1、第五章第五章 酶與細胞定化酶與細胞定化 固定化酶（固定化酶（immobilized enzyme）是）是20世紀世紀60年代年代發展起來的一項新技術。以往使用的酶絕大多數是水溶性發展起來的一項新技術。以往使用的酶絕大多數是水溶性的酶。這些水溶性酶催化結束后，極難回收，因而阻礙了的酶。這些水溶性酶催化結束后，極難回收，因而阻礙了酶工業的進一步發展。酶工業的進一步發展。60年代后，在酶學研究領域內涌現年代后，在酶學研究領域內涌現出固定化酶。它是出固定化酶。它是通過物理的或化學的手段，將酶束縛于通過物理的或化學的手段，將酶束縛于水不溶的載體上，或將酶束縛在一定的空間內，限制酶分水不溶的載體上，或將酶

2、束縛在一定的空間內，限制酶分子的自由流動，但能使酶充分發揮催化作用子的自由流動，但能使酶充分發揮催化作用。過去曾稱其。過去曾稱其為水不溶酶或固相酶。為水不溶酶或固相酶。1971年第二屆國際酶工程會上正式年第二屆國際酶工程會上正式建議采用固定化酶的名稱。建議采用固定化酶的名稱。 從從60年代起，固定化酶的研究發展很快，起初人們把注年代起，固定化酶的研究發展很快，起初人們把注意力集中在酶的固定化方法研究上，近年來，不但固定化意力集中在酶的固定化方法研究上，近年來，不但固定化方法和載體開發有了長足發展，而且已轉向它在工業、醫方法和載體開發有了長足發展，而且已轉向它在工業、醫學、化學分析、親和層析、環

3、境保護、能源開發以及理論學、化學分析、親和層析、環境保護、能源開發以及理論研究等方面的應用研究。研究等方面的應用研究。第一節第一節 酶和菌體固定化酶和菌體固定化 一、固定化酶與固定化細胞的優缺點一、固定化酶與固定化細胞的優缺點 1.固定化酶的優點： （1）極易將固定化酶與底物、產物分開；產物溶液）極易將固定化酶與底物、產物分開；產物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝。中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝。 (2) 可以在較長時間內反復使用，有利于工藝的連可以在較長時間內反復使用，有利于工藝的連續化、管道化。續化、管道化。 （3）酶反應過程可以嚴格控制，有利于工藝自動化）酶反應過程可以嚴格控制，有利于

4、工藝自動化和微電腦化。和微電腦化。 （4）在絕大多數情況下提高了酶的穩定性。）在絕大多數情況下提高了酶的穩定性。 （5）較能適應于多酶反應。）較能適應于多酶反應。 （6）酶的使用效率提高，產物得率提高，產品質量）酶的使用效率提高，產物得率提高，產品質量有保障，成本低。有保障，成本低。 2.固定化酶的缺點固定化酶的缺點:（1）酶固定化時酶的活力有所損失。同時也）酶固定化時酶的活力有所損失。同時也增加了固定化的成本，使工廠開始投資大。增加了固定化的成本，使工廠開始投資大。（2）比較適應水溶性底物和小分子底物。）比較適應水溶性底物和小分子底物。（3）與完整細胞比較，不適于多酶反應，特）與完整細胞比較

5、，不適于多酶反應，特別是需要輔因子的反應，同時對胞內酶需經分別是需要輔因子的反應，同時對胞內酶需經分離后，才能固定化。離后，才能固定化。 3固定化細胞的優點固定化細胞的優點 (1)省去了酶的分離手續，為多酶系統，無須輔因子再生。省去了酶的分離手續，為多酶系統，無須輔因子再生。 (2)細胞生長快、而且多、反應快。細胞生長快、而且多、反應快。 (3) 可以連續發酵，節約了成本，而且在蒸餾和提取前不可以連續發酵，節約了成本，而且在蒸餾和提取前不用分離去細胞，能一邊排出發酵液，一邊進行培養，排除了用分離去細胞，能一邊排出發酵液，一邊進行培養，排除了產物抑制和消耗。產物抑制和消耗。 (4) 保持酶在細胞

6、內的原始狀況，增加了酶的穩定，特別保持酶在細胞內的原始狀況，增加了酶的穩定，特別是對污染因子的抵抗力增加。是對污染因子的抵抗力增加。 4.固定化細胞的缺點：（1）必須保持菌體的完整，防止菌體自溶，否則，將影響產品純度。（2）必須防止細胞內蛋白酶對所需酶的分解，同時，需抑制胞內其他酶的活性，以阻止副產物的形成。（3）細胞膜、壁會阻礙底物滲透和擴散。 二、酶的固定化方法二、酶的固定化方法酶的固定化方法有：1.吸附法2.共價鍵結合法3.交聯法4.包埋法 （圖5-1）。 1.吸附法吸附法吸附法分為吸附法分為物理吸附法物理吸附法和和離于交換吸附法離于交換吸附法（1）物理吸附法）物理吸附法 通過氫鍵、疏水

7、作用和通過氫鍵、疏水作用和電子親電子親和力等物理作用，將酶固定于水不溶載體上。從而和力等物理作用，將酶固定于水不溶載體上。從而制成固定化酶。制成固定化酶。常用的載體有：常用的載體有： （1）有機載體）有機載體 纖維素、骨膠原、火棉膠及面筋、淀粉等纖維素、骨膠原、火棉膠及面筋、淀粉等 （2）無機載體）無機載體 氧化鉛、皂土、白土、高嶺土、多孔玻璃、二氧化鈦等。氧化鉛、皂土、白土、高嶺土、多孔玻璃、二氧化鈦等。 2離子交換吸附法離子交換吸附法 這是將酶與含有離子交換基這是將酶與含有離子交換基的水不溶載體相結合而達到固定化的一種方法。酶的水不溶載體相結合而達到固定化的一種方法。酶吸附較牢，在工業上頗

8、具廣泛的用途。常用的載體吸附較牢，在工業上頗具廣泛的用途。常用的載體有陰離子交換劑，如二乙基氨基乙基（有陰離子交換劑，如二乙基氨基乙基（deaedeae）- -纖纖維素、混合胺類（維素、混合胺類（ectedlaectedla）- -纖維素、四乙氨基乙纖維素、四乙氨基乙基（基（teaeteae）- -纖維素、纖維素、deae-deae-葡聚糖凝膠、葡聚糖凝膠、amberlite ira-93amberlite ira-93、410410、900900等。陽離子交換劑等。陽離子交換劑基，如羧甲基（基，如羧甲基（cmcm）- -纖維素、纖維素檸檬酸鹽、纖維素、纖維素檸檬酸鹽、amberlite cg

9、50amberlite cg50、irc-50irc-50、ir-200ir-200、dowex-50dowex-50等。等。 包埋法是將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚包埋法是將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合助進劑（包括交聯劑）的作用進行聚合，酶被包埋在合助進劑（包括交聯劑）的作用進行聚合，酶被包埋在聚合物中以達到固定化聚合物中以達到固定化。包埋法操作簡單，由于酶分子。包埋法操作簡單，由于酶分子只被包埋，未受到化學反應，可以制得較高活力的固定只被包埋，未受到化學反應，可以制得較高活力的固定化酶，對大多數酶、粗酶制劑甚至完整的微生物細胞都化酶，對大多數酶、粗酶制劑甚至完整的微生物細

10、胞都是適用的。但是，只有小分子底物和產物可以通過凝膠是適用的。但是，只有小分子底物和產物可以通過凝膠網絡，而對大分子底物不適宜。同時，凝膠網絡對物質網絡，而對大分子底物不適宜。同時，凝膠網絡對物質擴散的阻力導致固定化酶動力學行為的變化、活力降低。擴散的阻力導致固定化酶動力學行為的變化、活力降低。四、包埋法四、包埋法1.凝膠包埋法 凝膠包埋法是將酶分子包埋在凝膠格子中。 n（1）聚丙烯酰胺凝膠包埋法 n（2）輻射包埋法 n（3）其他凝膠包埋法 2微囊化法 此法是將酶包埋于具有半透性聚合物膜的微此法是將酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊內。它使酶存在于類似細胞內的環境中，可囊內。它使酶存在于類似細胞

11、內的環境中，可以防止酶的脫落，防止微囊外環境直接接觸，以防止酶的脫落，防止微囊外環境直接接觸，從而增加了酶的穩定性，同時，小分子底物能從而增加了酶的穩定性，同時，小分子底物能通過膜與酶作用，產物經擴散而輸出。通過膜與酶作用，產物經擴散而輸出。微膠囊微膠囊的制備方法有的制備方法有5種。種。微膠囊的制備方法：微膠囊的制備方法：（1）界面沉淀法（2）界面聚合法（3）液體干燥法（4）紅血球包埋法（5）脂質體包埋法五、共價鍵結臺法五、共價鍵結臺法 共價鍵結合法 是酶蛋白的側鏈基團和載體表面上的功能基團之間形成共價鍵而固定的方法。優點：酶與載體結合牢固，酶不易脫落，但反應條件較激烈，酶易失活，同時，制作手

12、續亦較繁瑣。 （一）酶分子和載體連接的功能基團 從理論上講，酶蛋白上可供載體結合的功能基團有以下幾種： （1）酶蛋白n-端的a-氨基或賴氨酸殘基的-氨基。 （2）酶蛋白c-端的羧基以及asp殘基的-羧基和glu殘基-羧基。 （3）cys殘基的巰基。 （4）ser、tyr、thr殘基的羥基。 （5）phe和tyr殘基的苯環。 （6）his殘基的咪唑基。 （7）trp殘基的吲哚基。 （二）載體的選擇（二）載體的選擇 載體直接關系到固定化酶的性質和形成。對載體的一般要求是： （l）一般親水載體在蛋白質結合量和固定化酶活力及其穩定性上都優于疏水載體。 （2）載體結構疏松，表面積大，有一定的機械強度。

13、（3）載體必須帶有在溫和條件與酶共價結合的功能基團。 （4）載體沒有或很少有非專一性吸附。 （5）載體來源容易，便宜，并能反復使用。 第二節第二節 微生物，植物和動物細胞的固定化微生物，植物和動物細胞的固定化n 菌體細胞的固定化方法基本上沿用酶固定化方法，主要有菌體細胞的固定化方法基本上沿用酶固定化方法，主要有包埋包埋法法、吸附法吸附法和和不用載體法不用載體法等。等。n 一、包理法一、包理法n 包埋法包埋法是制備固定化細胞最常用的方法。將產酶菌株用包是制備固定化細胞最常用的方法。將產酶菌株用包埋劑如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、瓊脂、海藻酸、卡埋劑如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、瓊脂、海藻酸、卡拉

14、膠、二和三醋酸纖維、膠原、明膠和戊二醛等包埋起來，拉膠、二和三醋酸纖維、膠原、明膠和戊二醛等包埋起來，發揮酶或酶系的作用。發揮酶或酶系的作用。19771977年我國投人生產的固定化青霉年我國投人生產的固定化青霉素酰胺酶，是使用明膠、戊二醛包埋大腸桿菌而成。美國、素酰胺酶，是使用明膠、戊二醛包埋大腸桿菌而成。美國、歐洲和日本等大規模生產高果糖漿的工藝多數采用固定化歐洲和日本等大規模生產高果糖漿的工藝多數采用固定化菌體的酶柱工藝。包埋法制備固定化細胞與其制備固定化菌體的酶柱工藝。包埋法制備固定化細胞與其制備固定化酶大體相似酶大體相似 。n包埋法：n1聚丙烯酰胺凝膠包埋法 n2瓊脂凝膠包埋法n3海藻

15、酸包埋 法n4卡拉膠包埋法 n5明膠包埋法 二、吸附法二、吸附法n吸附法：n1.物理吸附法 將微生物細胞附著個固體載體上的一種固定方法。n2.離子交換吸附法 利用離子交換吸附細胞常用的載體是離子交換樹脂。 n 三、不用載體法三、不用載體法n這是選擇適當的條件，通過一定處理使酶固定在細胞這是選擇適當的條件，通過一定處理使酶固定在細胞內的一種方法。如葡萄糖異構酶是一種胞內酶，將生內的一種方法。如葡萄糖異構酶是一種胞內酶，將生物細胞加熱至物細胞加熱至6060，10min10min，其他酶失活，則該酶被固，其他酶失活，則該酶被固定在細胞內，所以又稱加熱固定化。又如鏈霉菌細胞定在細胞內，所以又稱加熱固定

16、化。又如鏈霉菌細胞用檸檬酸處理使酶固定在細胞內，若再用殼聚糖處理，用檸檬酸處理使酶固定在細胞內，若再用殼聚糖處理，使之凝聚后干燥即成固定化細胞。使之凝聚后干燥即成固定化細胞。 n二、植物細胞固定化n 植物細胞比菌體細胞嬌嫩得多，需要溫和的固定化方法。植物細胞比菌體細胞嬌嫩得多，需要溫和的固定化方法。80年代年代開始研究，目前，一般采用開始研究，目前，一般采用吸附法吸附法和和包埋法包埋法 n1.吸附法 吸附法是將植物細胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂縫內，或吸附于中空纖維外壁上。如將植物細胞定置在中空纖維的外壁與容器內壁之間，培養液及o2在中空纖維管內流動，透過中空纖維管壁（具半透膜性），傳遞給附著于

17、外壁的細胞，細胞代謝產物亦透過外壁隨管內培養液流出。利用此法固定的豌豆細胞和胡蘿卜細胞進行生產多酚化合物的研究，可連續使用1個多月。又如將洗凈、滅菌后的泡沫塑料放進辣椒細胞培養液中，振蕩培養一段時間，細胞吸附于塑料孔洞內，并能生長繁殖。n2包埋法 包埋法是將植物細胞包埋于瓊脂、海藻酸鈣、聚丙烯酰胺、明膠和角叉萊膠等多孔凝膠中。bredelius等(1979）首次用海藻酸鈣包埋制備了固定化長春花細胞。毛地黃細胞、海巴朝細胞。三、動物細胞固定化三、動物細胞固定化 動物細胞比菌體細胞、植物細胞更嬌嫩，需要最溫和動物細胞比菌體細胞、植物細胞更嬌嫩，需要最溫和的固定化方法。因前，動物細胞固定的方法有吸附

18、法的固定化方法。因前，動物細胞固定的方法有吸附法和包埋法兩種，其中吸附法用的最多。和包埋法兩種，其中吸附法用的最多。 1吸附法 由于大多數動物細胞屬于附著細胞，它們在培養過程中趨向于附著固體表面。因此，吸附法特別適合于制備固定化動物細胞。 主要載體及固定方法有：主要載體及固定方法有： (1)轉瓶法 (2)微載體法 (3)中空纖維法包埋法包埋法 包埋法根據載體與方法不同：包埋法根據載體與方法不同： 1.凝膠包埋法 2.半透膜包埋法第三節 原生質的固定化n 如前所述，固定化細胞可以取代游離細胞進行發酵，如前所述，固定化細胞可以取代游離細胞進行發酵，生產種有用物質，并具有許多顯著的優點。然而固定生產

19、種有用物質，并具有許多顯著的優點。然而固定化細胞也有其缺點，例如，固定化細胞只能用于生產化細胞也有其缺點，例如，固定化細胞只能用于生產胞外酶和其他能夠分泌到細胞外的產物；而且由于載胞外酶和其他能夠分泌到細胞外的產物；而且由于載體的影響，使營養物質和產物的擴散受到一定的限制；體的影響，使營養物質和產物的擴散受到一定的限制；尤其是在好氣性發酵中，溶解氧的傳遞和輸送成為關尤其是在好氣性發酵中，溶解氧的傳遞和輸送成為關鍵性的限制因素。為探討解決這些問題的方法，很多鍵性的限制因素。為探討解決這些問題的方法，很多人從不同的角度進行研究。人從不同的角度進行研究。n 細胞產生的許多代謝產物之所以不能分泌到胞外

20、,原因是多方面的,其中細胞壁對物質擴散的障礙是其原因之一。因此,若能夠去除微生物細胞和植物細胞的細胞壁,就有可能增加細胞膜的透過性,從而使較多的胞內物質分泌到細胞外。一、原生質體的制備n要進行原生質體固定化要進行原生質體固定化,必須將微生物細胞和植物細胞的細胞壁必須將微生物細胞和植物細胞的細胞壁破壞而分離出原生質體。同時要在破壞細胞壁的時候破壞而分離出原生質體。同時要在破壞細胞壁的時候,不能影響到不能影響到細胞膜的完整性，更不能使細胞內部的結構受到破壞細胞膜的完整性，更不能使細胞內部的結構受到破壞,為此只能使為此只能使用對細胞壁有專一性作用的酶。用對細胞壁有專一性作用的酶。n不同種類的細胞不同

21、種類的細胞,由于各自細胞壁的組成、結構和性質不同，由于各自細胞壁的組成、結構和性質不同，原生質體的制備方法也不一樣。一般說來，原生質體的制備過程原生質體的制備方法也不一樣。一般說來，原生質體的制備過程是首先將對數生長期的細胞收集起來是首先將對數生長期的細胞收集起來,懸浮在含有滲透壓穩定劑的懸浮在含有滲透壓穩定劑的高滲緩沖液中。然后加人適宜的細胞壁水解酶，在一定的條件下高滲緩沖液中。然后加人適宜的細胞壁水解酶，在一定的條件下作用一段時間，使細胞壁破壞。分離除去細胞壁碎片，未作用的作用一段時間，使細胞壁破壞。分離除去細胞壁碎片，未作用的細胞以及細胞壁水解酶，而得到原生質體。細胞以及細胞壁水解酶，而

22、得到原生質體。二、原生質體固定化n 原生質體制備好后，把離心收集到的原生原生質體制備好后，把離心收集到的原生質體重新懸浮在含有滲透壓穩定劑的緩沖液中，質體重新懸浮在含有滲透壓穩定劑的緩沖液中，配成一定濃度的原生質體懸浮液。然后采用包配成一定濃度的原生質體懸浮液。然后采用包埋法制成固定化原生質體。埋法制成固定化原生質體。n原生質體固定化一般采用凝膠包埋法。常原生質體固定化一般采用凝膠包埋法。常用的凝膠有用的凝膠有: :瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠和光交聯樹脂等。現舉例說明如下菜膠和光交聯樹脂等。現舉例說明如下: : 1.瓊脂-多孔醋酸纖維素固定化法 用生理鹽水配制

23、用生理鹽水配制3%3%4%4%的瓊脂，加熱的瓊脂，加熱溶解滅菌后，至溶解滅菌后，至5050左右，與等體積的左右，與等體積的一定濃度的原生質體懸浮液混合將混合一定濃度的原生質體懸浮液混合將混合液用滴管滴到一定形狀的多孔醋酸纖維液用滴管滴到一定形狀的多孔醋酸纖維素上素上, ,置于冰箱或冰盒中冷卻凝固，制成置于冰箱或冰盒中冷卻凝固，制成固定化原生質體。固定化原生質體。 2.海藻酸鈣凝膠固定化法 用含有滲透壓穩定劑的緩沖溶液配用含有滲透壓穩定劑的緩沖溶液配制一定濃度的制一定濃度的(3%(3%6%)6%)海藻酸鈉溶液海藻酸鈉溶液, ,與與等體積的一定濃度的原生質體懸浮液混等體積的一定濃度的原生質體懸浮液

24、混合均勻合均勻, ,將此混懸液用滴管或注射器滴到將此混懸液用滴管或注射器滴到一定濃度的氯化鈣溶液中一定濃度的氯化鈣溶液中, ,浸泡浸泡1 12h,2h,制制成直徑為成直徑為1 14mm4mm的球狀固定化原生質體。的球狀固定化原生質體。 3.角叉菜膠固定化法 用含有滲透壓穩定劑的緩沖溶液配用含有滲透壓穩定劑的緩沖溶液配制一定濃度制一定濃度(3%(3%8%)8%)的角叉菜膠的角叉菜膠, ,加熱溶加熱溶解解, ,滅菌后滅菌后, ,冷卻至冷卻至5050左右左右, ,與等體積的與等體積的原生質體懸浮液混合均勻原生質體懸浮液混合均勻, ,將混懸液滴到將混懸液滴到一定濃度的預冷的氯化鉀溶液中一定濃度的預冷的

25、氯化鉀溶液中, ,制成球制成球狀固定化原生質體。狀固定化原生質體。 4.光交聯樹脂固定化法 用含有滲透壓穩定劑的緩沖溶液配制用含有滲透壓穩定劑的緩沖溶液配制30%30%60%60%濃度的光交聯樹脂預聚體濃度的光交聯樹脂預聚體, ,加熱溶解加熱溶解后后, ,在在5050左右左右, ,加人加人1%1%光敏劑光敏劑, ,與等體積的原與等體積的原生質體懸浮液混合均勻生質體懸浮液混合均勻, ,攤成薄層攤成薄層, ,經紫外光照經紫外光照射射2 23mm,3mm,聚合后切成一定形狀的小塊聚合后切成一定形狀的小塊, ,制成片制成片狀固定化原生質體。狀固定化原生質體。 此外也可選用其他適宜的凝膠或中空纖維為載此

26、外也可選用其他適宜的凝膠或中空纖維為載體，制備固定化原生質體。體，制備固定化原生質體。三、固定化原生質體的應用三、固定化原生質體的應用 固定化原生質體一方面保持了細胞原有的固定化原生質體一方面保持了細胞原有的新陳代謝特性，可以照常產生原來在細胞內產新陳代謝特性，可以照常產生原來在細胞內產生的各種代謝產物，另一方面又去除了細胞壁生的各種代謝產物，另一方面又去除了細胞壁這一擴散屏障，有利于胞內產物不斷地分泌到這一擴散屏障，有利于胞內產物不斷地分泌到胞外，這樣就可以不經過細胞破碎和提取工藝胞外，這樣就可以不經過細胞破碎和提取工藝而在發酵液中獲得所需的發產物而在發酵液中獲得所需的發產物,為胞內物質為胞

27、內物質的工業化生產開辟了新途徑。的工業化生產開辟了新途徑。 固定化原生質體具有下列特點固定化原生質體具有下列特點: : (1)(1)固定化原生質體由于解除了細胞壁這一擴散固定化原生質體由于解除了細胞壁這一擴散屏障屏障, ,可增加細胞膜的通透性可增加細胞膜的通透性, ,有利于氧氣和營養物質有利于氧氣和營養物質的傳遞和吸收的傳遞和吸收, ,也有利于胞內物質的分泌也有利于胞內物質的分泌, ,可顯著提高可顯著提高產率。產率。 (2)(2)固定化原生質體由于有載體的保護作用固定化原生質體由于有載體的保護作用, ,具有具有較好的操作穩定性和保存穩定性較好的操作穩定性和保存穩定性, ,可反復使用或連續可反復

28、使用或連續使用較長的時間使用較長的時間, ,利于連續化生產。在冰箱保存較長利于連續化生產。在冰箱保存較長時間后仍能保持其生產能力。時間后仍能保持其生產能力。 (3)(3)固定化原生質體易于和發酵產物分開固定化原生質體易于和發酵產物分開, ,有利于產物的分離純化有利于產物的分離純化, ,提高產品質量。提高產品質量。 (4)(4)固定化原生質體發酵的培養基中需要固定化原生質體發酵的培養基中需要添加滲透壓穩定劑添加滲透壓穩定劑, ,以保持原生質體的穩定性。以保持原生質體的穩定性。這些滲透壓穩定劑在發酵結束后這些滲透壓穩定劑在發酵結束后, ,可用層析或可用層析或膜分離技術等方法與產物分離。膜分離技術等方法與產物分離。 固定化原生質體可用于各種氨基酸、酶和生物堿等物質的生產以及甾體轉化等。現舉例如下: 1.1.氨基酸的生產氨基酸的生產 19821982年日本東京工業大學以瓊脂多孔蠟酸纖維年日本東京工業大學以瓊脂多孔蠟酸纖維素固定化黃色短桿菌原生質體素固定化黃色短桿菌原生質體, ,用于生產谷氨酸的研用于生產谷氨酸的研究。結果表明，由于解除了細胞壁的擴散障礙，有利究。結果表明，由于解除了細胞壁的擴散障礙，有利于谷氨酸分泌到胞外，提高谷氨酸產率。固定化原生于谷氨酸分泌到胞外