1、第五章第五章 蛋白質提取純化、理化性質蛋白質提取純化、理化性質分析與結構測定分析與結構測定本章主要內容：本章主要內容：1.1.蛋白質理化性質與分析方法；蛋白質理化性質與分析方法；2.2.蛋白質提取、純化與鑒定的一般步驟；蛋白質提取、純化與鑒定的一般步驟；3.3.重組蛋白提取、純化與鑒定的注意事項；重組蛋白提取、純化與鑒定的注意事項；4.4.蛋白質技術；蛋白質技術；5.5.蛋白質結構測定。蛋白質結構測定。第一節第一節 蛋白質理化性質與分析方法蛋白質理化性質與分析方法一、蛋白質的兩性解離和等電點一、蛋白質的兩性解離和等電點二、蛋白質的呈色反應二、蛋白質的呈色反應三、蛋白質的紫外吸收三、蛋白質的紫外

2、吸收四、蛋白質的分子量四、蛋白質的分子量五、蛋白質的膠體性質五、蛋白質的膠體性質六、蛋白質的沉淀六、蛋白質的沉淀七、蛋白質的變性與復性七、蛋白質的變性與復性 當蛋白質溶液處于某一當蛋白質溶液處于某一ph值時，蛋白質解離成正、值時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，凈電荷為負離子的趨勢相等，凈電荷為“o”，此時溶液的，此時溶液的ph值稱為該蛋白質的值稱為該蛋白質的等電點等電點(isoelectric point, pi)。由于。由于各種蛋白質所含的堿性氨基酸和酸性氨基酸的數目不各種蛋白質所含的堿性氨基酸和酸性氨基酸的數目不同，因而有各自的等電點。同，因而有各自的等電點。 蛋白質溶液的蛋白質溶液的

3、ph大于等電點，該蛋白質顆粒帶負大于等電點，該蛋白質顆粒帶負電荷，反之則帶正電荷。電荷，反之則帶正電荷。 蛋白質分子所帶電荷的性質決定了它在電場中移蛋白質分子所帶電荷的性質決定了它在電場中移動的方向。處于等電點的蛋白質顆粒，在電場中并不動的方向。處于等電點的蛋白質顆粒，在電場中并不移動。移動。 人體體液中許多蛋白質的等電點在人體體液中許多蛋白質的等電點在ph5.0左右，左右，所以在體液中以負離子形式存在。所以在體液中以負離子形式存在。一、蛋白質的兩性解離和等電點一、蛋白質的兩性解離和等電點二、蛋白質的呈色反應二、蛋白質的呈色反應 (一一)茚三酮反應茚三酮反應(ninhydrin reactio

4、n) -氨基酸與水化茚三酮氨基酸與水化茚三酮(苯丙環三酮戊烴苯丙環三酮戊烴)作用時，產生作用時，產生藍色藍色反應。蛋白質是由許多反應。蛋白質是由許多-氨基酸組成的，故也呈此顏色反應。氨基酸組成的，故也呈此顏色反應。 (二二)雙縮脲反應雙縮脲反應(biuret reaction) 蛋白質在堿性溶液中與硫酸銅作用呈現蛋白質在堿性溶液中與硫酸銅作用呈現紫紅色紫紅色，稱為雙縮脲，稱為雙縮脲反應。凡分子中含有兩個以上反應。凡分子中含有兩個以上conh鍵的化合物，都呈此鍵的化合物，都呈此反應。反應。 (三三)米倫反應米倫反應(millon reaction) 蛋白質溶液中加入米倫試劑蛋白質溶液中加入米倫試

5、劑(亞硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混亞硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混合液合液)，蛋白質首先沉淀，加熱則變為，蛋白質首先沉淀，加熱則變為紅色紅色沉淀。沉淀。 此外，蛋白質溶液還可與酚試劑、乙醛酸試劑、濃硝酸等發此外，蛋白質溶液還可與酚試劑、乙醛酸試劑、濃硝酸等發生顏色反應。生顏色反應。 三、蛋白質的紫外吸收三、蛋白質的紫外吸收 因為蛋白質中含有因為蛋白質中含有tyr、phe、trp等芳香氨基酸，其紫等芳香氨基酸，其紫外吸收最大峰的波長為外吸收最大峰的波長為280nm。而且光吸收值（。而且光吸收值（od值）與蛋值）與蛋白質的濃度程正相關。白質的濃度程正相關。 測定蛋白質濃度的方法：標準曲線法和經驗公式法。測定

6、蛋白質濃度的方法：標準曲線法和經驗公式法。標準曲線法標準曲線法:經驗公式法：經驗公式法： 蛋白質濃度（蛋白質濃度（mg/ml）= 1.45od280-0.74od260注意：注意：在使用該公式時，在使用該公式時，od280 應在應在0.10.7之間，所測值才之間，所測值才 比較準確。比較準確。四、蛋白質的分子量四、蛋白質的分子量 蛋白質分子大小通常用道爾頓（蛋白質分子大小通常用道爾頓（dalton，da）或千道爾頓）或千道爾頓（kda）表示，一般在）表示，一般在6103106之間。之間。 測定蛋白質的分子量有許多方法，常用的有測定蛋白質的分子量有許多方法，常用的有sds-聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝膠

7、電泳（胺凝膠電泳（sds-page）、凝膠過濾法等。這些方法的誤差）、凝膠過濾法等。這些方法的誤差為為5%10%。dalton: a unit of mass very nearly equal to that of a hydrogen atom. named after john dalton (17661844), who developed the atomic theory of matter.sds-page測定蛋白質分子量測定蛋白質分子量蛋白質洗脫體積與分子量的關系蛋白質洗脫體積與分子量的關系分子篩層析示意圖分子篩層析示意圖 凝膠過濾法：凝膠過濾法： 又稱分子篩層析法又稱分子篩層

8、析法 將幾種已知分子量的蛋白質混合溶液上柱洗脫，記錄各種蛋白質的洗脫將幾種已知分子量的蛋白質混合溶液上柱洗脫，記錄各種蛋白質的洗脫體積。以分子量的對數為縱坐標，以洗脫體積為橫坐標，作標準曲線。體積。以分子量的對數為縱坐標，以洗脫體積為橫坐標，作標準曲線。待測蛋白質溶液在上述相同的層析條件下分離，記錄其洗脫體積，然后待測蛋白質溶液在上述相同的層析條件下分離，記錄其洗脫體積，然后根據標準曲線計算其分子量。根據標準曲線計算其分子量。 五、蛋白質的膠體性質五、蛋白質的膠體性質 根據溶質在溶劑中的顆粒大小（分散程度），可以把分散根據溶質在溶劑中的顆粒大小（分散程度），可以把分散系統分為系統分為3類：類：

9、 分散相質點小于分散相質點小于1nm的為真溶液，大于的為真溶液，大于100nm的為懸濁液，的為懸濁液，介于介于l100nm的為膠體溶液。的為膠體溶液。 分散相質點在膠體系統中保持穩定，需具備分散相質點在膠體系統中保持穩定，需具備3個條件：個條件： 1）分散相質點大小在）分散相質點大小在l100nm范圍內，這樣大小的質點在范圍內，這樣大小的質點在動力學上是穩定的，介質分子對這種質點碰撞的合力不等于零，動力學上是穩定的，介質分子對這種質點碰撞的合力不等于零，使它能在介質中不斷作使它能在介質中不斷作布朗運動布朗運動（brown movement）；）； 2）分散相的質點帶有）分散相的質點帶有同種電荷

10、，互相排斥同種電荷，互相排斥，不易聚集成，不易聚集成大顆粒而沉淀；大顆粒而沉淀； 3）分散相的質點能與溶劑形成溶劑化層，例如與水形成）分散相的質點能與溶劑形成溶劑化層，例如與水形成水化層水化層（hydration mantle），質點有了水化層，相互間不易靠），質點有了水化層，相互間不易靠攏而聚集。攏而聚集。 六、蛋白質的沉淀六、蛋白質的沉淀 蛋白質分子凝聚并從溶液中析出的現象，稱為蛋白質沉蛋白質分子凝聚并從溶液中析出的現象，稱為蛋白質沉淀淀(precipitation)。 變性蛋白質一般易于沉淀，但也可不變性而使蛋白質沉變性蛋白質一般易于沉淀，但也可不變性而使蛋白質沉淀，在一定條件下，變性的

11、蛋白質也可不發生沉淀。淀，在一定條件下，變性的蛋白質也可不發生沉淀。 蛋白質所形成的親水膠體顆粒具有三種穩定因素：顆粒蛋白質所形成的親水膠體顆粒具有三種穩定因素：顆粒表面的水化層；電荷；布朗運動。表面的水化層；電荷；布朗運動。 除去前兩個穩定因素除去前兩個穩定因素(如調節溶液如調節溶液ph至等電點和加入脫水至等電點和加入脫水劑劑)，蛋白質便容易凝集析出。，蛋白質便容易凝集析出。 (一一)鹽析鹽析(salting out) 在蛋白質溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質的膠體在蛋白質溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質的膠體穩定性而使其析出，這種方法稱為鹽析。常用的中性鹽有硫穩定性而使其析出，這種方法

12、稱為鹽析。常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。 (二二)重金屬鹽沉淀蛋白質重金屬鹽沉淀蛋白質 蛋白質可以與重金屬離子如汞、鉛、銅、銀等結合成鹽蛋白質可以與重金屬離子如汞、鉛、銅、銀等結合成鹽沉淀，沉淀的條件以沉淀，沉淀的條件以ph稍大于等電點為宜。因為此時蛋白質稍大于等電點為宜。因為此時蛋白質分子有較多的負離子，易與重金屬離子結合成鹽。分子有較多的負離子，易與重金屬離子結合成鹽。 (三三)生物堿試劑以及某些酸類沉淀蛋白質生物堿試劑以及某些酸類沉淀蛋白質 蛋白質又可與生物堿試劑蛋白質又可與生物堿試劑(如苦味酸、鎢酸、鞣酸如苦味酸、鎢酸、鞣酸)以及某以及某些酸些酸(如三

13、氯醋酸、過氯酸、硝酸如三氯醋酸、過氯酸、硝酸)結合成不溶性的鹽沉淀，沉結合成不溶性的鹽沉淀，沉淀的條件應當是淀的條件應當是ph小于等電點，這樣蛋白質帶正電荷，易于小于等電點，這樣蛋白質帶正電荷，易于與酸根負離子結合成鹽。與酸根負離子結合成鹽。常用的沉淀方法：常用的沉淀方法：(四四)有機溶劑沉淀蛋白質有機溶劑沉淀蛋白質 可與水混合的有機溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等，對水可與水混合的有機溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等，對水的親和力很大，能破壞蛋白質顆粒的水化膜，在等電點時使的親和力很大，能破壞蛋白質顆粒的水化膜，在等電點時使蛋白質沉淀。在常溫下，有機溶劑沉淀蛋白質往往引起變性。蛋白質沉淀。在常溫下，有機

14、溶劑沉淀蛋白質往往引起變性。例如酒精消毒滅菌就是如此，但若在低溫條件下，則變性進例如酒精消毒滅菌就是如此，但若在低溫條件下，則變性進行較緩慢，可用于分離制備各種血漿蛋白質。行較緩慢，可用于分離制備各種血漿蛋白質。(五五)加熱凝固加熱凝固 加熱蛋白質溶液，可使蛋白質發生凝固加熱蛋白質溶液，可使蛋白質發生凝固(coagulation)而而沉淀。沉淀。 加熱首先是使蛋白質變性，有規則的空間結構被打開，加熱首先是使蛋白質變性，有規則的空間結構被打開，呈松散狀不規則的結構，分子的不對稱性增加，疏水基團暴呈松散狀不規則的結構，分子的不對稱性增加，疏水基團暴露，進而凝聚成凝膠狀的蛋白塊。如煮熟的雞蛋，蛋黃和

15、蛋露，進而凝聚成凝膠狀的蛋白塊。如煮熟的雞蛋，蛋黃和蛋清都凝固。清都凝固。 七、蛋白質的變性與復性七、蛋白質的變性與復性變性（變性（denaturation）：）： 在變性因素的作用下，蛋白質一級結構不發生變化，空在變性因素的作用下，蛋白質一級結構不發生變化，空間構象被破壞，生物學功能喪失，理化性質也發生改變的現間構象被破壞，生物學功能喪失，理化性質也發生改變的現象象。 變性蛋白質溶解度降低，粘度增加，結晶性被破壞，易變性蛋白質溶解度降低，粘度增加，結晶性被破壞，易發生沉淀。發生沉淀。復性（復性（renaturation）: 在一定條件下，變性的蛋白質從伸展態恢復到折迭態，在一定條件下，變性的

16、蛋白質從伸展態恢復到折迭態，并恢復其原來的理化性質和生物活性。并恢復其原來的理化性質和生物活性。 抗菌肽的提純；抗菌肽的提純；rnase a的配制的配制第二節第二節 蛋白質蛋白質提取、純化與鑒定提取、純化與鑒定 一般步驟一般步驟一、一、蛋白質提取、純化的特點蛋白質提取、純化的特點二、二、蛋白質提取、純化前的準備蛋白質提取、純化前的準備三、三、蛋白質提取、純化的一般步驟蛋白質提取、純化的一般步驟 與化學產品的分離制備相比較，生物大分子的制備有以下與化學產品的分離制備相比較，生物大分子的制備有以下主要特點：主要特點： 生物材料的組成極其復雜。所以生物大分子的分離純化生物材料的組成極其復雜。所以生物

17、大分子的分離純化方法差別極大，想找到一種適合各種生物大分子分離制備的標方法差別極大，想找到一種適合各種生物大分子分離制備的標準方法是不可能的。準方法是不可能的。 許多生物大分子在生物材料中的含量極微。許多生物大分子在生物材料中的含量極微。 許多生物大分子一旦離開了生物體內的環境極易失活。許多生物大分子一旦離開了生物體內的環境極易失活。 生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進行的，溫度、生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進行的，溫度、ph值、離子強度等各種參數對溶液中各種組成的綜合影響，很值、離子強度等各種參數對溶液中各種組成的綜合影響，很難準確估計和判斷，因而實驗結果常有很大的經驗成份，實驗難準確估

18、計和判斷，因而實驗結果常有很大的經驗成份，實驗的重復性較差，個人的實驗技術水平和經驗對實驗結果會有較的重復性較差，個人的實驗技術水平和經驗對實驗結果會有較大的影響。大的影響。一、蛋白質提取、純化的特點一、蛋白質提取、純化的特點二、蛋白質提取、純化前的準備蛋白質提取、純化前的準備 在進行生物大分子的制備前，通常需要對以下幾方面的在進行生物大分子的制備前，通常需要對以下幾方面的內容加以確定或預先了解。內容加以確定或預先了解。 明確實驗目的和要求。科研、開發，還是要發現新的明確實驗目的和要求。科研、開發，還是要發現新的物質。物質。 通過文獻調研和預備性實驗，掌握目的生物大分子的通過文獻調研和預備性實

19、驗，掌握目的生物大分子的理化性質。如理化性質。如分子大小；溶解度；電荷；吸附性質；熱穩定分子大小；溶解度；電荷；吸附性質；熱穩定性；對配體分子的生物學親和力等。性；對配體分子的生物學親和力等。 建立相應的可靠的分析測定方法，這是制備生物大分建立相應的可靠的分析測定方法，這是制備生物大分子的關鍵。子的關鍵。 確定可能的技術路線和實驗方案，這是最困難的過程。確定可能的技術路線和實驗方案，這是最困難的過程。三、蛋白質提取、純化的一般步驟三、蛋白質提取、純化的一般步驟 1）選材：）選材： 制備生物大分子，首先要選擇適當的制備生物大分子，首先要選擇適當的生物材料。生物材料。 原則：原則：原材料來源充足；

20、目標蛋白含量豐富；易原材料來源充足；目標蛋白含量豐富；易于處理和提取。于處理和提取。 2）生物材料的破碎和預處理：）生物材料的破碎和預處理：常用的方法有組織常用的方法有組織勻漿法、研磨、反復凍融、溶菌酶、高壓破碎。勻漿法、研磨、反復凍融、溶菌酶、高壓破碎。 目的：目的：將目標蛋白以可溶態充分暴露出來，并與將目標蛋白以可溶態充分暴露出來，并與其他成分分離。其他成分分離。 3）粗分離：）粗分離：將絕大多數雜質去掉的過程。方法多將絕大多數雜質去掉的過程。方法多為離心、鹽析、有機溶劑沉淀、吸附、等電點、超濾為離心、鹽析、有機溶劑沉淀、吸附、等電點、超濾等。等。 4）純化：）純化：將粗提物中的雜質進一步

21、去除的過程，將粗提物中的雜質進一步去除的過程，又稱為又稱為精制精制。方法為各種層析技術，特別是親和層析。方法為各種層析技術，特別是親和層析技術。技術。 5）鑒定：）鑒定：包括包括3方面的內容：含量；純度；活性。方面的內容：含量；純度；活性。貫穿于提取、純化的每一步。貫穿于提取、純化的每一步。 含量：含量：凱氏定氮法、凱氏定氮法、folin-酚試劑法（酚試劑法（lowry法）法）和紫外吸收法等。和紫外吸收法等。 純度：純度：生物大分子制備物的均一性（即純度）的生物大分子制備物的均一性（即純度）的鑒定，要求達到一維電泳一條帶，二維電泳一個點，鑒定，要求達到一維電泳一條帶，二維電泳一個點，或或hpl

22、c和毛細管電泳都是一個峰。末端和毛細管電泳都是一個峰。末端aa測定。測定。 活性：活性：比活或生物活性鑒定。比活或生物活性鑒定。 6）產物的濃縮、干燥和保存）產物的濃縮、干燥和保存。 第三節第三節 重組蛋白質重組蛋白質提取、純化與鑒定的提取、純化與鑒定的一般步驟及注意事項一般步驟及注意事項主要內容：主要內容：一、一、重組蛋白質提取、純化與鑒定的特點；重組蛋白質提取、純化與鑒定的特點；二、二、重組蛋白質提取、純化與鑒定的一般步驟；重組蛋白質提取、純化與鑒定的一般步驟；三、三、重組蛋白質提取、純化與鑒定的注意事項。重組蛋白質提取、純化與鑒定的注意事項。一、重組蛋白質提取、純化與鑒定的特點一、重組蛋

23、白質提取、純化與鑒定的特點 與提取純化天然蛋白質相比，重組蛋白質的提取純化具與提取純化天然蛋白質相比，重組蛋白質的提取純化具有以下特點：有以下特點： 1. 1. 細菌、酵母、傳代細胞等表達體系組成背景清楚，細菌、酵母、傳代細胞等表達體系組成背景清楚，用它們表達的重組蛋白的提取純化簡單、容易；用它們表達的重組蛋白的提取純化簡單、容易； 2. 2. 分泌表達的蛋白更易提取純化，且不被細胞內蛋白分泌表達的蛋白更易提取純化，且不被細胞內蛋白污染，特別是利用無血清培養時。污染，特別是利用無血清培養時。 3. 3. 同一種蛋白質，應用不同的表達系統表達，其提取同一種蛋白質，應用不同的表達系統表達，其提取純

24、化的策略可能完全不同。純化的策略可能完全不同。 4. 4. 可根據可根據不同的表達系統特點，設計易于提取純化目不同的表達系統特點，設計易于提取純化目的蛋白的表達策略。的蛋白的表達策略。二、重組蛋白質提取、純化與鑒定的一般步驟二、重組蛋白質提取、純化與鑒定的一般步驟 1. 1. 細胞（菌體）與培養基的分離。細胞（菌體）與培養基的分離。常用離心法（大量生常用離心法（大量生產可用連續離心機）。根據目的蛋白存在的部位，收集細胞或產可用連續離心機）。根據目的蛋白存在的部位，收集細胞或培養基。培養基。 2. 2. 細胞破碎。細胞破碎。常用的方法有超聲破碎、高壓破碎和反復常用的方法有超聲破碎、高壓破碎和反復

25、凍融等。凍融等。目的：目的：將目標蛋白以可溶態充分暴露出來，并與其他將目標蛋白以可溶態充分暴露出來，并與其他成分分離。成分分離。若為分泌表達，本步驟可省略。若為分泌表達，本步驟可省略。 3. 3. 粗提。粗提。將絕大多數雜質去掉的過程。方法多為離心、將絕大多數雜質去掉的過程。方法多為離心、鹽析、有機溶劑沉淀、吸附、等電點、超濾等。鹽析、有機溶劑沉淀、吸附、等電點、超濾等。 4. 精制：精制：將粗提物中的雜質進一步去除。方法主將粗提物中的雜質進一步去除。方法主要為各種層析技術，特別是親和層析技術。要為各種層析技術，特別是親和層析技術。 基因工程包涵體在純化之前，需要可逆性的變性、基因工程包涵體在

26、純化之前，需要可逆性的變性、復性處理。復性處理。 5. 鑒定：鑒定：包括包括3方面的內容：含量；純度；活性。方面的內容：含量；純度；活性。貫穿于提取、純化的每一步。貫穿于提取、純化的每一步。 含量：含量：凱氏定氮法、凱氏定氮法、folin-酚法（酚法（lowry法）和紫法）和紫外吸收法等。外吸收法等。 純度：純度：生物大分子制備物的均一性（即純度）的生物大分子制備物的均一性（即純度）的鑒定。鑒定。要求：要求：一維電泳一條帶，二維電泳一個點，或一維電泳一條帶，二維電泳一個點，或hplc和毛細管電泳都是一個峰。末端氨基酸測定。和毛細管電泳都是一個峰。末端氨基酸測定。 活性：活性：比活或生物活性鑒定

27、。比活或生物活性鑒定。 6. 產物的濃縮、干燥和保存產物的濃縮、干燥和保存。三、重組蛋白質提取、純化與鑒定的注意事項三、重組蛋白質提取、純化與鑒定的注意事項 防止目的蛋白的降解是關鍵。措施如下：防止目的蛋白的降解是關鍵。措施如下： 1.1.對宿主細胞或目的蛋白進行基因操作，防止蛋對宿主細胞或目的蛋白進行基因操作，防止蛋白水解。如利用蛋白酶缺失的宿主菌或細胞；融合白水解。如利用蛋白酶缺失的宿主菌或細胞；融合表達等。表達等。 2.2.從重組蛋白溶液中除去蛋白酶。從重組蛋白溶液中除去蛋白酶。 3.3.抑制蛋白酶活性。如抑制劑（抑制蛋白酶活性。如抑制劑（edtaedta、pmsfpmsf），），降低操

28、作溫度等。降低操作溫度等。 4.4.迅速將表達的目的蛋白脫離表達體系。迅速將表達的目的蛋白脫離表達體系。 注意：應同時聯合應用幾種方法。注意：應同時聯合應用幾種方法。第三節第三節 蛋白質技術蛋白質技術1. 蛋白質提取純化技術；蛋白質提取純化技術；2. 蛋白質含量（純度）、蛋白質含量（純度）、活性及活性及結構測定技術結構測定技術；3. 免疫化學技術；免疫化學技術；4. 蛋白質的化學合成與修飾技術；蛋白質的化學合成與修飾技術；5. 蛋白質組研究技術（蛋白質組研究技術（2-de）。蛋白質含量（純度）測定技術蛋白質含量（純度）測定技術 蛋白質定量測定技術是生物化學研究中最常用、最基本的蛋白質定量測定技

29、術是生物化學研究中最常用、最基本的分析技術之一。蛋白質定量測定的方法很多，基本上都是根據分析技術之一。蛋白質定量測定的方法很多，基本上都是根據蛋白質的物理、化學或生物學特性建立的。蛋白質的物理、化學或生物學特性建立的。 目前，常用的方法有：定氮法，比色法（目前，常用的方法有：定氮法，比色法（folin酚試劑法酚試劑法(lowry法）、考馬斯亮藍法（法）、考馬斯亮藍法（bradford法）、紫外吸收法和雙法）、紫外吸收法和雙縮脲法縮脲法(biuret法法)。其中。其中lowry法和法和bradford法靈敏度最高，比法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏紫外吸收法靈敏1020倍，比倍，比biuret法靈

30、敏法靈敏100倍以上。定氮法倍以上。定氮法雖然比較復雜，但較準確，往往以定氮法測定的蛋白質作為其雖然比較復雜，但較準確，往往以定氮法測定的蛋白質作為其他方法的標準蛋白質。他方法的標準蛋白質。微量凱氏（微量凱氏（kjeldahlkjeldahl）定氮法）定氮法 蛋白質的元素組成中，氮的含量較為恒定，平蛋白質的元素組成中，氮的含量較為恒定，平均為均為1616，即，即1g1g氮相當于氮相當于6.25g6.25g蛋白質。而生物樣蛋白質。而生物樣品中非蛋白含氮化合物的量通常較小，故只要從生品中非蛋白含氮化合物的量通常較小，故只要從生物樣品中測定出總含氮量減去非蛋白含氮量，即可物樣品中測定出總含氮量減去非

31、蛋白含氮量，即可推算出樣品中蛋白質含量。定氮法比較復雜，但較推算出樣品中蛋白質含量。定氮法比較復雜，但較準確，往往以定氮法測定的蛋白質作為其他方法的準確，往往以定氮法測定的蛋白質作為其他方法的標準蛋白質。標準蛋白質。實驗原理實驗原理: 樣品與濃硫酸共熱，含氮有機物即分解產生氨；樣品與濃硫酸共熱，含氮有機物即分解產生氨；氨與硫酸作用，變成硫酸氨；經強堿堿化又分解釋氨與硫酸作用，變成硫酸氨；經強堿堿化又分解釋放氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據此酸液被中和放氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。的程度可計算得樣品之氮含量。 計算所得結果為樣品總氮量，如欲求得樣品中計算所

32、得結果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白氮含量，須將總氮量減去非蛋白氮。蛋白氮含量，須將總氮量減去非蛋白氮。 樣品中蛋白質的含量，用樣品中蛋白氮含量樣品中蛋白質的含量，用樣品中蛋白氮含量 6.25即得。即得。雙縮脲法（雙縮脲法（biuretbiuret法）法） 實驗借助于蛋白質分子中肽鍵與雙縮脲試劑特殊實驗借助于蛋白質分子中肽鍵與雙縮脲試劑特殊的顏色反應，通過分光光度計測定待測蛋白質在的顏色反應，通過分光光度計測定待測蛋白質在540nm處的光密度值。處的光密度值。 以已知標準蛋白的光密度值為縱坐標，標準蛋白以已知標準蛋白的光密度值為縱坐標，標準蛋白濃度為橫坐標制作濃度濃度為橫坐標制作濃度-光密度

33、標準曲線，利用該標準光密度標準曲線，利用該標準曲線法求出待測蛋白質含量。曲線法求出待測蛋白質含量。實驗原理：實驗原理： 雙縮脲（雙縮脲（nh3conhconh3）是兩個分子脲經）是兩個分子脲經180左右左右加熱，放出一分子氨后得到的產物。在強堿性溶液中，雙縮脲加熱，放出一分子氨后得到的產物。在強堿性溶液中，雙縮脲與與cuso4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個以上肽鍵的化合物都有雙縮脲反應。基或兩個以上肽鍵的化合物都有雙縮脲反應。 紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋

34、白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。測定范圍子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。測定范圍為為110mg/ml蛋白質溶液。干擾這一測定的物質主要有：硫酸蛋白質溶液。干擾這一測定的物質主要有：硫酸銨、銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。緩沖液和某些氨基酸等。紫色絡合物紫色絡合物folinfolin酚法（酚法（lowrylowry法）法） 此法是在雙縮脲反應的基礎上發展起來的，此法是在雙縮脲反應的基礎上發展起來的，folin酚試劑法最早由酚試劑法最早由lowry建立，是最靈敏的測定建立，是最靈敏的測定方法之一。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，方法之一。此法的顯色原理與雙縮

35、脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即只是加入了第二種試劑，即folin酚試劑，以增加酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。方法的靈顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。方法的靈敏度好于雙縮脲法，是目前教學、科研常用的蛋白質敏度好于雙縮脲法，是目前教學、科研常用的蛋白質含量測定方法。含量測定方法。 本實驗用本實驗用folin酚試劑和未知蛋白質反應產生酚試劑和未知蛋白質反應產生藍色反應，通過分光光度計測定其在藍色反應，通過分光光度計測定其在700nm處的光密處的光密度值，以已知標準蛋白的光密度值為縱坐標，標準蛋度值，以已知標準蛋白的光密度值為縱坐標，標準蛋白濃度為橫坐標制作濃度白濃度為橫坐標制作濃度-光密度標準曲線，利用該光密度標準曲線，利用該標準曲線法求出待測蛋白質含量。標準曲線法求出待測蛋白質含量。實驗原理：實驗原理： 顯色反應產生深蘭色的原因是：顯色反應產生深蘭色的原因是：在堿性條件下，在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物，并使肽鏈展蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物，并使肽鏈展開，其中的酪氨酸和色氨酸殘基充分暴露出來；開，其中的酪氨酸和色氨酸殘基充分暴露出來；folin酚試劑中的磷鉬酸鹽酚試劑中的磷鉬酸鹽磷鎢酸鹽被蛋白質磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和色氨酸殘基還原，產生深蘭色（