1、發酵工程學實驗組號： 7-8節第七小組 學號： 124120434 學院： 生命科學學院 專業、班級： 12生物技術 實驗課程名稱 發酵工程實驗 指導教師及職稱 唐湘華 開課學期 2014 至 2015 學年 下 學期 云南師范大學教務處編印實驗名稱：（一）特定產物工業生產菌種發酵及應用性質研究實驗時間第十三周實驗室睿智3-121小組合組是小組成員高勝全 李朝和 劉云謠 羅光洪 張志豪一、 實驗目的：1、掌握菌種選育、菌種發酵條件的優化和微生物酶制劑酶活測定的基本方法；2、了解酶學性質的研究.二、 實驗原理：1、理論依據（1）、果膠酶概況（2）、果膠酶的酶活測定方法（3）、微生物發酵生產特定產

2、物受培養基成分、培養條件和附加條件等的制約（4）、酶催化反應的進行受多種因素的影響2、果膠酶概況果膠質：是高等植物細胞壁內及細胞壁間的結構性多糖，是一類高分子碳水化合物，它的存在往往給果蔬加工等工藝帶來許多麻煩和損失。果膠酶：是指能分解果膠質的多種酶的總稱，廣泛存在于高等植物和微生物中。產生果膠酶的微生物：細菌、放線菌、酵母和霉菌，但目前商品果膠酶多數來自霉菌。果膠酶的應用：主要是用于果膠的分解，在水果加工、葡萄酒生產、麻類脫膠和飼料等方面有著廣泛的應用。3、 果膠酶的酶活測定方法 粘度降低法：利用粘度計測量在一定溫度、酶濃度和一定反應時間內，標準果膠溶液的粘度降低值。 脫膠作用時間法：以脫膠

3、作用的時間來測定果膠酶的酶活力。 次亞碘酸法：用滴定法定量測定半乳糖醛酸的生成量，以表示果膠酶的活力。 還原糖法（DNS法）：測定在一定溫度、酶濃度和一定反應時間內，水解果膠產生的還原糖的量。 DNS法：根據果膠酶水解果膠生成半乳糖醛酸，后者是一種還原糖，與3，5 -二硝基水楊酸共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定的范圍內，還原糖的量和反應液的顏色呈比例關系，可利用比色法在540nm進行測定。4、 微生物發酵生產產品受以下條件制約：培養基成分：C源、N源、無機鹽、水和生長因子培養條件：溫度、pH、溶解氧等附加條件：誘導物、表面活性劑等5、酶催化反應的進行受多種因素的影響 底物濃度 酶濃度

4、溫度 pH 激活劑 抑制劑三、 實驗材料（一）試劑 1、酶活測定用試劑和DNS 2、新鮮果汁（二）儀器燒杯、三角瓶、試管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、試劑瓶、研缽等；天平、滅菌鍋、超凈工作臺、培養箱、電爐、恒溫水浴鍋、記時器（精確到秒）、分光光度計等。（三）培養基1、菌種篩選使用2、黑曲霉Asp-2固體發酵用1、菌種篩選使用培養基 基本培養基: 果膠 1% ，磷酸氫二鈉0.5%，蛋白胨1%，pH4.5，瓊脂 2.0%。分離培養基果膠 0.5%，磷酸氫二鈉0.5%，瓊脂2.0%，pH4.5（3）發酵培養基果膠 1% ，磷酸氫二鈉0.5%，蛋白胨1%，pH4.5。2、 黑曲霉Asp-2固體發酵培

5、養基菌種斜面培養基（查氏培養基） NaNO3 0.2% K2HPO4 0.1% KCl 0.05% MgSO4 0.05%FeSO4 0.001% 蔗糖 3%瓊脂 2.5% 自然pH種子培養基 麩皮 3.0% ，橘子粉 2.0% ，硫酸銨0.5%,葡萄糖 1% ，KH2PO4 0.1% pH4.5固體發酵培養基：5瓶 / 組麩皮 10g，橘子粉 2.5g，(NH4)SO4 0.1g（0.8%干料計）葡萄糖 0.125g（1%干料計），水 15ml 要求：按組統一配制后分裝三角瓶先將(NH4)SO4 、葡萄糖用水溶解，再加其它。四、 實驗方法、步驟及注意事項：（1） 固體發酵果膠酶1、 菌種準備

6、菌種活化：試管保存菌種斜面活化30培養約60h液體培養：將菌種接種入裝有50mL種子培養基的250mL三角瓶內，30，200rpm，培養約40h，備用。2、 氮源的選擇和選擇的氮源添加量對產酶的影響(第一組）選擇硫酸銨、蛋白胨、牛肉膏按照1%濃度替換發酵培養基中的蛋白胨，接種5%液體種子，培養48小時，測定酶活。在發酵培養基中分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5% （按干料計）濃度的已選擇的氮源，保持培養基的其它成分不變，在相同接種量（約5%，即1.5ml）相同培養條件下（30，60h）發酵，測定酶活。3、 碳源的選擇和選擇的碳源添加量對產酶的影響 (第二組)選擇果膠、葡萄糖

7、、橘子粉按照1%濃度替換發酵培養基中的蛋白胨，接種5%液體種子，培養48小時，測定酶活。在液體發酵培養基中分別添加0、0.5%、1.0、2%、3.% 的選擇的碳源，保持培養基的其它成分不變，在相同條件下接種液體種子（約5%，即1.5ml），相同培養條件下，30，發酵60h ，測定酶活。4、 培養基含水量對產酶的影響(第三組）在發酵培養基中加入蒸餾水，使培養基中的含水量分別約為50%、55%、60%、65%和70%；保持培養基的其它成分不變，在相同接種量（5% ，即1.5ml ）相同培養條件下（30，4860h）發酵，測定酶活。5、 接種量對產酶的影響 (第三組）分別以4%、5%、6%、7%和8

8、%的接種量接種果膠酶產生菌于發酵培養基中，在相同的培養條件下（30，4860h）發酵，測定酶活。注意：由于接種的是液體菌種，所以在配制培養基時要將接種時多出的水分去掉。6、 發酵時間對產酶的影響 （第四組）在相同的培養基、相同的接種量（5%，即1.5ml ）和相同培養條件下（30）分別發酵36、48、60、72和84h ，測定酶活。注意：精確計算時間，準時取出發酵產物。7、 發酵溫度對產酶的影響 （第五組）保持培養基成分和接種量（5%，即1.5ml ）不變，分別在室溫、30、37和45的溫度條件下發酵4860h ，測定酶活。先把培養箱調到相應的溫度！8、果膠酶酶活的測定（1） 待測酶液的制備烘

9、干：把發酵產物倒于平皿中，45烘干過夜；制備酶粉：將烘干的發酵產物用研缽研磨成粉狀（盡量磨細），裝于塑料袋中備用；制備酶液：稱取0.1g酶粉，充分溶解于10mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（稀釋100倍），紗布（4層）過濾去除雜質；如果測定所得OD值不在有效值（0.2-0.6）范圍內，則相應地降低或增大稀釋倍數后再進行測定。（2）果膠酶酶活測定方法OD =（A+B）/ 2酶活定義：在pH3.0、 37條件下，每分鐘內從底物溶液中分解釋放1mol半乳糖醛酸所需要的酶量為一個酶活單位U/g。酶活計算公式 酶活（U/g）=A×5×K×N×1000/（T×W

10、×M） A: 樣品的OD值 （平均值） K: 標準曲線的斜率 N: 稀釋倍數 5： 0.2毫升反應液轉換為1毫升體積 T: 反應時間（min） 1000：轉換因子1mmol=1000mol W: 半乳糖醛酸的分子量（212.16g/mol） M: 稱取酶粉克數(g)繪制標準曲線的方法先配制一系列濃度不同的標準溶液，用選定的顯色劑進行顯色，在一定波長下分別測定它們的吸光度A。以A為橫坐標，濃度c為縱坐標，則得到一條擬合度較好的直線，稱為標準曲線。然后使用用完全相同的方法和步驟測定被測溶液的吸光度，便可從標準曲線上找出對應的被測溶液濃度或含量。半乳糖醛酸標準曲線的制作 精確稱取0.100

11、g半乳糖醛酸，用緩沖溶液定容至100ml，制得濃度為1mg/ml的半乳糖醛酸的標準溶液。標準曲線如下圖表所示（3）注意事項試管上編號：貼上用圓珠筆寫上編號的膠布，以防止保溫或沸水加熱時脫落；移液槍的使用：向試管內加入待測酶液或DNS時，槍頭不要觸碰管壁，也不要伸入液面下，連續吸取同一種溶液時可以不用更換槍頭！精確記時：每一管加入酶液的時間要做記錄，每管之間間隔的時間要合理；避免試管進水：煮沸和用流水沖洗時；實驗結果的記錄與分析9、儀器的使用恒溫水浴鍋分光光度計烘箱移液槍UV2000型分光光度計的使用注意提前半小時接通電源，打開機器開關使儀器通電，自檢；將對照液及測定液分別裝入比色杯3/4體積并

12、用鏡頭紙擦干外壁，放入樣品室；調節測定所用波長；讀數完畢，打開儀器蓋板，關閉開關，將比色杯沖洗干凈、浸泡于30酒精中。注意事項1、接種接種方式是液體固體，用滅菌的移液管或10ml量筒接種或大槍頭；接種后振蕩接種瓶，使菌種充分與固體培養基混合。2、水浴鍋的使用：水量（蒸餾水）要超過試管中的液面3、分光光度計使用時注意：測定OD在540nm、以對照為參比、測定吸光值4、及時清洗用過的槍頭實驗準備內容（1）黑曲霉Asp-2固體發酵用的培養基固體發酵培養基：5瓶/組注意配方等的不同，做好標記！（2） 滅菌培養基其它：10ml量筒（紗布和報紙包口）、移液管（塞棉花）等時間：滅菌45min注意事項1、酶粉

13、的選擇：同一大組采用同一酶粉進行應用性質的實驗！2、水浴鍋的使用水浴鍋的水量（蒸餾水）要超過試管中的液面各大組“處理時間”這項實驗共同在1個水浴鍋中進行3、分光光度計使用時注意OD660nm以蒸餾水為參比測定透光率五、 實驗報告（一）、實驗結果本次實驗在菌種分離時，已經分離到能產生果膠酶的菌株，但是在后期的培養過程中，發生一點點的錯誤，導致培養出來的菌種沒有酶活，也就是實驗失敗。（二）結果分析從培養的初期來看，實驗能得到菌種，說明實驗有成功的契機，但是在經過發酵培養之后，菌株沒有酶活，也就是在發酵培養時出現意外，本次試驗提醒我們做實驗和做事要仔細認真，步步為營。實驗名稱：（二）應用發酵制備的酶

14、液進行果汁澄清的應用實驗實驗時間第十四周實驗室睿智3-121小組合組是小組成員高勝全 李朝和 劉云謠 羅光洪 張志豪六、 實驗目的：了解影響果膠酶對果汁澄清效果的各種因素七、 實驗原理：1、果膠酶的應用：主要是用于果膠的分解，在水果加工、葡萄酒生產、麻類脫膠和飼料等方面有著廣泛的應用。 2、脫膠作用時間法：以脫膠作用的時間來測定果膠酶的酶活力。3、次亞碘酸法：用滴定法定量測定半乳糖醛酸的生成量，以表示果膠酶的活力。4、還原糖法（DNS法）：測定在一定溫度、酶濃度和一定反應時間內，水解果膠產生的還原糖的量。八、 實驗材料1、儀器設備：燒杯、三角瓶、試管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、試劑瓶、研缽

15、等；天平、滅菌鍋、超凈工作臺、培養箱、電爐、恒溫水浴鍋、記時器（精確到秒）、分光光度計等。2、材料：新鮮果汁、NAOH溶液 、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖、DNS試劑等等。九、 實驗方法、步驟及注意事項：（一）待測酶液的制備1、制備酶液：稱取1g酶粉，充分溶解于10mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（稀釋10倍），高速冷凍離心（10000轉、5min）去除雜質；2、根據發酵條件優化實驗中測定所得OD值大小，選擇酶活最高的酶粉制備酶液。（二）果汁的制備1、水果清洗破碎榨汁2、稀釋：用pH3.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋至10倍（三）果膠酶的應用性實驗果汁澄清實驗 1、果汁澄清的基本方法步驟樣品A管樣品 B管空

16、白管步驟1吸取稀釋果汁10毫升吸取稀釋果汁10毫升吸取稀釋果汁10毫升步驟245保溫5min45保溫5min45保溫5min步驟3稀釋酶液1mL稀釋酶液1mL不加步驟445精確保溫30min45精確保溫30min45精確保溫30min步驟5離心（5000轉，5分鐘）離心（5000轉，5分鐘）離心（5000轉，5分鐘）步驟6以蒸餾水為參比，660nm測定透光率以蒸餾水為參比，660nm測定透光率以蒸餾水為參比，660nm測定透光率T（透光率） =（A+B）/ 2 TTT0空白為T02、果膠酶添加量對澄清效果的影響（1，2組）（1）在反應體系中分別加入0.2、0.5 、1.0、1.5和2.0ml的

17、果膠酶液（2）在相同的反應條件（pH3.0，45）下處理30min，以蒸餾水為參比分別測定透光率。3、果汁pH對澄清效果的影響（3，4組）（1）用0.25mol/L H2SO4 和3mol/L NaOH 分別調節果汁的pH至1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0；（2）在反應體系中加入1.0ml的果膠酶液，相同的反應條件（45）下處理30min，以蒸餾水為參比分別測定透光率。4、果汁溫度對澄清效果的影響（5，6組）（1）保持反應體系的其它條件（1.0ml的果膠酶液、pH3.0，30min）不變，分別在室溫（溫度計測定）、37、45、 50、55條件下進行反應30Min;

18、（2）以蒸餾水為參比分別測定透光率。（四）注意事項1、水浴鍋的使用（1）水浴鍋的水量（蒸餾水）要超過試管中的液面（2）各大組“處理時間”這項實驗共同在1個水浴鍋中進行2、分光光度計使用時注意（1）OD660nm（2）以蒸餾水為參比（3）測定透光率十、 實驗結果及分析1、對不同的實驗組添加不同的果膠酶的量后得到的結果如下:（表一）果膠酶添加量對果汁澄清的影響酶液量（ml）OD660平均值(T)空白(TO)TTT0A管B管0.2 45.90%74.00%59.95%11.60%48.35%0.5 39.10%42.70%40.90%12.10%28.80%1.0 54.30%37.40%45.85

19、%11.40%34.45%1.5 21.80%9.30%15.55%11.90%3.65%2.0 47.30%48.90%48.10%12.00%36.10%根據上表格做出的折線圖（圖一）如下：【透光率之差（TTT0）】分析：根據表格數據及折線圖中的信息可以看出T隨著酶量的增加逐漸下降，到酶量為1.5ML時突然上升。但是根據理論分析隨著酶量的增加T的值應該是逐漸上升，直到某一濃度之后不再增加。出現上圖的結果說明實驗沒有成功，可能的原因有：（1）可能是測OD值時把管號弄混了；（2）可能是加酶時出現漏加現象；（3）從表一中A、B管數據的分布來看，該實驗數據的準確性太低，波動大，可信度低。由于種種原

20、因，本次實驗未能找出最適加酶量。2、不同PH的果汁對果汁澄清效果有影響的實驗結果如下（表二）果汁PH對澄清效果的影響PH管號OD660平均值(T)空白管(TO)TTT01.5 A19.60%19.50%20.60%1.10%B19.10%2.0 A12.10%23.50%20.60%2.90%B35.00%2.5 A61.80%64.00%20.60%43.40%B66.10%3.0 A74.60%65.50%20.60%44.90%B66.30%3.5 A80.40%80.50%20.60%59.90%B80.80%4.0 A91.90%93.50%20.60%72.90%B95.00%4.5 A64.40%63.00%20.60%42.40%B61.80%5.0 A36.40%28.00%20.60%7.40%B20.30%根據表二做出折線圖（圖二）如下：【透光率之差（TTT0）】分析：從表二中的數據來看，A、B兩管的數值差距不大，可信度較高，從圖二可以看出隨著PH的升高T不斷的升高，當達到一定的高度之后，T又逐漸下降，在PH=4時T的值達到最高為72.90%。也就是說當果汁的PH=4時果汁澄清的效果最好，即