1、.緒論一、植物生物技術的概念v 廣義植物生物技術：提高和改良植物產量和品質的所有技術。它主要包括植物組織培養（植物細胞工程）、植物基因工程和分子標記及其輔助育種三大部分。v 狹義的植物生物技術：利用植物器官、組織、細胞以及分子水平上的操作，促進植物繁殖、有用物質生產和品種遺傳改良的技術。3、基因工程改良的目標v 投入特征& 主要是指幫助植物降低成本、提高產量或減少使用防治病蟲害以及雜草的各種費用。研究內容： 抗各種蟲害的危害；抗各種除草劑；抗病毒、細菌、真菌等各種病害；忍耐高溫、低溫、澇害以及高鹽脅迫等各種環境脅迫。v 產出特征 主要是指幫助植物提高品質和增加產量。v 附加特征五、細胞工程的應

2、用細胞工程的應用（1）快速繁殖 細胞工程的應用(2) 脫毒苗的生產細胞工程的應用（3）胚培養細胞工程的應用（4） 單倍體和多倍體的培養細胞工程在育種上的應用（5）原生質體培養與體細胞雜交細胞工程的應用（6） 種質資源的離體保存細胞工程的應用（7）次生代謝物的生產 細胞工程的應用（8）人工種子的生產第一章 植物組織培養實驗室的建設和離體操作技術一植物組織培養的概述（一）植物組織培養的幾個基本概念 植物組織培養（Plant tissue culture） 通過無菌操作，把植物體的器官、組織、細胞甚至原生質體，接種于人工配制的培養基上，在人工控制的環境條件下進行培養，使之生長、繁殖或長出完整植株的技

3、術和方法。用來培養的材料即外植體通常是離體的，所以又叫植物離體培養(plant in vitro culture)。 外植體 ( Explant ) 從活體上切取下來用于培養的那部分組織、器官或細胞。 植物細胞全能性(totipotency)：一個生活細胞具有的產生完整生物個體的潛在能力稱之為細胞的全能性（植物組織培養的理論基礎） 脫分化(dedifferentiation) ：一個成熟細胞轉變為分生狀態的過程。 去分化(redifferentiation) ：離體培養的植物組織和細胞形成的處于脫分化狀態的細胞（愈傷組織），再度分化成另一種或幾種類型的細胞、組織、器官，甚至最終再生成完整植株的

4、過程。（二）植物組織培養的分類 培養方式1 . 根據培養方式 固體培養（Solid culture ） 液體培養（Liquid culture ） 液體培養又有液體懸浮培養與靜置培養之分。 固液培養（Solid- liquid culture ） 看護培養（ Nurse culture ） 飼喂層培養 (Feeder layer culture) 微室培養 (Microchamber culture) 最常用的是固體培養和液體培養，它們相比，各自的優缺點表現為：固體培養 優點：通氣性較好，若有污染，只污染局部 缺點：使培養材料與培養基接觸不充分，有毒物質易積累。 液體培養 優點：有利于培養材料

5、與培養基充分接觸且有毒物質不易積累。缺點：一旦污染，則材料全部污染，且通氣性不好。 2 根據培養過程 初代培養(Primary culture) 從活體植株上切取下來進行的第一次培養。 繼代培養（Subculture） 經過初代培養的材料，轉移到新鮮培養基上進行培養的過程。 3. 根據培養材料(外植體) 組織培養 器官培養 胚胎培養 細胞培養 原生質體培養二、植物組織培養的培養基1. 無機營養(Inorganic element) 根據國際植物生理協會的建議：將植物所需元素的濃度以0.5 mmol/L為標準分為大量元素與微量元素。 2.有機化合物 糖是組培材料必不可少的碳源和能源，此外糖類的添

6、加還有調節培養基的滲透壓的功能。最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖、果糖也是較好的碳源。3。植物生長調節劑生長素與細胞分裂素的比例決定著形態分化的方向。4. 凝固劑、pH和其他成分第二章 植物細胞形態建成一、愈傷組織的誘導1、概念n 愈傷組織:原指植物組織受到傷害后表面形成的保護組織。n 愈傷組織:在組織培養中,是指在培養基上由外植體長出來的一團活躍生長的薄壁細胞。用途：愈傷組織可以通過液體懸浮培養產生單細胞， 也可以在適當的培養條件下再生出完整的植株。2、誘導1）. 外植體的選擇大小要適宜,不宜太小。外植體的組織塊要達到2萬個細胞（5-10mg）以上才容易成活；同一植物不同部位的外植體，其細胞的分化

7、能力、分化條件及分化類型有相當大的差別；通常植物胚與幼齡組織器官比老化組織、器官更容易去分化，產生大量的愈傷組織；不同物種相同部位的外植體其分化能力可能大不一樣。理論上講用于培養的外植體包括根、莖、葉、果實、子房、花粉、花瓣等各種器官或組織。但外植體的選擇一般以幼嫩的組織或器官為宜。2）. 外植體的消毒3）. 愈傷組織誘導過程n 起動期 又稱為誘導期，是愈傷組織形成的起點。這時在外觀上雖然未見明顯變化，但實際上細胞內一些大分子代謝動態已發生明顯的改變，細胞正積極為下一步分裂進行準備。 n 分裂期 外植體切口邊緣開始膨大，外層細胞通過一分為二的方式進行分裂，從而形成一團具有分生組織狀態細胞的過程

8、。這時組織細胞代謝十分活躍，發生了一系列生理生化及形態的變化。n 形成期 是指外植體的細胞經過誘導、分裂形成了具有無序結構的愈傷組織時期。這個時期特征是細胞大小不再發生變化，愈傷組織表層的分裂逐漸減慢和停止，接著內部組織細胞開始分裂，細胞數目進一步增加。4）. 愈傷組織的形態特征 質地不同的愈傷組織之間有時是可以互換的，有時則是不可逆的。 不同類型之間的愈傷組織互換主要通過改變激素濃度的方法來實現。培養基中加入高濃度的生長物質，可使堅實的愈傷組織變為松脆；反之，減少或去除生長物質，則使松脆的愈傷組織轉變為堅實的愈傷組織。二、繼代培養n 愈傷組織培養一段時間后必須轉移到新鮮培養基上以保持培養物的

9、繼續正常生長，更換一次培養基稱為一代繼代培養(subculture) 。 為什么要進行繼代培養？n 培養基中的養分大量消耗；n 培養基中的水分散失；n 瓊脂培養基褐化或發黑(因為植物組織在培養前幾周有時會產生毒素物質，這些物質會擴散進入培養基);n 由于植物材料的原因使培養基pH降低，導致培養基液化；n 生長物已充滿培養瓶，培養物擴繁的需要；三、器官建成 形態建成，又叫形態發生，指有機體生長發育中組織結構和生理功能發生一系列變化，形成或再生成特定結構和器官的過程。 器官建成：又叫器官發生，指培養細胞在適宜的誘導培養條件下產生不定芽和不定根等器官的過程。1. 器官發生在適合的激素濃度和配比以及溫

10、光條件下，愈傷組織細胞會發生生理代謝上的改變，促使細胞分裂部位和方向改變，首先出現分生細胞，經細胞分裂逐漸形成分生細胞團和分生組織，進一步再分化形成維管結節直至分化成芽和根等器官。2. 植株再生的方式 先芽后根 根芽同生 先根后芽3. 影響器官建成的因素影響器官建成的因素1外植體p 物種、種、甚至品種間再生能力是不同的p 同一植株不同器官或同一器官不同部位的外植體，其再生能力不同；p 外植體在原植物體上所達到的發育程度和結構與功能對器官離體再生也有較大差異；p 取材時間（季節）不同再生能力不同；p 外植體的大小對再生也有較大影響。影響器官建成的因素2培養基成分p 植物激素的濃度、比例p 乙烯p

11、 碳源的種類和濃度影響器官建成的因素3培養環境條件p 培養基的物理狀態液固狀態、滲透壓p 培養基的化學性質pHp 光照光照時間、光照強度、光照周期 （連續/間隔）、光質p 溫度四、體細胞胚胎建成n 體細胞胚胎建成：又叫體細胞胚胎發生，指誘導體細胞形成體細胞胚，并進一步再生出完整植株的過程。體細胞胚又叫胚狀體，是組織培養中起源于一個非合子細胞，經過胚胎發生和胚胎發育過程形成的具有雙極性的胚狀結構 。n 從胚狀體的這個概念可以看出：n 胚狀體不同于合子胚，因為它不是兩性細胞融合的產物；n 胚狀體不同于孤雌胚或孤雄胚，因為它不是無融合生殖的產物；n 胚狀體不同于組織培養中通過器官發生途徑形成的莖芽和

12、根，因為它的形成須經歷與合子胚相似的發育過程，而且成熟的胚狀體是一個雙極性結構。1.體細胞胚胎的產生方式n 胚狀體一般來源于單細胞，可以從愈傷組織表面產生，也可以從外植體表面或內部已分化的細胞或懸浮培養的單個細胞產生。2. 體細胞胚的發育n 一個正常胚的發育一般要經過球形、心形、魚雷形和子葉形的胚胎發育時期，最后發育成完整的小植株。但有些植物如柑橘胚培養胚狀體的發育可能缺乏某一形態時期，這種胚狀體有時稱為畸形胚。五、人工種子人工種子：以植物組織培養得到的胚狀體、不定芽、頂芽和腋芽等為材料，經過人工薄膜包裝得到的類似種子的單位。n 胚（胚狀體）：胚狀體、不定芽、頂芽和腋n 人工胚乳的成分：培養基

13、+植物激素+有益微生物+殺蟲劑+除草劑+。n 人工種皮：要求不但能控制種子內水分和營養物質的流失, 而且能通氣和具有機械保護作用。如，藻酸鈉。2. 人工種子的特點n 不受季節限制，可周年生產；n 短期內可以獲得大量材料，可對一些“珍、稀、奇、特”以及基因工程植物進行大量繁殖；n 不會造成性狀改變，方便運輸和儲藏；n 目前，生產成本較高尚不能進行商業化生產。第三章、植物離體快繁技術一、概念植物離體快繁又叫微繁，是指利用植物組織培養技術對外植體進行離體培養，使其短期內獲得遺傳性一致的大量再生植株的方法。 二、離體快繁的一般方法l 無菌培養物的建立1、采樣外植體的選擇原則：外植體類型的選擇，一定程度

14、上是由所要采用的莖芽繁殖方式決定的。外植體的生理狀態對莖芽的反應能力有明顯的影響 選取相對較為幼嫩、生長能力較強的部位的材料2、消毒根據外植體的特點選擇適宜的消毒劑種類、濃度和消毒時間進行外植體的表面消毒。參考第一章外植體的消毒技術。3、接種4、培養l 莖芽的增殖1、原球莖途徑 原球莖：是蘭花的種子發芽過程中特有的一種形態學結構，是縮短的、成珠狀、由胚性細胞組織的類似嫩莖的器官。 在組培中常從莖尖或側芽的培養中產生。2、胚狀體途徑利用體細胞胚狀體來進行無性系的大量繁殖具有極大的潛力。其特點是：繁殖系數高、成苗快、結構完整不存在嵌合現象3、不定芽途徑葉腋和莖尖以外的任何其他地方所形成的芽，由愈傷

15、組織分化出的莖芽也稱為不定芽。4、頂芽和腋芽萌發途徑l 無根苗的生根1、試管內生根方法：把大于1cm的芽苗，接入生根培養基誘導生根。誘導條件：（1）較低的無機鹽濃度 常采用1/2或1/4強度的MS培養基或低無機鹽的White培養基。（2）生長素 加入適量的生長素（較常用的是NAA和IBA） ，可促進根的誘導 。（3）較低的糖濃度 降低糖濃度也有利于根的誘導。（4）一定的光照強度 有研究表明，較強的光照能促進根的發育，并使植株變得堅忍。 絕大多數植物在2-4周內即可生根 .2、試管外生根離體條件下形成的枝條作為微插條進行扦插生根。l 壯苗、煉苗和移栽移栽注意事項: 第一，移栽前必須把附著于小苗根

16、部的培養基清洗干凈，以免由于污染而導致小苗死亡；同時注意避免根頸部損傷引起小苗感染。第二,移栽時介質要疏松通氣，保水但濾水性能好。常用的介質以粗粒狀的蛭石、珍珠巖、草炭、粗沙或將它們以一定的比例混合應用較好。 第三，移栽后保持小苗的水分供需平衡。常采用加覆塑料薄膜或燒杯等措施盡量使植株周圍空氣濕度接近100，使葉面蒸騰減少，同時注意使植株的生活環境保持與周圍空四、離體無性繁殖存在的一些問題 一、物種的局限性 二、無性系變異 三、培養物污染 四、玻璃化玻璃化是植物組織培養中特有的一種生理失調或生理病變。玻璃化苗與正常苗相比，其特點有： 生長速度下降，甚至最后死亡； 植株矮小腫脹，節間很短或幾乎沒

17、有，葉片水漬化，半透明，厚而狹長，皺縮或縱向卷曲，脆弱易碎，葉片缺少角質層，沒有功能性氣孔。 顯微觀察表明，玻璃化苗葉片沒有柵欄組織，僅有海綿組織。 生理生化研究表明，玻璃化苗細胞中含水量高、葉綠素、蛋白質、纖維素和木質素等含量低； 此外，一些酶的活性也發生了變化。 五、褐化褐化是指培養材料向培養基中釋放褐色物質，致使培養基和培養材料逐漸變褐而死亡的現象。是離體繁殖中發生比較普遍的一種現象。 褐化的發生與植物種類和品種、外植體年齡、大小和取材時間等都有一定關系。 培養基的物理狀態及成分、繼代時間及培養環境對褐化的發生也有重要的影響。六、黃化黃化是試管苗整株失綠，全部或部分葉片黃化、斑駁的現象。

18、五、離體無性繁殖的商業化生產植物離體快繁的理論增殖值的計算 Y=mXn Y：代表年理論增殖總數 m：代表外植體個數 X：代表增殖倍數 n：代表年理論增殖周期數第四章、無病毒苗培育五、植物脫毒方法 1. 熱處理原理：病毒和寄主細胞對高溫的忍耐程度不同，選擇適當的溫度和處理時間，可使寄主體內病毒的濃度降低，運行速度減慢或失活，而寄主細胞仍然存活，并加快分裂和生長，從而達到脫毒的目的。不足：不能排除所有病毒，而且處理效果不一。 康乃馨花葉病毒在40 下處理，頂部病毒雖有減少，但基部病毒仍很多。 熱處理對部分球狀病毒（葡萄扇葉病毒、蘋果花葉病毒）或線狀病毒（馬鈴薯X、Y病毒）有效，而對桿狀病毒則不起作

19、用。 2. 莖尖培養原理：病毒在植物體內的分布不均勻，頂端分生組織無病毒或病毒濃度低。 3. 微型嫁接脫毒 4. 胚培養與珠心胚培養 5. 愈傷組織培養原理：愈傷組織是一系列排列疏松的細胞，帶毒植株上取得外植體誘導形成的愈傷組織，并不是每個細胞含病毒。因此，由愈傷組織再生的植株部分不含病毒。 6. 熱處理+莖尖培養六、脫病毒植株的檢測和鑒定 直接觀察法 指示植物鑒定法植物病毒病都有一定的寄主范圍，并在某些寄主植物上表現特定的癥狀，這種能鑒別某種病毒的植物通常稱為指示植物或鑒別寄主。指示植物是指對某種或某幾種病毒及類似病原物或株系有敏感反應，并表現明顯癥狀的植物。（1）指示植物法的意義（2）指示

20、植物的要求指示植物對所指示的病毒類病原物敏感指示植物對所指示的病毒類病原物專一表現癥狀快易于繁殖七、脫毒苗植株的保存和繁殖 保存 脫毒植株并不具有特殊的抗病性，可重新被感染，因此脫毒植株應建防蟲紗網溫室內保存。 繁殖 脫毒植株的繁殖可采用任何離體快繁的方法，但由于通過愈傷組織再生時變異頻率高、不定芽再生時發生嵌合的幾率大，所以多數情況下采用芽生芽的方式。第五章 單倍體和多倍體的培養一、花藥、花粉培養的概念及意義二、花藥培養的方法1、外植體的選擇 外植體的遺傳背景、生理狀態和花粉發育時期。 選擇花粉發育適宜時期（一般是單核中晚期到雙核早期）的花蕾。 鏡檢花粉發育時期，并根據發育時期與花蕾大小、外

21、觀形態和顏色等的相關性，選擇適宜的花蕾。2、材料預處理 取花粉發育適宜的花蕾進行預處理，低溫處理一般在3-5處理3-10d，高溫處理一般在35處理1-3d。為避免花蕾失水，可將花蕾置于內裝有浸濕的濾紙的培養皿中進行處理。 3、材料消毒 消毒方法與其它組織消毒相同。4、接種 盡可能地避免花藥受到損傷；接種速度盡量快；注意接種密度。5、培養 1）基本培養基 因植物不同所用基本培養基不同，MS、N6、B5等。 2）糖濃度和糖的種類 培養基中蔗糖濃度比其它組織培養高，尤其早期培養，一般5%10%。原因是花粉母細胞的滲透壓比花絲等體細胞高，即高濃度的蔗糖不利于藥壁、花絲等體細胞的生長，而利于花粉的生長。

22、 3） 激素 激素種類和濃度對花藥和花粉培養很重要。大多數植物花藥培養的誘導培養用2,4-D 和KT，但有些植物用BA和NAA。一般來說，高濃度2,4-D主要誘導花藥形成愈傷組織，不能形成胚狀體，增加了二倍體細胞發育的機會，所以2,4-D激素水平要相對較低。花藥壁分化程度高，重新分裂需要較高的激素濃度才能啟動。因此，花藥培養激素水平要相對較低才能抑制二倍體細胞的分裂。確定適宜的激素濃度，使花粉細胞分裂的同時又抑制花藥二倍體細胞分裂是成功獲得單倍體的關鍵。 4）培養方式和培養條件 培養方式：固體培養 液體培養 雙層培養 培養條件： 溫度 光照 6、單倍體植株的誘導7、單倍體植株的加倍 秋水仙素誘

23、導加倍三、影響花藥培養的因素1、基因型 不同基因型的培養難易及植株再生有很大差別。 2、供體植株的生理狀態和環境條件 供體植株的年齡和所經歷的環境條件如：光周期、光照強度、溫度等對以后的花粉離體培養有很大影響。一般田間比溫室，幼齡比老齡植株易于培養。3、花粉發育時期 只有發育到某一時期的花粉對離體刺激才最敏感。 因此選擇合適的花粉發育時期的花藥很關鍵，多數植物單核期（單核后期）的花粉培養容易成功。4、預處理 花粉或花藥從植株上取下來直接培養，往往誘導頻率極低，采用低溫、高溫、離心等預處理方法可以促進花粉啟動，提高再生頻率。5、培養基成分 基因型不同，所需培養基種類，蔗糖濃度以及添加激素種類和濃

24、度不同。加入活性炭可提高花粉植株的誘導率。6、花藥壁因子7、培養方式與培養條件五、胚乳培養二、影響胚乳形成愈傷組織的因素：1）胚乳發育時期 發育早期的胚乳，接種不方便，愈傷組織的誘導頻率很低。 處于旺盛生長期的胚乳，離體條件下最易誘導產生愈傷組織。 接近成熟或完全成熟的胚乳，愈傷組織誘導頻率很低。2）培養基（WT、MS、LS植物激素） 對一般植物，生長素細胞分裂素合理搭配，效果更好。 大麥2,4-D、獼猴桃玉米素 棗+任何一種生長素（無特別要求）3）胚在胚乳培養中的作用 旺盛期的未成熟胚乳，在誘導培養基上無需原位胚的參與，就能形成愈傷組織。 完全成熟的胚乳，生理活動很弱，在誘導脫分化前，必須借

25、助于原位胚的萌發，使其活化。可能原因是胚在萌發時產生某種物質“ 胚因子”。外源GA3能部分取代胚因子。4）其他因素 培養基中的蔗糖濃度、光照、pH等。三、胚乳愈傷組織再生植株1、胚狀體途徑2、器官發生途徑第六章 原生質體培養與融合一、原生質體概念以及原生質體研究中的幾個重要成就原生質體（protoplast)：指去除細胞壁的裸露的具有活力的植物細胞。 核質體(nuclearplast) ：由原生質體膜和薄層細胞質形成的小原生質體，也稱為微小原生質體（miniprptoplast）。 胞質體（cytoplast）：不含細胞核而只含部分細胞質的原生質體。二、原生質體分離2、影響原生質體分離的因素外

26、植體來源 生長旺盛、生命力強的組織和細胞是獲得高活力原生質體的關鍵，并影響著原生質體的復壁、分裂、愈傷組織形成乃至植株再生。 用于原生質體分離的植物外植體有葉片、葉柄、莖尖、根、子葉、莖段、胚、原球莖、花瓣、葉表皮、愈傷組織和懸浮培養物等。 前處理p 進行表面消毒，除非材料來源于無菌條件。p 為了保證酶液充分進入組織， 可撕去葉片下表皮，如果葉片的下表皮撕不掉或很難撕掉，可把葉片切成小塊，如果是其他組織可直接切成小塊。為了促進酶液的滲入也可結合真空抽濾。p 此外，高滲處理、激素處理、低溫處理、激素處理與低溫處理結合等方法。 分離培養基分離植物原生質體的酶液主要由分離培養基、酶和滲透壓穩定劑組成

27、。 常用的分離培養基主要是CPW鹽溶液，也有用鈣(CaCl22H2O)和磷(KH2PO4)鹽組成的溶液或1/2MS鹽溶液等。酶的種類和濃度 常用的酶有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和離析酶，酶解花粉母細胞和四分體小孢子時還要加入蝸牛酶。 酶的水平應根據不同植物材料而有所變化。常用的纖維素酶濃度是1%3%，果膠酶為0.1%0.5%，離析酶為0.5%1%，半纖維素酶為0.2%0.5%。 滲透壓穩定劑酶液中滲透壓對平衡細胞內的滲透壓、維持原生質體的完整性和活力有很重要的作用。一般來說，酶液、洗滌液和培養液中的滲透壓應高于原生質體內的滲透壓；較高的滲透壓可防止原生質體破裂或出芽，但同時也使原生質體收縮并

28、阻礙原生質體再生細胞分裂。酶解條件和時間 酶解時間視材料而定，范圍為2-8h，一般不超過24h。 酶解的溫度一般為23-32； 酶解的pH值因使用酶的不同而不一樣，一般在5.65.8，過高或過低均不適于原生質體分離。 四、原生質體融合（一）、概念 原生質體融合(protoplast fusion)，是指不同親本的原生質體不經過有性階段，在一定條件下融合創造雜種的過程。 表示方法：“a(+)b”，其中a和b是兩個融合親本，(+)表示體細胞雜交。 幾種表述方式 細胞融合(cell fusion) 體細胞雜交(somatic hybridization) 超性雜交(parasexual hybrid

29、ization) 超性融合(parasexual fusion)（二）、原生質體融合的方法1、自發融合 2、誘發融合 (三）、原生質體融合的方式 對稱融合 非對稱融合 配子-體細胞融合 亞原生質體-原生質體融合(四)、體細胞雜種的篩選與鑒定3、雜種植株的鑒定 形態鑒定：根據雙親的形態學性狀觀察進行鑒定。 細胞學鑒定：細胞器鑒定、染色體鑒定、染色體原位雜交。 生化鑒定：同功酶鑒定。 分子鑒定：RFLP、RAPD、SSR等分子標記鑒定(五)、體細胞雜種的核質遺傳概念 核遺傳：雙親之和，少數有重組和丟失。 線粒體遺傳：往往有重組，柑橘上例外，僅來自愈傷組織親本。 葉綠體遺傳：隨機分離，也有共存現象。

30、第七章 植物遺傳轉化一、 植物基因工程的研究現狀1.植物基因工程的概念 植物基因工程是以植物為受體的一種基因操作，即以分子生物學為理論基礎，采用基因克隆、遺傳轉化，以及細胞、組織培養技術將外源基因轉移并整合到受體植物的基因組中，并使其在后代植株中得以正確表達和穩定遺傳，從而使受體獲得新性狀的技術體系。5. 植物遺傳轉化的分類遺傳轉化根據是否需要載體分為非載體介導的遺傳轉化和生物載體介導的遺傳轉化。 二、 植物基因工程載體的種類載體（vector）是將外源基因送入受體細胞的工具。目前所用的載體有細菌的質粒、噬菌體或病毒，但更多使用的是改造過的載體。 1.質粒載體質粒載體:質粒是細菌染色體外存在的

31、一種能夠自我復制的雙鏈閉合環狀DNA分子，其大小從1kb到200kb不等。可以自我復制和傳代。各種不同類型的Ti質粒都具有T-DNA區、毒性區、質粒復制起點、質粒結合轉移位點和冠癭堿分解位點。其中以T-DNA區和毒性區在植物轉化中最為重要。2. 病毒載體目前，以植物病毒作為植物基因工程的克隆載體有很多，如花椰菜花葉病毒、煙草花葉病毒、馬鈴薯X病毒等等。3.整合載體三、受體材料的選擇 受體是指用于接受外源DNA的轉化材料。 良好的植物基因轉化受體系統應滿足如下條件：p 1、高效穩定的再生能力；p 2、受體材料要有較高的遺傳穩定性；p 3、外植體來源方便，如胚和其它器官等；p 4、對篩選劑敏感；p

32、 5、轉化率高1.愈傷組織再生系統外植體材料經過脫分化培養誘導形成愈傷組織，轉化（帶有目的基因質粒的農桿菌侵染），分化培養獲得再生植株。2.直接分化再生系統 外植體材料細胞不經過脫分化形成愈傷組織階段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。3、原生質體再生系統 原生質體恢復細胞壁具有分化再生能力，是應用最早的再生受體系統之一。4.胚狀體再生系統 是指具有胚胎性質的個體。5.生殖細胞受體系統 以生殖細胞如花粉粒、卵細胞等受體細胞進行外源基因轉化的系統。三、 植物遺傳轉化技術和方法一）、根癌農桿菌介導的植物轉基因 3. 影響農桿菌介導的遺傳轉化效率的因素A、農桿菌菌株 不同的農桿菌菌株有不同的宿主范圍

33、，并有其特異侵染的最適宿主。不同類型的農桿菌菌株的毒力（侵染力）不同。 一般而言，三類農桿菌菌株的侵染力的排列順序為：農桿堿型（琥珀堿型）菌株（如A281）胭脂堿型菌株（C58）章魚堿型菌株（Ach5，LBA4404）。B、農桿菌菌株的生長時期 高侵染活力的菌株一般處在對數生長期，也即0.31.8 OD600范圍。一般用0.31.0 OD600農桿菌菌液接種植物材料。1.0 OD1x109 cell/ml。C 、基因活化的誘導物 Vir 區基因的活化是農桿菌Ti質粒轉移的先決條件。酚類化合物、單糖或糖酸、氨基酸、磷酸饑餓和低pH都影響Vir區基因的活化。在操作過程中，最常用的誘導物是乙酰丁香酮（AS）和羥基乙酰丁香酮（HO-AS），但AS效果更佳。D、外植體的類型和生理狀態 細胞具有分裂能力是轉化的基本條件。一般來說，發育早期（幼年期）的組織細胞轉化能力較強 。E、外植體的預培養 外植體的預培養有以下作用：促進細胞分裂，使受體細胞