硫酸是常用的食品防腐劑和漂白劑，但是亞硫酸鹽容易引起哮喘，美國鹽容易引起哮喘，美國FDAFDA規(guī)定了其在新鮮水果和蔬菜等規(guī)定了其在新鮮水果和蔬菜等食品中的含量不得超過食品中的含量不得超過1 11010-6-6molmolL L。 天冬酰苯丙氨酸甲酯天冬酰苯丙氨酸甲酯，又稱甜味素，是人工合成的低，又稱甜味素，是人工合成的低熱量甜味劑。熱量甜味劑。 煙堿酸煙堿酸屬于屬于B B族維生素，可以作為肉類食品的發(fā)色劑，族維生素，可以作為肉類食品的發(fā)

24、色劑，但是人體攝入過量的煙堿酸會引起瘙癢和頭痛等中毒癥狀，但是人體攝入過量的煙堿酸會引起瘙癢和頭痛等中毒癥狀，在日本已禁止使用。在日本已禁止使用。 其他食品添加劑，如防腐劑其他食品添加劑，如防腐劑苯甲酸鈉、羥基苯甲酸鈉、苯甲酸鈉、羥基苯甲酸鈉、過氧化氫，抗氧化劑抗壞血酸、脫氫抗壞血酸、兒茶酚、過氧化氫，抗氧化劑抗壞血酸、脫氫抗壞血酸、兒茶酚、兒茶酚胺，發(fā)色劑亞硝酸，酸味劑磷酸和乳酸兒茶酚胺，發(fā)色劑亞硝酸，酸味劑磷酸和乳酸等都可以用等都可以用相應(yīng)的生物傳感器來檢測它們在食品中的含量。相應(yīng)的生物傳感器來檢測它們在食品中的含量。 （三）污染微生物的檢測（三）污染微生物的檢測 污染食品的微生物可以分為

25、腐敗菌和病原菌。污染食品的微生物可以分為腐敗菌和病原菌。腐敗菌主要是通過對食品成分的分解和破壞，同腐敗菌主要是通過對食品成分的分解和破壞，同時產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)從而對人體造成危害。腐敗時產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)從而對人體造成危害。腐敗菌本身通常不是致病菌。病原菌除了能破壞食品菌本身通常不是致病菌。病原菌除了能破壞食品的組成成分外，其菌體本身也能使人致病。的組成成分外，其菌體本身也能使人致病。 食品中污染微生物的檢測方法通常是平板計食品中污染微生物的檢測方法通常是平板計數(shù)法，其操作繁瑣，檢測時間長，特別是對于病數(shù)法，其操作繁瑣，檢測時間長，特別是對于病原菌的檢測，有時長達原菌的檢測，有時長達l-2l-2周

26、才能出結(jié)果，因此各周才能出結(jié)果，因此各種快速檢測方法不斷涌現(xiàn)，生物傳感器檢測方法種快速檢測方法不斷涌現(xiàn)，生物傳感器檢測方法就是其中的一種。就是其中的一種。 1.1.腐敗菌的檢測腐敗菌的檢測 釀酒酵母、乳酸菌和枯草芽孢桿菌等是常見的食品腐釀酒酵母、乳酸菌和枯草芽孢桿菌等是常見的食品腐敗菌。敗菌。 2.2.病原菌的檢測病原菌的檢測 常見的污染食品的病原菌有沙門氏菌、大腸桿菌、金常見的污染食品的病原菌有沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和蠟樣芽孢桿黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和蠟樣芽孢桿菌等。這些病原菌按常規(guī)的檢測方法檢測時間很長，而采菌等。這些病原菌按常規(guī)的檢測

27、方法檢測時間很長，而采用生物傳感器則能迅速地測定它們的數(shù)量。用生物傳感器則能迅速地測定它們的數(shù)量。 用來測定病原菌的生物傳感器主要是光纖生物傳感器、用來測定病原菌的生物傳感器主要是光纖生物傳感器、免疫生物傳感器和免疫生物傳感器和DNADNA生物傳感器。生物傳感器。 目前，上述病原菌都可以用相應(yīng)的生物傳感器來測定目前，上述病原菌都可以用相應(yīng)的生物傳感器來測定。 （四）生物毒素的檢測（四）生物毒素的檢測 污染食品的生物毒素主要包括細菌毒素、真污染食品的生物毒素主要包括細菌毒素、真菌毒素、藻類毒素以及動植物毒素，其中以細菌菌毒素、藻類毒素以及動植物毒素，其中以細菌毒素和真菌毒素最為常見。毒素和真菌毒

28、素最為常見。 檢測毒素的方法包括色譜法（氣相色譜、液檢測毒素的方法包括色譜法（氣相色譜、液相色譜、薄層層析等）和生物學(xué)方法等，這些方相色譜、薄層層析等）和生物學(xué)方法等，這些方法檢測時間長，對樣品的前處理復(fù)雜繁瑣。以免法檢測時間長，對樣品的前處理復(fù)雜繁瑣。以免疫學(xué)方法和生物傳感器檢測方法為代表的各種快疫學(xué)方法和生物傳感器檢測方法為代表的各種快速方法備受歡迎。速方法備受歡迎。 1.1.細菌毒素的分析細菌毒素的分析 細菌毒素是由細菌分泌產(chǎn)生于細胞外或存在于細胞內(nèi)細菌毒素是由細菌分泌產(chǎn)生于細胞外或存在于細胞內(nèi)的致病性物質(zhì)，有內(nèi)毒素和外毒素之分。的致病性物質(zhì)，有內(nèi)毒素和外毒素之分。 內(nèi)毒素：革蘭氏陰性細

29、菌細胞壁的組成成分之一的脂內(nèi)毒素：革蘭氏陰性細菌細胞壁的組成成分之一的脂多糖，熱穩(wěn)定，抗原性差，不能轉(zhuǎn)化為類毒素，毒性比較多糖，熱穩(wěn)定，抗原性差，不能轉(zhuǎn)化為類毒素，毒性比較弱，毫克水平才能引起動物死亡。弱，毫克水平才能引起動物死亡。 外毒素：細菌（主要是革蘭氏陽性菌，也有少數(shù)革蘭外毒素：細菌（主要是革蘭氏陽性菌，也有少數(shù)革蘭氏陰性菌）分泌于胞外的一種蛋白質(zhì)，熱穩(wěn)定性差，抗原氏陰性菌）分泌于胞外的一種蛋白質(zhì)，熱穩(wěn)定性差，抗原性強，能轉(zhuǎn)化成類毒素，毒性很強，微克水平就能引起動性強，能轉(zhuǎn)化成類毒素，毒性很強，微克水平就能引起動物死亡。物死亡。 目前研究報道主要集中在運用免疫生物傳感器分析檢目前研究報

30、道主要集中在運用免疫生物傳感器分析檢測肉毒毒素和葡萄球菌腸毒素等細菌外毒素。運用生物傳測肉毒毒素和葡萄球菌腸毒素等細菌外毒素。運用生物傳感器能靈敏、準確、快速地檢測到它們在火腿和奶油等食感器能靈敏、準確、快速地檢測到它們在火腿和奶油等食品中的含量。品中的含量。 2. 2.真菌毒素的分析真菌毒素的分析 真菌毒素是真菌分泌產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物。常見真菌毒素是真菌分泌產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物。常見的污染食品的真菌毒素主要有黃曲霉毒素、赭霉素、雜色的污染食品的真菌毒素主要有黃曲霉毒素、赭霉素、雜色曲霉素、曲霉素、T-2T-2毒素、腐馬素、鐮刀菌烯醇類毒素、展青霉素毒素、腐馬素、鐮刀菌烯醇類毒素、展青霉

31、素和橘霉素等。和橘霉素等。 檢測食品中污染真菌毒素的方法主要有薄層層析法和檢測食品中污染真菌毒素的方法主要有薄層層析法和液相色譜法等。近二十多年來免疫學(xué)方法在真菌毒素的檢液相色譜法等。近二十多年來免疫學(xué)方法在真菌毒素的檢測中得到了較好的應(yīng)用，以此為基礎(chǔ)的免疫生物傳感器快測中得到了較好的應(yīng)用，以此為基礎(chǔ)的免疫生物傳感器快速檢測真菌毒素的方法也有研究報道和應(yīng)用，其中以免疫速檢測真菌毒素的方法也有研究報道和應(yīng)用，其中以免疫傳感器用于檢測黃曲霉毒素傳感器用于檢測黃曲霉毒素B B1 1和腐馬素和腐馬素B B1 1的研究報道最多。的研究報道最多。此外，也有運用微生物傳感器和以纖毛蟲為生物敏感材料此外，也有

32、運用微生物傳感器和以纖毛蟲為生物敏感材料的傳感器檢測展青霉素、黃曲霉毒素的傳感器檢測展青霉素、黃曲霉毒素B B1 1和和T-2T-2毒素的研究報毒素的研究報道。道。 3.3.其他生物毒素的檢測其他生物毒素的檢測 也有用于檢測食品中污染的動植物毒素。也有用于檢測食品中污染的動植物毒素。 （五）食品新鮮度的分析（五）食品新鮮度的分析 1.1.魚鮮度傳感器魚鮮度傳感器 魚死亡后，魚肉中魚死亡后，魚肉中ATPATP（三磷酸腺苷）在（三磷酸腺苷）在ATPATP酶的作酶的作用下分解成用下分解成ADPADP（二磷酸腺苷），（二磷酸腺苷），ADPADP在磷酸激酶的作用在磷酸激酶的作用下分解產(chǎn)生下分解產(chǎn)生AMP

33、AMP（一磷酸腺苷），（一磷酸腺苷），AMPAMP在在AMPAMP脫氨酶的作脫氨酶的作用下轉(zhuǎn)化為用下轉(zhuǎn)化為IMPIMP（肌苷酸），（肌苷酸），IMPIMP在在5 5- -核苷酸酶的作用下核苷酸酶的作用下分解成分解成HxRHxR（肌苷），（肌苷），HxRHxR在核苷磷酸化酶的作用下分解在核苷磷酸化酶的作用下分解成成HxHx（次黃嘌呤），（次黃嘌呤），HxHx在黃嘌呤氧化酶的作用下分解成在黃嘌呤氧化酶的作用下分解成尿酸。即：尿酸。即： ATPADPAMPIMPHxRHxATPADPAMPIMPHxRHx尿酸尿酸 根據(jù)魚死亡后，魚肉中根據(jù)魚死亡后，魚肉中ATPATP分解代謝后各種代謝產(chǎn)物之分解代謝后

34、各種代謝產(chǎn)物之間的比例關(guān)系，即間的比例關(guān)系，即K K值或值或K K1 1值也能很好地評判魚的新鮮度。值也能很好地評判魚的新鮮度。 K K值：指上述值：指上述ATPATP代謝產(chǎn)物中，肌苷和次黃嘌呤占代謝產(chǎn)物中，肌苷和次黃嘌呤占ATPATP代代謝產(chǎn)物總量的百分數(shù)。即：謝產(chǎn)物總量的百分數(shù)。即：K K（% %）=（HxR+HxHxR+Hx）（）（ATP+ADP+AMP+IMP+HxR+HxATP+ADP+AMP+IMP+HxR+Hx） 100100 魚死亡后魚死亡后ATPATP、ADPADP和和AMPAMP的代謝非常快，一般在很短的的代謝非常快，一般在很短的時間（時間（24h24h）內(nèi)，它們在魚肉中的

35、含量就幾乎為零，而一般）內(nèi)，它們在魚肉中的含量就幾乎為零，而一般在市場上出售的魚都是死亡在市場上出售的魚都是死亡24h24h以后的魚，以后的魚，K K值可簡化為值可簡化為K K1 1值。值。即：即： K K1 1（% %）=（HxR+HxHxR+Hx）（）（IMP+HxR+HxIMP+HxR+Hx） 100100 目前日本等國已制訂了根據(jù)目前日本等國已制訂了根據(jù)K K值或值或K Kl l值判斷魚新鮮度值判斷魚新鮮度的標準，也成功研制了測定的標準，也成功研制了測定K K值或值或K K1 1值的各種生物傳感器。值的各種生物傳感器。按照日本的標準，按照日本的標準，K K1 10.20.2時，魚的品質(zhì)

36、極好，時，魚的品質(zhì)極好，K Kl l=0.2-=0.2-0.40.4時，魚品質(zhì)較好。時，魚品質(zhì)較好。 （1 1）多電極傳感器系統(tǒng)。主要由四根氧電極組成，）多電極傳感器系統(tǒng)。主要由四根氧電極組成，其中一根作為參照，另外三根電極的表面分別固定有黃其中一根作為參照，另外三根電極的表面分別固定有黃嘌呤氧化酶膜，核苷磷酸化酶與黃嘌呤氧化酶膜，嘌呤氧化酶膜，核苷磷酸化酶與黃嘌呤氧化酶膜，5 5- -核核苷酸酶、核苷磷酸化酶與黃嘌呤氧化酶膜，測定時將四苷酸酶、核苷磷酸化酶與黃嘌呤氧化酶膜，測定時將四根電極同時放入樣品液中，上述三根酶電極產(chǎn)生的電信根電極同時放入樣品液中，上述三根酶電極產(chǎn)生的電信號分別反應(yīng)了樣

37、品液中號分別反應(yīng)了樣品液中HxHx的濃度，（的濃度，（HxR+HxHxR+Hx）的濃度和）的濃度和（IMP+HxR+HxIMP+HxR+Hx）的濃度，通過計算機處理很容易計算出）的濃度，通過計算機處理很容易計算出K K1 1的大小。的大小。 運用該傳感器，只需運用該傳感器，只需20-50L20-50L樣品液，樣品液，8min8min就可以就可以測定測定K K1 1值。值。 （2 2）多酶電極傳感器系統(tǒng)。首先將）多酶電極傳感器系統(tǒng)。首先將5 5- -核苷酸酶、核苷核苷酸酶、核苷磷酸化酶與黃嘌呤氧化酶固定在一氧電極上，形成多酶電磷酸化酶與黃嘌呤氧化酶固定在一氧電極上，形成多酶電極。測試時，樣品液先

38、經(jīng)過一離子交換柱，使極。測試時，樣品液先經(jīng)過一離子交換柱，使IMPIMP、HxRHxR和和HxHx分開，然后分別流經(jīng)有多酶電極的測試室，根據(jù)樣品中分開，然后分別流經(jīng)有多酶電極的測試室，根據(jù)樣品中不同組分流經(jīng)測試室時電信號的響應(yīng)情況，運用計算機分不同組分流經(jīng)測試室時電信號的響應(yīng)情況，運用計算機分析計算出析計算出K K1 1值。值。 除了測定除了測定K K1 1值，也有通過生物傳感器測定魚肉中胺類值，也有通過生物傳感器測定魚肉中胺類物質(zhì)的變化來反應(yīng)魚新鮮度的研究報道。另外，采用微生物質(zhì)的變化來反應(yīng)魚新鮮度的研究報道。另外，采用微生物傳感器測定魚鮮度的研究也有報道。物傳感器測定魚鮮度的研究也有報道。

39、 2.2.肉鮮度傳感器肉鮮度傳感器 和魚肉一樣，其他肉類也可以通過生物傳感器來測定和魚肉一樣，其他肉類也可以通過生物傳感器來測定其鮮度。其鮮度。KurubeKurube等人將單胺氧化酶固定于氧電極上組成了等人將單胺氧化酶固定于氧電極上組成了測定豬肉鮮度的酶傳感器，該傳感器的響應(yīng)時間為測定豬肉鮮度的酶傳感器，該傳感器的響應(yīng)時間為4min,4min,檢測的線性范圍為檢測的線性范圍為5 51010-6-6-10-101010-6-6mo1mo1L L。KressKress等人研等人研制開發(fā)出一種測定肉鮮度的匕首式生物傳感器，測定時將制開發(fā)出一種測定肉鮮度的匕首式生物傳感器，測定時將傳感器的探頭插入肉

40、表面?zhèn)鞲衅鞯奶筋^插入肉表面2-4cm2-4cm深度，通過測定葡萄糖的深度，通過測定葡萄糖的濃度來評價肉的鮮度。濃度來評價肉的鮮度。 3.3.牛乳鮮度傳感器牛乳鮮度傳感器 主要通過測定牛乳中的微生物數(shù)量，牛乳的乳酸增加主要通過測定牛乳中的微生物數(shù)量，牛乳的乳酸增加量，或牛乳中的脂肪分解成的短脂肪酸的量等來評價牛乳量，或牛乳中的脂肪分解成的短脂肪酸的量等來評價牛乳的鮮度。的鮮度。 第二節(jié)第二節(jié) 免疫學(xué)技術(shù)與食品安全檢測免疫學(xué)技術(shù)與食品安全檢測 （一）抗原（一）抗原（antigen） 指進入動物體內(nèi)能刺激動物的免疫系統(tǒng)發(fā)生免指進入動物體內(nèi)能刺激動物的免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，從而引起動物產(chǎn)生抗體或形成致

41、敏淋巴細疫應(yīng)答，從而引起動物產(chǎn)生抗體或形成致敏淋巴細胞，并能和抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性反應(yīng)的胞，并能和抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。物質(zhì)。 1.1.抗原的分類和基本屬性抗原的分類和基本屬性 半抗原半抗原（haptenhapten）: :不能刺激動物產(chǎn)生抗體，只不能刺激動物產(chǎn)生抗體，只能和對應(yīng)的抗體進行特異性結(jié)合，即只有免疫反應(yīng)能和對應(yīng)的抗體進行特異性結(jié)合，即只有免疫反應(yīng)性，無免疫原性的抗原。性，無免疫原性的抗原。 完全抗原完全抗原（complete antigencomplete antigen）：既具有免疫）：既具有免疫原性又具有免疫反應(yīng)性的抗原。原性又具有免疫反應(yīng)性的抗原。

42、超級抗原超級抗原（superantigensuperantigen）：有些物質(zhì)，例如）：有些物質(zhì)，例如某些細菌毒素，具有非常強的免疫刺激能力，通常某些細菌毒素，具有非常強的免疫刺激能力，通常可達到一般抗原刺激能力的可達到一般抗原刺激能力的20002000倍，只需極低的濃倍，只需極低的濃度就可以誘發(fā)極大的免疫反應(yīng)。度就可以誘發(fā)極大的免疫反應(yīng)。 免疫原性免疫原性（immunogenicityimmunogenicity）: :指抗原進入體指抗原進入體內(nèi)刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體或形成致敏淋巴細胞的特內(nèi)刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體或形成致敏淋巴細胞的特性。性。 免疫反應(yīng)性免疫反應(yīng)性（immunoreactivit

43、yimmunoreactivity）: :指抗原能指抗原能和對應(yīng)的抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性反應(yīng)的特和對應(yīng)的抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性反應(yīng)的特性。性。 2.2.抗原決定簇抗原決定簇（antigenic determinantantigenic determinant） 或稱為抗原表位，是位于抗原物質(zhì)分子表面或稱為抗原表位，是位于抗原物質(zhì)分子表面或者其他部位的具有一定組成和結(jié)構(gòu)的特殊化學(xué)或者其他部位的具有一定組成和結(jié)構(gòu)的特殊化學(xué)基團，能與免疫系統(tǒng)中淋巴細胞上的受體及相應(yīng)基團，能與免疫系統(tǒng)中淋巴細胞上的受體及相應(yīng)的抗體分子結(jié)合，是免疫原引起機體特異性免疫的抗體分子結(jié)合，是免疫原引起機體特異性免

44、疫應(yīng)答和免疫原與抗體特異性反應(yīng)的基本構(gòu)成單位。應(yīng)答和免疫原與抗體特異性反應(yīng)的基本構(gòu)成單位。 在蛋白質(zhì)抗原中，在蛋白質(zhì)抗原中，3-83-8個氨基酸殘基可以構(gòu)成個氨基酸殘基可以構(gòu)成一個抗原決定簇，在多糖抗原中一個抗原決定簇，在多糖抗原中3-63-6個呋喃環(huán)可以個呋喃環(huán)可以組成一個抗原決定簇。組成一個抗原決定簇。 從結(jié)構(gòu)上抗原決定簇可以分成順序決定簇和從結(jié)構(gòu)上抗原決定簇可以分成順序決定簇和構(gòu)象決定簇。構(gòu)象決定簇。 順序決定簇順序決定簇（sequential determinantsequential determinant）：）：又稱為連續(xù)決定簇，氨基酸的排列順序決定著這又稱為連續(xù)決定簇，氨基酸的排

45、列順序決定著這類決定簇的功能基團。類決定簇的功能基團。 構(gòu)象決定簇（構(gòu)象決定簇（conformational conformational determinantdeterminant）：又稱為不連續(xù)決定簇，是依賴于）：又稱為不連續(xù)決定簇，是依賴于蛋白質(zhì)天然空間構(gòu)象的決定簇，這類決定簇通常蛋白質(zhì)天然空間構(gòu)象的決定簇，這類決定簇通常由不連續(xù)的氨基酸順序片段經(jīng)肽鏈的折疊卷曲而由不連續(xù)的氨基酸順序片段經(jīng)肽鏈的折疊卷曲而成，一般位于蛋白質(zhì)的表面。成，一般位于蛋白質(zhì)的表面。 研究抗原的決定簇不僅可以揭示抗原與抗體研究抗原的決定簇不僅可以揭示抗原與抗體結(jié)合的本質(zhì)，有助于更好地了解免疫學(xué)中的核心結(jié)合的本質(zhì)，

46、有助于更好地了解免疫學(xué)中的核心問題免疫識別和應(yīng)答的機制，而且可以人工合問題免疫識別和應(yīng)答的機制，而且可以人工合成某些抗原決定簇，這對于研制疫苗和特異性診成某些抗原決定簇，這對于研制疫苗和特異性診斷試劑，以及藥物合成和抗病毒感染等方面都有斷試劑，以及藥物合成和抗病毒感染等方面都有很大的益處。很大的益處。 3.3.抗原的分類抗原的分類 根據(jù)來源抗原可分為天然抗原、人工抗原和根據(jù)來源抗原可分為天然抗原、人工抗原和合成抗原等三類。合成抗原等三類。 天然抗原：天然抗原：是天然的生物、細胞及天然產(chǎn)物，是天然的生物、細胞及天然產(chǎn)物，主要來自動物、植物和微生物，例如血細胞、細主要來自動物、植物和微生物，例如血

47、細胞、細菌和病毒、蛋白質(zhì)、多糖、脂類和核酸等都可以菌和病毒、蛋白質(zhì)、多糖、脂類和核酸等都可以是天然抗原。是天然抗原。 人工抗原：人工抗原：指人工化學(xué)改造后的抗原，例如指人工化學(xué)改造后的抗原，例如半抗原經(jīng)化學(xué)改造后就是人工抗原。半抗原經(jīng)化學(xué)改造后就是人工抗原。 合成抗原：合成抗原：指化學(xué)合成的具有抗原性質(zhì)的分指化學(xué)合成的具有抗原性質(zhì)的分子，主要是氨基酸的聚合物。子，主要是氨基酸的聚合物。 4.4.抗原的制備抗原的制備 （1 1）抗原的準備。）抗原的準備。對微生物細胞等顆粒狀抗對微生物細胞等顆粒狀抗原，只需對微生物進行擴大培養(yǎng)，然后收集菌體原，只需對微生物進行擴大培養(yǎng)，然后收集菌體即可。對蛋白質(zhì)、

48、多糖、即可。對蛋白質(zhì)、多糖、DNADNA和脂類等可溶性膠體和脂類等可溶性膠體抗原，應(yīng)根據(jù)其在生物細胞中的部位進行處理。抗原，應(yīng)根據(jù)其在生物細胞中的部位進行處理。存在于細胞內(nèi)的物質(zhì)首先應(yīng)破細胞壁，使它們釋存在于細胞內(nèi)的物質(zhì)首先應(yīng)破細胞壁，使它們釋放出來，然后收集含有這些物質(zhì)的溶液，再采用放出來，然后收集含有這些物質(zhì)的溶液，再采用各種分離、提取和純化方法進行分離和提取。對各種分離、提取和純化方法進行分離和提取。對于分泌于細胞外的這些高分子物質(zhì)則只需收集胞于分泌于細胞外的這些高分子物質(zhì)則只需收集胞外液，然后再進行分離純化即可。外液，然后再進行分離純化即可。 （2 2）半抗原的改造。）半抗原的改造。通

49、常是將牛血清白蛋白通常是將牛血清白蛋白（BSABSA）、卵清白蛋白（）、卵清白蛋白（OVOV）或人工合成的多聚氨）或人工合成的多聚氨基酸等連接在半抗原分子上，增加其相對分子質(zhì)基酸等連接在半抗原分子上，增加其相對分子質(zhì)量，從而使其轉(zhuǎn)化成完全抗原（例子見書）。量，從而使其轉(zhuǎn)化成完全抗原（例子見書）。 將各種半抗原轉(zhuǎn)化成完全抗原的具體操作方將各種半抗原轉(zhuǎn)化成完全抗原的具體操作方式和注意事項各不相同，但是有一點必須注意，式和注意事項各不相同，但是有一點必須注意，即在操作過程中應(yīng)盡可能保持半抗原結(jié)構(gòu)的即在操作過程中應(yīng)盡可能保持半抗原結(jié)構(gòu)的“完完整性整性”，不能過度破壞其結(jié)構(gòu)，以保持半抗原的，不能過度破壞

50、其結(jié)構(gòu)，以保持半抗原的“原始性原始性”。 （二）抗體（二）抗體（amtibody, Ab） 1.1.抗體的定義、分布和分類抗體的定義、分布和分類 由抗原刺激動物的免疫系統(tǒng)后，由免疫系統(tǒng)分由抗原刺激動物的免疫系統(tǒng)后，由免疫系統(tǒng)分泌的能和相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白泌的能和相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白（immunoglobinimmunoglobin，IgIg）。）。 抗體主要存在于動物血清中，也存在于動物的抗體主要存在于動物血清中，也存在于動物的其他體液和體外分泌液，例如乳汁和細胞分泌液中。其他體液和體外分泌液，例如乳汁和細胞分泌液中。另外，抗體還存在于某些細胞中。另外，抗體還存在于

51、某些細胞中。 根據(jù)根據(jù)IgIg的理化特性和與抗原結(jié)合方式的不同，的理化特性和與抗原結(jié)合方式的不同，IgIg可以分為類和亞類。可以分為類和亞類。 2.2.抗體的結(jié)構(gòu)抗體的結(jié)構(gòu) 一個抗體分子通常包括兩個完全相同的輕鏈一個抗體分子通常包括兩個完全相同的輕鏈分子（分子（1ight chain1ight chain）和兩個完全相同的重鏈）和兩個完全相同的重鏈（heavy chainheavy chain）分子，輕鏈分子大約由）分子，輕鏈分子大約由210210個氨個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量約為基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量約為2.32.310104 4；重；重鏈分子大約由鏈分子大約由450450個氨基酸殘

52、基組成，相對分子個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量約為質(zhì)量約為5.05.010104 4。這。這4 4條鏈在氫鍵和二硫鍵條鏈在氫鍵和二硫鍵（S-SS-S）作用下連在一起，形成）作用下連在一起，形成“Y Y”字形結(jié)構(gòu)。字形結(jié)構(gòu)。 在在“Y Y”字形的兩個支角上，重鏈和輕鏈的字形的兩個支角上，重鏈和輕鏈的N N端區(qū)域在一起形成抗原的識別位點。有一段大約端區(qū)域在一起形成抗原的識別位點。有一段大約110110個氨基酸殘基的區(qū)域隨抗體結(jié)合特異性的不個氨基酸殘基的區(qū)域隨抗體結(jié)合特異性的不同而變化，這端區(qū)域叫可變區(qū)。除可變區(qū)外，抗同而變化，這端區(qū)域叫可變區(qū)。除可變區(qū)外，抗體分子上還有恒定區(qū)。體分子上還有恒定區(qū)。

53、 3.3.抗體的制備抗體的制備 （1 1）多克隆抗體的制備多克隆抗體的制備 以抗原免疫實驗動物可以獲得含有特異性抗體的血清，以抗原免疫實驗動物可以獲得含有特異性抗體的血清，即抗血清。抗血清中的抗體是由不同的抗原決定簇刺激不即抗血清。抗血清中的抗體是由不同的抗原決定簇刺激不同的同的B B細胞克隆產(chǎn)生，這種抗體又稱為多克隆抗體。制備細胞克隆產(chǎn)生，這種抗體又稱為多克隆抗體。制備多克隆抗體包括：多克隆抗體包括： 實驗動物的選擇。用于制備多克隆抗體的實驗動物包實驗動物的選擇。用于制備多克隆抗體的實驗動物包括哺乳類的鼠、兔、羊、馬、驢、豚、鼠、豬、猴、狗和括哺乳類的鼠、兔、羊、馬、驢、豚、鼠、豬、猴、狗和

54、禽類的雞、鴨、鴿子，以及兩棲類的蛙等，其中最為常用禽類的雞、鴨、鴿子，以及兩棲類的蛙等，其中最為常用的是鼠、兔和羊等。的是鼠、兔和羊等。 在選擇實驗動物時首先應(yīng)考慮抗原的來源和免疫動物在選擇實驗動物時首先應(yīng)考慮抗原的來源和免疫動物的親緣關(guān)系。一般來說，兩者的親緣關(guān)系越遠則產(chǎn)生的抗的親緣關(guān)系。一般來說，兩者的親緣關(guān)系越遠則產(chǎn)生的抗體效價越高，相反則抗體的效價越差。體效價越高，相反則抗體的效價越差。 實驗動物的年齡和營養(yǎng)狀況與抗體的產(chǎn)生也有密切的實驗動物的年齡和營養(yǎng)狀況與抗體的產(chǎn)生也有密切的關(guān)系，年齡太小易產(chǎn)生免疫耐受；而年齡過大或營養(yǎng)不良關(guān)系，年齡太小易產(chǎn)生免疫耐受；而年齡過大或營養(yǎng)不良則動物的

55、免疫能力低下，也不易產(chǎn)生高效價的抗體。則動物的免疫能力低下，也不易產(chǎn)生高效價的抗體。 選擇好實驗動物后，在注射抗原前應(yīng)采集少量的動物選擇好實驗動物后，在注射抗原前應(yīng)采集少量的動物血清（陰性血清）和抗原進行血清學(xué)反應(yīng)，選擇不和抗原血清（陰性血清）和抗原進行血清學(xué)反應(yīng)，選擇不和抗原反應(yīng)的動物進行免疫實驗。反應(yīng)的動物進行免疫實驗。 抗原的處理抗原的處理。除了前面敘述的抗原的分離提純和半抗原的改造外，對于可溶性抗原，在注射免疫動物之前通常還需和免疫佐劑進行混合（顆粒抗原一般無需和佐劑混合，可以直接注射），以提高抗原的免疫原性等。 佐劑佐劑（adjuvant）：是具有增強機體的免疫應(yīng)答能力，延長抗原在機

56、體內(nèi)的半衰期，降低抗原毒副作用，以使機體產(chǎn)生高效價抗血清的物質(zhì)。最常用的佐劑是福氏佐劑福氏佐劑，它分為完全福氏佐劑完全福氏佐劑和不完全福氏佐劑不完全福氏佐劑。 不完全福氏佐劑不完全福氏佐劑：由1-6份的液體石蠟和1份羊毛脂充分混合而成。 完全福氏佐劑完全福氏佐劑：在不完全福氏佐劑的基礎(chǔ)上，于使用前添加滅活的（2-20mgmL）卡介苗混合而成。 動物的免疫動物的免疫。動物的免疫是一個非常復(fù)雜的過程，在免疫過程中，對抗原的免疫劑量、注射途徑、加強免疫的時間間隔和加強免疫的次數(shù)等都需要認真綜合考慮。 抗原的劑量抗原的劑量應(yīng)根據(jù)抗原的免疫原性強弱、動物的種類和大小以及抗原的注射途徑等來決定。對于同一種

57、抗原，在一定的劑量范圍內(nèi)，抗原的注射量與免疫反應(yīng)的強度成正相關(guān)，抗原量過大或過小都易產(chǎn)生免疫耐受。免疫動物越大一次注射抗原的量也越多，小鼠一次注射的免疫乳液量為1-2mL，家兔的為2-4mL。 常用的抗原注射途徑包括靜脈、脾臟、淋巴結(jié)、腹腔、常用的抗原注射途徑包括靜脈、脾臟、淋巴結(jié)、腹腔、肌肉、皮下和皮內(nèi)等，它們對抗原的收速度為靜脈脾臟肌肉、皮下和皮內(nèi)等，它們對抗原的收速度為靜脈脾臟淋巴結(jié)腹腔肌肉皮下皮內(nèi)。淋巴結(jié)腹腔肌肉皮下皮內(nèi)。 腹腔注射、肌肉注射、皮內(nèi)注射、皮下注射和淋巴結(jié)腹腔注射、肌肉注射、皮內(nèi)注射、皮下注射和淋巴結(jié)注射適合于任何抗原，這些途徑主要是通過刺激局部淋巴注射適合于任何抗原，這

58、些途徑主要是通過刺激局部淋巴結(jié)發(fā)生免疫應(yīng)答，初次免疫和加強免疫都可以使用。靜脈結(jié)發(fā)生免疫應(yīng)答，初次免疫和加強免疫都可以使用。靜脈注射只適合于可溶性抗原和分散的單細胞懸液，且不能使注射只適合于可溶性抗原和分散的單細胞懸液，且不能使用佐劑，其誘發(fā)的免疫應(yīng)答主要發(fā)生在脾臟。脾臟注射比用佐劑，其誘發(fā)的免疫應(yīng)答主要發(fā)生在脾臟。脾臟注射比較適合于微量抗原。較適合于微量抗原。 抗血清的采集、純化和特性鑒定抗血清的采集、純化和特性鑒定。抗體的分離純化方法很多，包括中性鹽沉淀法、凝膠柱層析、離子交換柱層析和親和層析等。 對收獲后的抗血清或純化后抗體的一些參數(shù)，例如效價、親和力和交叉反應(yīng)等進行分析非常必要。 效價

59、又稱為滴度效價又稱為滴度（titer）：在一定條件下，抗血清經(jīng)系列稀釋后與定量的抗原反應(yīng)，以能檢測出抗血清存在的抗血清的最大稀釋倍數(shù)，是表達抗血清中特異性抗體相對含量的一個指標。 親和力親和力（affinity）：表示抗原抗體結(jié)合程度的指標，親和力的大小可以用抗原抗體反應(yīng)的平衡常數(shù)K來表示。 抗血清的交叉反應(yīng)抗血清的交叉反應(yīng)：衡量抗體特性的另一個重要的指標。理論上講，抗體只能與產(chǎn)生該抗體的抗原發(fā)生反應(yīng)，這是抗體特異性的表現(xiàn)，但實際上抗體還可以和其他抗原發(fā)生反應(yīng)，即所謂的交叉反應(yīng)。一方面是由于抗原的不純造成，另一方面不同抗原間相同或類似的抗原決定簇也是產(chǎn)生交叉反應(yīng)的原因。 完全沒有交叉反應(yīng)的抗體

60、是不存在的，但是交叉反應(yīng)太強的抗體沒有應(yīng)用價值。 （2 2）單克隆抗體（）單克隆抗體（monoclonal antibodymonoclonal antibody）的制備）的制備 制備原理：免疫致敏后的制備原理：免疫致敏后的B B淋巴細胞具有分泌特異性淋巴細胞具有分泌特異性抗體的能力，但是在體外不能長期存活；而骨髓瘤細胞可抗體的能力，但是在體外不能長期存活；而骨髓瘤細胞可以在體外長期存活但不能產(chǎn)生抗體；如將兩種細胞雜交融以在體外長期存活但不能產(chǎn)生抗體；如將兩種細胞雜交融合后，經(jīng)分離篩選獲得既能在體外長期存活又能針對單一合后，經(jīng)分離篩選獲得既能在體外長期存活又能針對單一抗原決定簇產(chǎn)生特異性抗體的