1、熒光顯微鏡技術的特點和應用熒光顯微鏡技術的特點和應用 透射式透射式落射式落射式 和傳統顯微技術相比和傳統顯微技術相比,熒光顯微技術具有以下優點熒光顯微技術具有以下優點:(1)(1)熒光顯微鏡所用光源的波長比傳統顯微鏡光源的熒光顯微鏡所用光源的波長比傳統顯微鏡光源的波長短波長短1/2,1/2,因此熒光顯微鏡的分辨能力超出了傳因此熒光顯微鏡的分辨能力超出了傳統顯微鏡的分辨率的極限統顯微鏡的分辨率的極限(2)(2)熒光顯微鏡技術具有高度靈敏性和專一性熒光顯微鏡技術具有高度靈敏性和專一性. .它所它所用染料的量是極其微小的用染料的量是極其微小的, ,只相當于傳統顯微技術只相當于傳統顯微技術中染料消耗量

2、的幾千分之一中染料消耗量的幾千分之一. . (3)(3)熒光顯微鏡能夠直接顯示細胞內的生物化學成熒光顯微鏡能夠直接顯示細胞內的生物化學成分分, ,并且顯示的彩色效果很明亮并且顯示的彩色效果很明亮, ,極易觀察極易觀察, ,極易進極易進行定量分析行定量分析, ,而且能以極低濃度的染料檢測出含量而且能以極低濃度的染料檢測出含量極微的物質極微的物質. . (4) (4) 隨著新的熒光染料的發明隨著新的熒光染料的發明, ,可不斷擴大被測物可不斷擴大被測物質的范圍質的范圍. . 生物學材料，有各種產生熒光生物學材料，有各種產生熒光:1.1.自發熒光自發熒光: :或原發熒光或原發熒光 細胞組織中自然存在的

3、某些物質可被激發產細胞組織中自然存在的某些物質可被激發產生熒光生熒光2.2.誘發熒光誘發熒光 材料中的某些物質經一定的化學處理后，可材料中的某些物質經一定的化學處理后，可轉化為熒光色團，由此被誘發產生熒光。最常見轉化為熒光色團，由此被誘發產生熒光。最常見的是甲醛誘發蛋白質中所含的芳香乙胺基團轉化的是甲醛誘發蛋白質中所含的芳香乙胺基團轉化為熒光色團。戊二醛也能誘發熒光為熒光色團。戊二醛也能誘發熒光 3 3熒光染料染色：熒光染料染色： 應用含熒光色團的物質作為染料，使與生物應用含熒光色團的物質作為染料，使與生物組織中和該物質有特殊親和力的成分相結合，即組織中和該物質有特殊親和力的成分相結合，即可被

4、激發熒光。這類染料稱為熒光染料或熒色素。可被激發熒光。這類染料稱為熒光染料或熒色素。許多常規染色劑許多常規染色劑( (如剛果紅、曙紅、堿性品紅、水如剛果紅、曙紅、堿性品紅、水溶性苯胺藍等溶性苯胺藍等) )兼有熒光染料的性能兼有熒光染料的性能1.dna1.dna研究研究 用細胞熒光測定技術測量用細胞熒光測定技術測量dna,dna,是熒光顯微技術和是熒光顯微技術和細胞光度技術相結合的產物細胞光度技術相結合的產物, ,標志著前者由定性向標志著前者由定性向定量測定發展定量測定發展. .吖啶橙吖啶橙 3 3，6 6（二甲胺基）吖啶鹽酸鹽，分子式（二甲胺基）吖啶鹽酸鹽，分子式c17h19n3 c17h19

5、n3 hcl hcl zncl zncl , , 分子量分子量438.12g/mol,438.12g/mol,是一種熒光是一種熒光色素色素，其檢測激發濾光片波長，其檢測激發濾光片波長488nm,488nm,阻斷阻斷濾光片濾光片波長波長515nm515nm。 吖啶橙吖啶橙 染色原理染色原理:吖啶橙可對細胞中的吖啶橙可對細胞中的dnadna和和rnarna同時染同時染色而顯示不同顏色的熒光。其激發峰為色而顯示不同顏色的熒光。其激發峰為492nm492nm，熒，熒光發射峰為光發射峰為530nm530nm（dnadna）、）、640640（rnarna），它與雙），它與雙鏈鏈dnadna的結合方式是嵌

6、入雙鏈之間，而與單鏈的結合方式是嵌入雙鏈之間，而與單鏈dnadna和和rnarna則由靜電吸引堆積在其磷酸根上。在藍光則由靜電吸引堆積在其磷酸根上。在藍光（502nm502nm）激發下，細胞核發亮綠色熒光（約）激發下，細胞核發亮綠色熒光（約530nm530nm），胞質），胞質rnarna發橘紅色熒光（發橘紅色熒光（580nm580nm）。）。 它與它與細胞細胞中中dnadna和和rnarna結合量存在差別，可發出不結合量存在差別，可發出不同顏色的同顏色的熒光熒光，與，與dnadna結合量少發綠色熒光，與結合量少發綠色熒光，與rnarna結合量多發桔黃色或桔紅色熒光。該染料具有結合量多發桔黃色或

7、桔紅色熒光。該染料具有膜通透性，能透過細胞膜，使核膜通透性，能透過細胞膜，使核dnadna和和rnarna染色。染色。因此，在熒光顯微鏡下觀察，吖啶橙可透過正常因此，在熒光顯微鏡下觀察，吖啶橙可透過正常細胞膜，使細胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光。細胞膜，使細胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光。 體外培養的肝癌細胞吖啶橙熒光染色體外培養的肝癌細胞吖啶橙熒光染色可見含可見含dna的細胞核顯示黃綠色熒光，含的細胞核顯示黃綠色熒光，含rna的細胞質顯示橘紅色熒光的細胞質顯示橘紅色熒光dapidapi dapidapi即即4,6-4,6-二脒基二脒基-2-2-苯基吲哚苯基吲哚(4,6-(4,6-diamidino-

8、2-phenylindole)diamidino-2-phenylindole)，是一種能夠與，是一種能夠與dnadna強力強力結合的結合的熒光染料熒光染料，最大吸收波長為，最大吸收波長為358nm358nm，最，最大發射波長為大發射波長為461nm461nm。dapidapi染色原理：染色原理： dapi dapi 為一種為一種熒光染料熒光染料，可以穿透細胞膜與，可以穿透細胞膜與細細胞核胞核中的雙鏈中的雙鏈dnadna結合而發揮標記的作用，可以產結合而發揮標記的作用，可以產生比生比dapidapi自身強自身強2020多倍的熒光，和多倍的熒光，和ebeb相比，對雙鏈相比，對雙鏈dnadna的染

9、色靈敏度要高很多倍。顯微鏡下可以看到的染色靈敏度要高很多倍。顯微鏡下可以看到顯藍色熒光的細胞，熒光顯微鏡觀察顯藍色熒光的細胞，熒光顯微鏡觀察細胞標記細胞標記的效的效率高率高( (幾乎為幾乎為100 %) 100 %) ，且對活細胞無毒副作用。，且對活細胞無毒副作用。2.2.細胞壁研究細胞壁研究 熒光顯微技術在植物細胞學中應用的一個突出熒光顯微技術在植物細胞學中應用的一個突出方面方面, ,是用于鑒定細胞壁成分是用于鑒定細胞壁成分, ,研究壁形成和再生研究壁形成和再生, ,以及壁在植物發育過程中和環境影響下性質的變化以及壁在植物發育過程中和環境影響下性質的變化 觀察細胞壁的方法很多觀察細胞壁的方法

10、很多, ,如用專一的染料染色如用專一的染料染色或利用纖維素的偏振光性質等。現在國外常用的方或利用纖維素的偏振光性質等。現在國外常用的方法是熒光增白劑染色法是熒光增白劑染色, ,在在4qonm4qonm左右的激發光照射下左右的激發光照射下觀察細胞壁觀察細胞壁( (纖維素纖維素) )所產生的綠色熒光來判斷細胞所產生的綠色熒光來判斷細胞壁的有無壁的有無 熒光增白劑染色熒光增白劑染色 熒光增白劑和細胞壁成分有強烈親和力熒光增白劑和細胞壁成分有強烈親和力, ,當前常用當前常用的熒光增白劑有的熒光增白劑有st,m2r,vbl.stst,m2r,vbl.st開始被用于顯示細開始被用于顯示細菌菌, ,放線菌與

11、真菌的細胞壁放線菌與真菌的細胞壁, ,在粘菌材料中在粘菌材料中, ,它被證它被證明與纖維素和幾丁質有親和力明與纖維素和幾丁質有親和力 胼胝質是一種以胼胝質是一種以-1,3-1,3鍵結合的葡聚糖。在植物鍵結合的葡聚糖。在植物的篩管代謝、配子體發育等生命活動中發揮著重的篩管代謝、配子體發育等生命活動中發揮著重要的調節作用，其合成、分解直接關系植物正常要的調節作用，其合成、分解直接關系植物正常的生長代謝過程。的生長代謝過程。 胼胝質是一種以胼胝質是一種以-1,3-1,3鍵結合的葡聚糖。在植物鍵結合的葡聚糖。在植物的篩管代謝、配子體發育等生命活動中發揮著重的篩管代謝、配子體發育等生命活動中發揮著重要的

12、調節作用，其合成、分解直接關系植物正常要的調節作用，其合成、分解直接關系植物正常的生長代謝過程。的生長代謝過程。 3 3細胞生活力測定細胞生活力測定 熒光素熒光素雙醋酸酯（雙醋酸酯（fdafda）是一種常用的培養動）是一種常用的培養動植物細胞植物細胞以以及及植物細胞植物細胞原生質體原生質體的生活力鑒定染料，其染色機理也利的生活力鑒定染料，其染色機理也利用了死活細胞在代謝上的差異：用了死活細胞在代謝上的差異：fdafda本身不產生熒光，也本身不產生熒光，也無極性，能自由滲透出入完整的細胞膜。當無極性，能自由滲透出入完整的細胞膜。當fdafda進入活細進入活細胞后，被細胞內的脂酶分解，生成有極性的

13、、能產生熒光胞后，被細胞內的脂酶分解，生成有極性的、能產生熒光的物質的物質熒光素熒光素，該物質不能自由透過活的細胞膜，積，該物質不能自由透過活的細胞膜，積累在細胞膜內，因而使有活力的細胞產生綠色熒光；而無累在細胞膜內，因而使有活力的細胞產生綠色熒光；而無活力的細胞因不能使活力的細胞因不能使fdafda分解，而無法產生熒光分解，而無法產生熒光 活體染色活體染色vital staining 將無毒或毒性較小的某種染料注入動物體內,可被機體內某些組織或細胞所攝取,稱為活體.影響熒光的因素影響熒光的因素1. ph1. ph的影響的影響 帶有酸性或堿性官能團的大多數芳香族化合物帶有酸性或堿性官能團的大多

14、數芳香族化合物的熒光一般都與溶液的熒光一般都與溶液phph值有關，例如：在值有關，例如：在ph=7-12ph=7-12的溶液中苯胺以分子形式存在，會發出藍色熒光；的溶液中苯胺以分子形式存在，會發出藍色熒光；而在而在ph2ph13ph13的溶液中苯胺以離子形式存在，的溶液中苯胺以離子形式存在，都不會發出熒光。都不會發出熒光。 同時所用酸的種類也影響熒光的強度，例如：同時所用酸的種類也影響熒光的強度，例如：奎寧在硫酸溶液中的熒光比在鹽酸中的要強。奎寧在硫酸溶液中的熒光比在鹽酸中的要強。2.2.溫度的影響溫度的影響 溫度對熒光強度的影響較敏感。溶液溫度下降溫度對熒光強度的影響較敏感。溶液溫度下降時，

15、介質的粘度增大，熒光物質與分子的碰撞也隨時，介質的粘度增大，熒光物質與分子的碰撞也隨之減少，去活化過程也減少，則熒光強度增加。相之減少，去活化過程也減少，則熒光強度增加。相反，隨著溫度上升，熒光物質與分子的碰撞頻率增反，隨著溫度上升，熒光物質與分子的碰撞頻率增加，使去活化幾率增加，則熒光強度下降。加，使去活化幾率增加，則熒光強度下降。3.3.熒光強度與溶液濃度的關系熒光強度與溶液濃度的關系 在稀溶液中：在稀溶液中： f fkckc f f 為熒光強度為熒光強度 k-k-檢檢測效率（由儀器決定）測效率（由儀器決定） c c 為液體的濃度高濃度時，為液體的濃度高濃度時，熒光物質發生熄滅和自吸收現象

16、，使熒光物質發生熄滅和自吸收現象，使f f與與c c不呈線不呈線性關系性關系4猝滅劑猝滅劑 何為猝滅何為猝滅? ? 由于某些原因使發光材料發生非輻射躍遷，從由于某些原因使發光材料發生非輻射躍遷，從而降低了發光效率的現象叫做猝滅而降低了發光效率的現象叫做猝滅 在熒光物質溶液中在熒光物質溶液中, ,加入某種化合物加入某種化合物, ,使溶液的使溶液的熒光強度顯著降低熒光強度顯著降低, ,這種化合物稱為猝滅劑這種化合物稱為猝滅劑 猝滅作用可能是由于一部分熒光物質分子猝滅作用可能是由于一部分熒光物質分子m m與猝滅與猝滅劑劑q q作用而生成了配合物作用而生成了配合物mq,mq,如配合物如配合物mqmq的形成是