1、dT5, -RACE技術的意義：可以精確定位轉錄起始位點5,-RACE技術的意義:可以精確定位轉錄起始位點。但是定位轉錄起始位點乂 有什么意義呢， 以RNA聚合酶?為例， 啟動子區一般位于轉錄起始位點上游200- 300bp的范圍內，也即轉錄起始位點的確定有助于分析基因的轉錄。 而且有些基因 具有多個轉錄起始位點，通過5 -RACE技術可以精確定位之，進而詳細研究基因 的調控機制。5* -RACE試劑盒一般基于以下兒種技術:SMART、Oligo capping method、self-ligation和anchored PCR。下面將分別介紹這些技術的原理和各自的優缺 點。1、SMART技術

2、。該技術是基于以下兩個觀察發展起來的:冬 不同反轉錄酶包 括MMLV合成的cDNA 3*端保真度不高;b、不同的反轉錄酶具有不同的加尾特性，MMLV特意的在cDNA末端加上3-4個dCTP。該技術用MMLV合成cDA第一鏈，同時 利用它的加尾特性在合成的cDNA鏈3加上3-4個dCTP,而且當帽子結構存在時 該酶的加尾活性最高（對全長分子的富集機制），隨后這3-4個堿基與體系中事先加 入的引物（該引物的3端有3-4個dGTP）配對，MMLV繼而以聚合酶活性將配對引物補成雙鏈。口前基于該技術的試劑盒只有Clontech公司生產，全名為SMARTRACE cDNA amplification ki

3、t(Cat634914)流程見圖:dTStartingmaterialpoly ASecond-strandcDNA synthesisiPCR or primerextensionSMARTPCRadaptor dGFirst-strandeDNA synthesispolv AerrOligo!pri nierwrttid4de-dsequcnicecDNAOA該方法的突出優點就是操作簡便，成功率較高，全場分子的比例較高。cDNA第 一鏈的合成和加尾一步即完成，避免了其他方法中對mRNA和cDM鏈的反復操作， 降低了mRNA降解和合成產物丟失的風險，使本來就含量其微的全長分子得到最大保存，

4、所以這種方法得到了廣泛認可，應用最多。如果加上RNA提取時間，這種技 術可以在3個小時內得到加上接頭的cDA產物，最大限度地降低了mRNA的降解風 險。2、Oligo capping method方法（乂稱RLM-RACE）是山日本東京大學鈴木等人開 發，可以更精確的定位轉錄起始位點。我們知道真核生物的mRNA具有一個3尾 巴和一個5帽子結構，該技術正是利用5端的帽子特性對全長分子進行富集和 擴增。降解的mRNA5,端都有一個磷酸基，用堿性磷酸酶去掉該磷酸基，隨后用煙 草酸性焦磷酸酶去掉帽子結構，則全長分子的5端會暴露出磷酸基，隨后的連接 步驟中錨定引物將特意的加在全長分子的5端而不會和降解的

5、分子連接（全長分 子的富集機制）。LI前基于該方法的試劑盒有TaKaRa（51-Full RACE kitD313)和Ambion(Firstchoice RLM-RACE kit AM1700)兩家都有生產，步驟如圖:Total RNAQIAPkull-Length mllMADegraded n)RMA rFIJA. tMJA arc 13NATAP&PrmqrT RACE inner Prrner7G*SP2 Qgp,該方法的最大優點就是全長分子的比率高，可以說只要是擴增產物就肯定是全長分子。但是該方法的最大缺點是操作復雜，而且都是針對mRNA分子進行操作，S mrC-p-p-p5pHA

6、AA .3Ful LenalhmHWA5*冋任1平創5*=OH-pAAA. .35*AACEAdaptorAAA, 3CDNARandom 9 mens使mRNA分子降解的風險極大提高，所以成功率不是很高。對于新手和實驗室條件 較差者不推薦使用該試劑盒。3、Self-ligation技術。基因特異性（或者0ligodT）反轉錄合成cDA笫一鏈，RNase H降解雜合鏈中的RNA,連接酶連接純化后的cDA鏈，在已知片段上設 計反向PCR引物進行未知片段的擴增。該試劑盒寶生物以前有售，現在已停產，原 理如圖：JUnknown sequenceJFJUnknown sequenceJ：P該試劑盒想法

7、十分好，但是由于沒有全長分子的富集機制，得到全長分子的兒 率比較低。而且在實際使用中它的擴增片段都比較短，不能滿足實驗要求。4、Anchored PCR方法。 利用一條基因特異性反轉錄引物， 在反轉錄酶的作用下合成cDNA第一鏈， 將RNA-DNA雜合鏈中的RNA降解純化后，利用末端轉移酶在cDNA鏈 的3端加入PolyC尾巴（尾巴長度不能確定）T然后利用abridged anchored麟加計primer和一條基因特異性引物擴增(可能需要巢式PCR才能得到結果)。該試劑盒 有Clontech(Marathon cDNA amplification, Cat: 634913)和Invitrogen(5TRACE system for rapid amplification of cDNA ends, Cat: 18374-058)公司在售，操作簡圖如下：J e：、KfMy r: :A：人.*1-14UI V?. Ar：*/*、4 w.rvHB:TlZFS K eg* .! 4 M I y ”asy. pnv rs :sn* i * .MIMS C；該法最大的缺點是全長分子的比率較低，而且操作復雜，整個實驗流程需要耗 費超