1、生化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)講義實(shí)驗(yàn)一 糧食、油料檢驗(yàn)-脂肪酸值測(cè)定法一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康募Z食在儲(chǔ)藏過(guò)程中受到溫度、水分和酶的影響，其脂類物質(zhì)易發(fā)生水解和氧化反應(yīng)。水解造成糧食游離脂肪酸含量增加，對(duì)糧食的種用品質(zhì)和食用品質(zhì)產(chǎn)生不良影響。糧食游離脂肪酸含量以脂肪酸值表示,即中和100g糧食試樣中的游離脂肪酸值所需氫氧化鉀的毫克數(shù)。通過(guò)脂肪酸值的測(cè)定，可以判斷糧食品質(zhì)的變化情況，推測(cè)儲(chǔ)藏方法是否適當(dāng)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)要求掌握測(cè)定脂肪酸值的技術(shù)。二、 原理浸出法。脂肪酸能溶于有機(jī)溶劑，利用苯來(lái)浸出脂肪酸，然后在酒精溶液中用標(biāo)準(zhǔn)KOH溶液中和脂肪酸，根據(jù)滴定時(shí)所消耗的堿液數(shù)量，就可求出脂肪酸值。三、 材料、儀器和試劑1、材料大米

2、2、儀器帶塞錐形瓶，量筒，移液管，微量滴定管，表面皿，天平，振蕩器，漏斗3、試劑（1）、0.01N KOH（或NaOH）乙醇(95%)溶液先配制約0.5N的KOH水溶液，再取20 ml,用95%乙醇稀釋至500mL（2）、苯，95%乙醇（3）、0.04%酚酞乙醇溶液0.2g酚酞溶于500ml 95%乙醇溶液中。四、操作方法1、浸出稱取事先磨細(xì)的大米粉20±O.Olg于200ml或250ml錐形瓶中，加入50ml苯，加塞搖動(dòng)幾秒鐘后，打開塞子放氣，再蓋緊瓶塞置振蕩器振蕩30min(或用手振蕩45min)，取出，將瓶?jī)A斜靜置數(shù)分鐘，使濾液澄清。注：粉碎后樣品如在20以上室溫放置，脂肪酸值

3、會(huì)很快增加，因此，必須及時(shí)進(jìn)行測(cè)定。2、過(guò)濾用快速濾紙過(guò)濾，棄去最初幾滴濾液后用量筒收集濾液25ml。3、滴定將25ml濾液移入錐形瓶中，再用原量筒取25m1 0.04%酚酞乙醇溶液加入錐形瓶中，立即用氫氧化鉀乙醇溶液滴定至呈現(xiàn)微紅色半分鐘內(nèi)不消失為止。記下所耗用氫氧化鉀乙醇溶液毫升數(shù)V1。4、空白試驗(yàn)取25m1 0.04%酚酞乙醇溶液，用氫氧化鉀乙醇溶液滴定，記下耗用氫氧化鉀乙醇溶液毫升數(shù)V2。五、結(jié)果計(jì)算脂肪酸值以中和100g大米樣品中游離脂肪酸所需氫氧化鉀毫克數(shù)表示。脂肪酸值=（V1-V2）×N×56.1×50/25×100/W（1-M）V1：滴定

4、樣品所用的氫氧化鉀乙醇溶液體積，ml，V2：滴定25ml酚酞乙醇溶液所用氫氧化鉀乙醇溶液的體積，ml,50：浸泡樣品用苯的體積，ml，25：用于滴定的濾液體積，ml,N：氫氧化鉀(或氫氧化鈉)乙醇溶液的當(dāng)量濃度，56.1：氫氧化鉀毫克當(dāng)量，W：樣品重量，M：樣品水分百分率，%100：換算為100g試樣重量。注:浸出液顏色過(guò)深，滴定終點(diǎn)不好觀察時(shí)，改用四折濾紙，在濾紙錐頭內(nèi)放入約0.5g粉末活性碳，慢慢注入浸出液，邊脫色邊過(guò)濾。六、思考題1、糧食脂肪酸值測(cè)定的意義？實(shí)驗(yàn)二 鄰甲苯胺法測(cè)定血糖濃度一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握鄰甲苯胺血糖測(cè)定法的基本原理及操作方法。2、了解鄰甲苯胺血糖測(cè)定法的臨床意義及應(yīng)用

5、。二、原理血漿樣品中的葡萄糖在酸性環(huán)境中與鄰甲苯胺共熱時(shí)，葡萄糖脫水轉(zhuǎn)化為5-羥甲基-呋喃甲醛，后者與鄰甲苯胺結(jié)合為藍(lán)綠色的醛亞胺（Schiff鹼）。血清中的蛋白質(zhì)則溶解在冰醋酸和硼酸中不發(fā)生混濁。將標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液與樣品按相同方法處理，在680nm波長(zhǎng)處比色，即可測(cè)得樣品中葡萄糖含量。三、材料、儀器和試劑1、實(shí)驗(yàn)材料：新鮮血漿2、儀器722型分光光度計(jì)，水浴鍋，試管3、試劑1、 鄰甲苯胺試劑稱取硫脲2.5g，溶于冰醋酸750ml中。將此溶液轉(zhuǎn)入1L容量瓶?jī)?nèi)，加鄰甲苯胺150ml，2.4硼酸溶液100ml,再加冰醋酸至1L刻度，置棕色瓶中，至少可應(yīng)用2個(gè)月。2、 葡萄糖貯存標(biāo)準(zhǔn)液（100mg/m

6、l）將少量無(wú)水葡萄糖置于硫酸干燥器內(nèi)一夜。精確稱取此葡萄糖1.000g，以飽和苯甲酸溶液溶解并轉(zhuǎn)移入100ml容量瓶?jī)?nèi)，再以飽和苯甲酸溶液稀釋至100ml刻度。置冰箱中可長(zhǎng)期保存。3、 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1.5mg/ml）在100ml容量瓶?jī)?nèi)，加入葡萄糖貯存標(biāo)準(zhǔn)液15.0ml，用飽和苯甲酸溶液稀釋至100ml刻度，混和。4、 12mmol/L苯甲酸溶液稱取苯甲酸1.4g，加入蒸餾水900ml,加熱助溶，冷卻后加蒸餾水至1000ml。四、實(shí)驗(yàn)操作1、采得待測(cè)血樣（抗凝）后立即離心以分離血漿（3,000轉(zhuǎn)離心15分鐘）。2、取干燥試管3支，分別標(biāo)出號(hào)碼，按下表添加試劑。鄰甲苯胺法測(cè)血糖操作表管別試劑(

7、ml)測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管血清（漿）0.20ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.20ml蒸餾水0.20ml鄰甲苯胺試劑6.0ml6.0ml6.0ml3、混勻各管內(nèi)容物置沸水浴中加熱15分鐘后取出用流水冷卻。4、以空白管校正零點(diǎn)，讀取各管680nm處吸光度值。五、結(jié)果計(jì)算 六、思考題1、如何獲得血漿？血漿的主要成分是什么？血液由細(xì)胞部分和非細(xì)胞部分組成。細(xì)胞部分（占45）有紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板；非細(xì)胞部分（占55）是血漿，血漿的主要成分是水、蛋白質(zhì)、糖類、脂類、激素、無(wú)機(jī)鹽等。離開血管的全血經(jīng)抗凝處理后，通過(guò)離心沉淀，可獲得不含細(xì)胞成分的液體，即血漿。2、測(cè)定血糖時(shí)為什么要在空腹?fàn)顟B(tài)下取血？3、試討論

8、血糖測(cè)定的臨床意義及應(yīng)用？附：注意事項(xiàng)1、本法不需要除去蛋白質(zhì)，鄰甲苯胺試劑只與糖醛起反應(yīng)，不與血中其他還原物質(zhì)起反應(yīng)。2、顯色反應(yīng)與水的含量有關(guān)，故應(yīng)使標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管的含水量一致。3、溫度對(duì)顯色反應(yīng)有明顯影響，煮沸時(shí)間和溫度應(yīng)準(zhǔn)確控制。4、顯色后顏色不穩(wěn)定，室溫每放置1分鐘，顏色降低0.15。5、鄰甲苯胺試劑中冰醋酸濃度很高，使用不當(dāng)容易損壞比色儀器。6、鄰甲苯胺是致癌劑，測(cè)定過(guò)程中應(yīng)小心使用。實(shí)驗(yàn)三 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離過(guò)氧化物同工酶一、目的掌握不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳的基本原理和操作方法，同時(shí)對(duì)同工酶有一個(gè)感性的認(rèn)識(shí)。二、原理不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳是指使用不同凝膠孔徑和不

9、同緩沖系統(tǒng)的電泳。系統(tǒng)的不連續(xù)性體現(xiàn)在：1、凝膠板的不連續(xù)性凝膠板由上、下兩層膠組成，兩層凝膠的孔徑不同。上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。2、緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同樣品緩沖液（pH6.7的Tris-HC1），濃縮膠緩沖液（pH6.7的Tris-HC1），分離膠緩沖液（pH8.9的Tris-HC1）和電極緩沖液（pH8.3的Tris-甘氨酸）3、電位梯度的不連續(xù)性在這樣一個(gè)不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)。在這三種效應(yīng)的共同作用下，待測(cè)物質(zhì)被很好地分離開來(lái)。（1）、樣品的濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)：待分離樣品中的各組分在濃縮膠中會(huì)被壓縮成層，而使原

10、來(lái)很稀的樣品得到高度濃縮。在聚丙烯酰胺凝膠中，雖然濃縮膠和分離膠用的都是Tris-HCl緩沖液，但上層濃縮膠為pH 6.7，下層分離膠為pH 8.9。HCl是強(qiáng)電解質(zhì)，不管在哪層膠中，HCl幾乎都全部電離，Cl布滿整個(gè)膠板。待分離的蛋白質(zhì)樣品加在樣品槽中，浸在pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液中。電泳一開始，有效泳動(dòng)率最大的Cl迅速跑到最前邊，成為快離子（前導(dǎo)離子）。在pH6.7條件下，甘氨酸（pI=6.0）很少解離，其有效泳動(dòng)率很低，跑在最后邊，成為慢離子（尾隨離子）。這樣，快離子和慢離子之間就形成了一個(gè)不斷移動(dòng)的界面。帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，其有效泳動(dòng)率介于快慢離子之間，被夾持分布于界面附近，逐

11、漸形成一個(gè)區(qū)帶。由于快離子快速向前移動(dòng)，在快離子的后邊形成一個(gè)離子濃度低的區(qū)域即低電導(dǎo)區(qū)。因?yàn)殡娢惶荻萔、電流強(qiáng)度I和電導(dǎo)率S之間有如下關(guān)系：V=I/S。所以在電流恒定條件下低電導(dǎo)區(qū)兩側(cè)就產(chǎn)生了較高的電位梯度。這種在電泳開始后產(chǎn)生的高電位梯度作用于蛋白質(zhì)和甘氨酸慢離子加速前進(jìn)，追趕快離子。當(dāng)快離子和慢離子的移動(dòng)速度相等時(shí)，則快離子和慢離子之間形成一個(gè)穩(wěn)定而又不斷向陽(yáng)板移動(dòng)的界面。也就是說(shuō)在高電位梯度區(qū)和低電位梯度區(qū)之間的地方形成一個(gè)迅速移動(dòng)的界面，由于蛋白質(zhì)樣品的有效遷移率恰好介于快慢離子之間，因此也就聚焦在這個(gè)移動(dòng)的界面附近，被濃縮形成一個(gè)狹小的中間層。由于兩層凝膠孔徑不同，蛋白質(zhì)向下移動(dòng)到

12、兩層凝膠界面時(shí)，阻力突然加大，速度變慢,使得在該界面處的待分離蛋白質(zhì)區(qū)帶變窄，濃度升高。這就是所謂的濃縮效應(yīng)。在此區(qū)帶中，各種蛋白質(zhì)又按其電荷而分成不同層次，在進(jìn)入分離膠前被初步分離，形成若干條離得很近但又不同的“起跑線”。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和慢離子都進(jìn)入分離膠后，pH從6.7變?yōu)?.9，甘氨酸解離度劇增，有效遷移率迅速加大，使它越過(guò)蛋白質(zhì)并直接在Cl-后移動(dòng)。不連續(xù)的高電位梯度不再存在。于是，此后的電泳過(guò)程中，蛋白質(zhì)分子在均一的電壓梯度和pH值中泳動(dòng)，并根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。與連續(xù)系統(tǒng)相比，不連續(xù)系統(tǒng)的分辨率大大提高，因此已成為目前廣泛使用的分離分析手段。由于電泳基質(zhì)的四個(gè)不連續(xù)性，使

13、樣品在電泳開始時(shí)，得以濃縮，然后再被分離。（2）、分子篩效應(yīng)分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過(guò)一定孔徑的分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同，因此表現(xiàn)出不同的遷移率。（3）、電荷效應(yīng)每種蛋白質(zhì)分子所載有效電荷不同，因而遷移率不同。本實(shí)驗(yàn)采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術(shù)，分離小麥幼苗過(guò)氧化物酶同工酶，根據(jù)酶的生物化學(xué)反應(yīng)，通過(guò)染色方法顯示出酶的不同區(qū)帶，以鑒定小麥幼苗過(guò)氧化物酶同工酶。三、材料、儀器和試劑1、實(shí)驗(yàn)材料小麥幼苗2、儀器（1）垂直板電泳槽及附件（玻璃板、硅膠條、梳子、導(dǎo)線等）（2）穩(wěn)壓穩(wěn)流直流電泳儀（3）高速離心機(jī)（10,000r/min）（4）量筒：500mL×1，10mL×

14、1，5mL×1（5）燒杯：250mL×4（6）微量注射器（50L）（7）其他：玻棒、大培養(yǎng)皿等3、試劑序號(hào)試 劑 名 稱配 制 方 法11.5瓊脂1.5g瓊脂，100mL pH8.9分離膠緩沖液浸泡，用前加熱溶化。2分離膠緩沖液，pH8.9(pH8.9 Tris-HCl緩沖液)取48 mL 1mol/L HCl，Tris36.8g，用無(wú)離子水溶解后定容至100 mL。3濃縮膠緩沖液，pH6.7(pH6.7 Tris-HCl緩沖液)取48 mL 1 mol/L HCl，Tris 5.98g，用無(wú)離子水溶解后定容至100 mL。4分離膠丙膠貯液(Acr-Bis貯液)Acr 28

15、.0g，Bis 0.735g，用無(wú)離子水溶解后定容至100 mL，過(guò)濾除去不溶物，裝入棕色試劑瓶，4保存。5濃縮膠丙膠貯液(Acr-Bis貯液)Acr 10g，Bis 2.5g，用無(wú)離子水溶解后定容至100 mL，過(guò)濾除去不溶物，裝入棕色試劑瓶，4保存。610過(guò)硫酸銨溶液（Ap）10g過(guò)硫酸銨溶于100 mL無(wú)離子水中(當(dāng)天配制)。7四甲基乙二胺（TEMED）原液。8核黃素溶液核黃素4.0mg，無(wú)離子水溶解后定容至100mL。9電極緩沖液，pH8.3(pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液)Tris 6 g，甘氨酸28.8 g，溶于無(wú)離子水后定容至1 000 mL，用時(shí)稀釋10倍。1040蔗糖溶液

16、蔗糖40 g，溶于100 mL無(wú)離子水中。11pH4.7乙酸緩沖液乙酸鈉70.52 g，溶于500 mL蒸餾水中再加36 mL冰乙酸，蒸餾水定容至1 000 mL。127乙酸溶液19.4 mL 36乙酸稀釋至100 mL。13樣品提取液，pH8.0(pH8.0 Tris-HCl緩沖液)Tris 12.1 g，加無(wú)離子水1 000 mL，以HCl調(diào)節(jié)pH至8.0140.5溴酚藍(lán)溶液0.5 g溴酚藍(lán)溶于100 mL無(wú)離子水中。15聯(lián)大茴香胺染色液聯(lián)大茴香胺250 mg溶于140 mL 95乙醇中，加20 mL蒸餾水，使用前加3H2O2 5 mL（當(dāng)天配制）四、實(shí)驗(yàn)步驟1、夾心式垂直電泳槽的安裝（1

17、）將電泳用的玻板，洗凈烘干備用。（2）將長(zhǎng)短玻璃板分別插在凹形橡膠框中，安裝成凝膠模具。切勿用手接觸兩玻璃板相對(duì)的內(nèi)面。（3）將安裝好的凝膠模具安放在儲(chǔ)液槽之間，注意短玻璃板面對(duì)負(fù)極，插上固定螺絲將儲(chǔ)液槽和凝膠模具固定好，固定螺絲在擰緊時(shí)應(yīng)雙手以對(duì)角線的方式旋緊螺絲。（4）待電泳槽安裝好后，用膠頭滴管沿長(zhǎng)玻璃板外側(cè)面將瓊脂灌入，將長(zhǎng)玻璃板下部與膠框的縫隙密封，注意不要產(chǎn)生氣泡。一旦用瓊脂封板后，模具不應(yīng)再挪動(dòng)，以防產(chǎn)生裂縫在灌膠時(shí)發(fā)生泄漏。2、凝膠的制備將貯液由冰箱取出，待與室溫平衡后再配制工作液。按下表比例配制分離膠分離膠取樣表名稱分離膠緩沖液分離膠丙膠貯液10%APTEMED無(wú)離子水用量m

18、L360.030.0615加過(guò)硫酸銨前，溶液應(yīng)抽氣。將分離膠沿長(zhǎng)玻璃板加入膠室內(nèi)，小心不要產(chǎn)生氣泡，加至距短玻璃板頂端3cm處，立即覆蓋23mm的水層，靜置待聚合（約40min），當(dāng)膠與水層的界面重新出現(xiàn)時(shí)表明膠已聚合。按下表比例配制濃縮膠濃縮膠取樣表名稱濃縮膠緩沖液濃縮膠丙膠貯液TEMED核黃素溶液蔗糖用量mL120.0314用濾紙小心吸去表面的水層，切勿破壞膠面的完整性。立即加入濃縮膠，插入梳子（即樣品槽模板），待膠凝后，小心取出梳子。將稀釋10倍的電極緩沖液倒入兩槽中，前槽（短板側(cè)）緩沖液要求沒過(guò)樣品槽，后槽（長(zhǎng)板側(cè)）緩沖液要求沒過(guò)電極。3、樣品的制備稱取小麥幼苗莖部0.5 g，放入研缽

19、內(nèi)，加pH 8.0提取液1 mL，于冰水浴中研成勻漿，然后以2 mL提取液分幾次洗入離心管，在高速離心機(jī)上以8 000r/min離心10min，倒出上清液，以等量40蔗糖及1/5體積溴酚藍(lán)指示劑混和，留作點(diǎn)樣用。4、點(diǎn)樣用微量注射器吸取少量樣液，在濃縮膠上層點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)樣槽15-50L。點(diǎn)樣時(shí)須小心，防止樣品液的擴(kuò)散。5、電泳接好電源線，打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電流到20mA左右，樣品進(jìn)入到分離膠后加大到30mA，維持恒流。待指示染料下行到距膠板末端1cm處，即可停止電泳。把調(diào)節(jié)旋扭調(diào)至零，關(guān)閉電源，電泳約3h。6、剝膠電泳結(jié)束后，取出電泳膠板，去掉膠套，用不銹鋼藥鏟或鑷子撬開短玻璃板，從凝膠板上切

20、下一角作為加樣標(biāo)記，在兩側(cè)溴酚藍(lán)染料區(qū)帶中心，插入細(xì)銅絲作為前沿標(biāo)記。去掉濃縮膠，用玻棒協(xié)助將分離膠放到盛有pH4.7的乙酸緩沖液的大培養(yǎng)皿中浸泡10min。7、染色倒去乙酸緩沖液，加聯(lián)大茴香胺染色液，使淹沒整個(gè)膠板，于室溫下顯色20min，即得到過(guò)氧化物酶同工酶的紅褐色酶譜。該酶活性染色過(guò)程如下：過(guò)氧化物酶分解H2O2產(chǎn)生氧基，后者使聯(lián)大茴香胺發(fā)生反應(yīng)生成褐色化合物。所以用染色液浸泡凝膠時(shí)，有過(guò)氧化物酶同工酶蛋白質(zhì)條帶的部位便出現(xiàn)褐色的譜帶。倒掉染色液，重新加入7的乙酸溶液，于日光燈下觀察記錄酶譜，繪圖或照相。五、結(jié)果記錄繪制示意圖，將樣品的各個(gè)酶帶如實(shí)地描繪下來(lái)，并計(jì)算各酶帶的相對(duì)遷移率(

21、Rf)Rf酶帶遷移距離/前沿指示劑遷移距離測(cè)量遷移率時(shí)，應(yīng)以酶帶的中部位置為準(zhǔn)六、思考題1、濃縮膠中加入蔗糖的目的是什么？2、分離膠分別在pH4.7的乙酸緩沖液和7乙酸溶液中浸泡的目的是什么？3、過(guò)氧化物同工酶染色的原理？4、樣品中加少許溴酚蘭和一定濃度的蔗糖溶液的作用分別是什么？實(shí)驗(yàn)四 谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力測(cè)定一、目的1、了解血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性測(cè)定的臨床意義2、掌握谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力的測(cè)定方法二、原理在氨基酸的分解代謝過(guò)程中，聯(lián)合脫氨基是大多數(shù)氨基酸的主要代謝方式，通過(guò)轉(zhuǎn)氨基作用與氧化脫氨基作用偶聯(lián)完成。本實(shí)驗(yàn)以丙氨酸和a-酮戊二酸作為谷丙轉(zhuǎn)氨酶作用的底物，利用內(nèi)源性磷酸吡哆醛作為輔酶，在一定條件及時(shí)間作用后來(lái)測(cè)定所生成的丙酮酸的含量來(lái)確定其酶的活力。丙酮酸能與2，4二硝基苯肼結(jié)合，生成丙酮酸-2，4二硝基苯腙，后者在堿性條件溶液中呈棕色，其最大吸收波長(zhǎng)為505nm，可用于測(cè)定丙酮酸的含量。a-酮戊二酸也能與2，4M硝基苯肼結(jié)合生成相應(yīng)的苯腙而干擾比色