1、Trizol法提RNA試劑及材料：Trizol（3號冰箱 4 3層）、三氯甲烷、異丙醇（以上二者在有機廚）、75%乙醇（按DEPC水:無水乙醇=1：3配制）、DEPC水（以上二者在3號冰箱203層）、肺動脈平滑肌細胞儀 器：4離心機、移液槍、Nano drip 2000(微量紫外分光光度儀)、1.5mlEP管、200l EP管、EP管插板、冰盒準備： 1、配制DEPC水：取一個500ml藍蓋瓶，用去離子水洗滌，加入超純水500ml,想瓶中加入DEPC母液0.5ml,震蕩搖勻，在通風廚內常溫過夜，滅活RNA酶，第二天將瓶子蓋擰松，高溫高壓消毒滅菌（121，30min）,消毒后分裝在1.5mlEP

2、管中，4保存。2、新鮮標本的保存（備用于RNA提取）：取新鮮標本，先放入液氮中，然后凍存于-80。3、動物組織提RNA前處理：用PBS沖洗干凈后，按50-100mg加入1ml Trizol，用電動勻漿器或者一次性研磨杵充分勻漿，最好在冰上進行。注：均質50-100 毫克組織樣本需要 1 毫升的TRIzol 試劑，使用特富龍玻璃或強力均質機 （Polytron, or Tekmars TISSUMIZER TISSUMIZER 或相當的儀器）。均質時樣本體積不應超過TRIzol 試劑體積的10。 b. 單層細胞 直接在培養皿中裂解細胞，3.5 厘米直徑的皿中加入TRIzol 試劑1 毫升，并通過

3、抽吸幾次促進細胞裂解。TRIzol 試劑的添加量基于培養的面積而不是細胞的數目（每10 平方厘米加入1 毫升）。TRIzol 試劑量不足可能會導致分離出的RNA 有DNA 的污染。 步 驟：1. 將處理完的35mm細胞皿從細胞培養箱中取出，用預冷的 PBS 清洗 1-2 次，迅速加入 已經預冷的Trizol液1ml，室溫孵5分鐘。2.收集標本懸浮于1.5ml EP管內，加入200ul三氯甲烷，用手上下震蕩15秒，使之充分混勻成乳狀，室溫孵育3分鐘。3.標本12000rpm，4離心15分鐘（離心機提前預冷），然后小心取出離心管，置于冰上（注意：避免搖晃）。4.用槍頭慢慢吸取上清液（盡可能多吸，但

4、避免吸到中間白色蛋白層），置于一新EP管中。5.向管中加入0.5ml異丙醇，混勻，室溫孵育10分鐘。6.標本再置于離心機內，12000rpm ，4離心10分鐘。7.棄上清，加入事先配好的75%乙醇1ml（用DEPC水和100%乙醇配制），震蕩，7500rpm 4離心5分鐘。8.倒掉上層乙醇，并保持離心管于倒置狀態固定于離心管架上，待酒精揮發干（干燥5-10min即可）。若管壁殘留酒精較多，可用槍頭吸干，但避免吸到RNA沉淀。9.加入20ulDEPC水，槍尖置于液面下吹打3次，混勻。室溫放置5-10分鐘，溶解RNA。10.置于冰上，吸取1ul RNA樣本用紫外核酸蛋白分析儀（14樓）測RNA濃度

5、。評價標準：260/280接近2，不低于1.8才可用。測RNA濃度步驟：準備一管DEPC水（空白對照）；a、連接nanodrip2000,打開電腦桌面軟件b、nuclide-TYPE選擇RNA-加1-2ul水- 點擊Blank來進行空白對照檢測并保存參比圖譜，雖然不需要在每個樣品之間進行空白校準，但我們建議在檢測多個樣品時，最好每30min進行一次空白校準。30min后，最后一次做空白檢測的時間將顯示在軟件下面的狀態欄上。c、用無塵紙擦干上下基座上的樣品后，再加1-2ul水-點擊measure，結果應該是差不多為一水平線，吸光值變化應不超過0.04A（10mm光程），顯示濃度在+0.5以內。d

6、 、用無塵紙擦干上下基座上的樣品后，再加入待測RNA溶液1ul，讀數。11.80保存或供逆轉錄用即可。RNA逆轉錄合成cDNA試劑：TakaRa試劑盒（#AK5301）儀器：PCR儀步驟：1.計算RNA需要量：反應體系中所需RNA的量為1000ng，體系為20ul(10ul+10ul)。用200ulEP管，加入RNA的體積為V=1000ng/RNA濃度。剩余體積用無RNA酶的水（試劑盒內有）定容至10ul。樣本 RNA體積 RNA酶Fee H2O1 3.33 6.672 5.53 4.473 5.64 4.36NC 5.47 4.53681 2.62 7.382.配制反應試劑混合液（Takara試劑盒，2號冰箱，20，一層）。RAN Fee H2O 3 185X Prim Buffer 4 24（最后再加）Prim RT Enzyme 1 6Rando引物 1 6Oligo引物 1 6總體積 10 60 （總共配的份數要比需要的多2個體系，原因：有損耗）3.吸取10ul反應混合物加至每管（每管10ul反應試劑混合物+10ulRNA液），混勻后置于冰上，14樓行逆轉錄。（1）37 15分鐘（反應時間）（2）85 5秒鐘（逆轉錄酶失活）（3）4 保存（相當于4冰箱）操作