1、* *時間分辨技術的原理目前最先進的免疫檢測技術：1、時間分辨原理：用三價稀土離子及其鰲合劑作為示蹤物，代替熒光物質、同位素或酶，標 記蛋白質、多胎、激素、抗體、核酸探針或生物流行性細胞，當反應體系發生 后，用時間分辨儀器測定最后產物中熒光強度。根據熒光強度或相對熒光強度 比值，來判斷反應體系中分析物的濃度，達到定量分析之目的。2、時間分辨原子標記物的特點：發射光和激發光有較大的 STOKES位移一一高特異性 長壽命熒光，降低其他物質的熒光干擾一一高靈敏度 半衰期長達幾十萬年，試劑受干擾小 高穩定性原子標記與大分子標記物的對比原子標記物大分子標記物標記位點多個，可達20個只有1個對被標記物蛋白

2、活性的影響影響小，基本無影響影響大，經常影響蛋白活性對被標記物空間結構的影響無影響，保證穩定性影響大，造成試劑的不穩定受環境因素的影響影響小影響大，溫度影響3、波長分辨：標記離子的熒光激發光波長范圍較寬，發射光光譜范圍較窄，是類線光譜，有利于降低本底熒光強度，提高分辨率。激發與發射光之間有一個較大的 STOKES位移，有利于排除非特異熒光的干擾，增強測量的特異性。4、時間分辨:標記離子螯合物產生的熒光強度高，壽命長，有利于消除樣品及環境中熒光 物質對檢測結果的影響。每一秒名檢測樣品1000次，取其中不受干擾的 400次的均值作為測定值， 有利于提高檢測的準確性。時間分辨技術取代酶免、放免是免疫

3、檢測技術發展的必然趨勢！RIA （放免）放射性（1251），對環境和身體的危害，已經為重視環保的國家逐步取消，如 整個歐洲僅尚存幾個放免試驗室。125I半衰期短，導致試劑的有效期短，需每次定標，造成很大的浪費。由于標記物（125I ）的不斷變化，帶來藥盒批間、批內較大的變異，標準曲線 無法保存備用。ELESA （酶免）靈敏度、重復性不及放免，易造成漏檢和假陽性。酶的純度和反應過程容易受環境因素影響，導致穩定性、重復性不好。與其它技術的相對優勢：（1）、是現有的免疫檢測方法中靈敏度最高的（2）、是現有的免疫檢測方法中穩定性最好的（3）、多標記檢測是目前所有免疫檢測技術中獨一無二的* *TRF技術

4、與電化學發光的比較時間分辨熒光電化學發光標記物四種原子：Eu,Sm,Te,Dy一種原子:釘多標記技術有無科研項目能（1000多種科研項目）無試劑種類58種臨床,24種科研，共82種40種臨床，無科研試劑價格低高TRF與化學發光的比較時間分辨熒光化學發光發光效率95%1%重復檢測可無數次重復不可重復本底噪聲零本底干擾大靈敏級數10-1910-15標記物原子大分子化合物標記位點每個抗體可達20個1個標準曲線穩定達一年以上穩定2到4周多標記有，最多可達四標記無科研開發有無* *時間分辨熒光免疫定量分析簡介時間分辨熒光分析(TimeresolvedFluoroimmunoassay,TRFIA )是一

5、種非同位素免疫分析技術，它用鑭系元素標記抗原或抗體，根據鑭系元素螯合物的發光特點，用時間分辨 技術測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數進行信號分辨，可有效地排除非異熒光的干擾， 極大地提高了分析靈敏度。解離增強鑭元素熒光免疫分析是時間分辨熒光免疫分析中的一種它用具有雙功能基團結 構的螯合劑，使其一端與銪(Eu)連接，另一端與抗體抗原分子上的自由氨基連接，形底U 標記的抗體/抗原，經過免疫反應之后生成免疫復合物。由于這種復合物在水中的熒光強度非 常弱，因此加入一種增強劑，使Eu3+從復合物上解離下來，自由Eu3+同增強劑中的另一種 螯合劑螯形成一種膠態分子團，這種分子團在紫外光的激發下能發出很強

6、的熒光信號增強了 百萬倍。因為這種分析方法使用了解離增強步驟，因此稱為解離增強鑭系元素熒光免疫分析。乙肝病毒(HBV)標記物的檢測方法常用測定乙肝病毒的抗原、抗體標記物，由0年代 末70年代初的瓊脂擴撒法，依次發展為血凝法-酶聯免疫吸附(ELISA)、同位素免疫標記 (RIA)-化學發光免疫分析、生物發光、電化學發光免疫標記禾80年代中建立的稀土離子 熒光標記(時間分辨熒光免疫分析)等不同的檢測方法。隨著科學的發展和檢驗技術的進步， 其方法每發展一步，乙肝標記物檢出的靈敏度和準確性都得到不同的提高。時間分辨熒光免疫分析(TRF)為近年新研制成功的用三價稀土離子作為示蹤物，以單克 隆抗體包被支持

7、物與樣品中抗原反應，再加入有銪(EU)標記的抗體，進行反應檢測，可大 大降低一般同位素和熒光標記受環境干擾缺點，提高了檢測的靈敏度和準性，該RF法檢測 乙肝病毒標記物較其他方法靈敏度高、特異性好，干擾因素少RF為目前檢測乙肝病毒標記 物最理想的方法。TRF定量檢測乙肝病毒“兩對半”為臨床診斷乙肝提供了新手段，有助于臨床客觀的分析 HBV感染情況、療效的觀察和轉歸等情況的分析，至少可對下列情況更具有獨特的診斷價值：1、治療前進行病毒定量檢測，可以指導選擇抗病毒藥物，避免盲目用藥。2、治療后定量間接判斷體內病毒數量，有助于療效的觀察。3、懷孕前進行定量測定，有助于選擇有利于的懷孕時機。乙肝孕婦進行

8、定量檢查，有助于使 部分病人得到及時的正確的診斷目前我科已正式開展了乙肝二對半的TRFIA定量分析，其每一項的正常值范圍均是由我 國衛生部根據美國雅培的標準而制定其靈敏度，準確度,及精確度都有遠遠優于一般的ELISA 法，乙肝兩對半的定量制定將給臨床提供一個關于乙肝診斷及療效預后判斷的更可靠的實驗 結果。1、極大地提高了檢測的靈敏度時間分辨熒光免疫定量技術(TRFIA)檢測HbsAg靈敏 度可達0.2ng/ml，而酶標(EIASA)檢測的靈敏度是2ng/ml，極大地提高檢測的靈敏度。因 此，在急性乙肝早期能及早檢出HbsAg，確證HBV感染，縮短窗口期；其次，可發現低濃 度HbsAg攜帶者；在

9、部分慢性乙肝患者中，由于機體缺乏對HBV包蟆蛋白的免疫應答， HbsAg表達較低，酶標檢測可出現HbsAg和HbsAb均陰性的情況，TRF技術則可避免這些情況的發生，為正確判斷病情提供依據。2、能動態觀察療效和監測病情1) 定量分析HBsAg和HBsAb的濃度變化，可預見急性乙肝是否處于恢復期。如 HBsAg濃度降低，HBsAb濃度逐漸升高，可說明病情正往恢復期發展；反之HBsAg濃度 處于較高水平或上升趨勢而HBsAb 一直處于較低水平，則易發展為慢性乙肝或病毒攜帶者。2) 定量分析HBeAg和HBeAb的濃度變化，可反映病情變化和治療效果。定量測 定能明確檢測HBeAg和HBeAb轉換的時

10、期，即表現為HBeAg濃度下降和HBeAb升高 的過程。高濃度的HBeAg還可間接提示病毒處于高復制狀態，具有較高傳染性。高濃度的 HBeAb 一方面提示病情好轉而在某些時候(如肝功能指標很差)則可能與肝壞死、肝硬化、 肝癌有關。3) HBcAb濃度的高低可反映病毒感染的狀態。高濃度的抗Hbc提示乙肝性感染， 恢復期濃度降低。慢性乙肝呈抗Hbc持續高濃度。而低濃度的抗Hbc 般為恢復期或既往 感染。4) 有利于對慢性肝炎活動性或非活動性的判斷。非活動性慢性乙肝各項指標相對穩定， 活動性往往呈現進行性變化。3、TRFIA和定量PCR技術可互相補充血清HBVDNA熒光定量PCR測定可以直接反映血液

11、中病毒復制狀態，具有很多臨床應 用價值，但不能完全反映病毒復制靜息期肝細胞內HBV病毒狀態o HBVDNA陰性并不完全 代表體內HBV已被清除，結合“兩對半”各項指標更能客觀反映體PHBV病毒狀態。4、HBsAb的定量測定能夠對乙肝的預防起到監督作用HBsAb的定量測定能夠對抗體是否真正具有“中和HBV的免疫力作出正確評價，對乙 肝的預防起到監督作用。HBsAb的含量在10mlU/ml以上病人ELISA檢測即可呈陽性結果，但并不提示機體都一定具有免疫力，而HBsAb的含量在10 100mlU/ml之間的樣本，定性 雖為“陽性”但此時機體對HBV的免疫力較弱，甚至不能預防HBV感染。只有HBsA

12、b的含 量達到100mlU/ml以上時才可確定具有抵抗HBV入侵的作用。作定量檢測，可根據HBsAb 的含量判斷機體對HBV的免疫狀態及乙肝苗的免疫效果因此定量測定對乙肝疫苗免疫力的評 價和高危人群預防免疫具有重要意義，特別是在少年兒童預防乙肝方面。乙肝兩對半定量的臨床意義1、乙肝表面抗原（HBsAg）定量能極早地檢出HBsAg，確證乙肝感染，幾乎能與preSI同時檢測出。在乙肝病程中大 大縮短了窗口期的時間。由于機體常缺乏對包膜蛋白的免疫應答HBsAg表達較低，可出現HBsAg、Anti-HBs 均陰性的情況，定量檢測HBsAg則可避免這些情況的出現。病毒發生變異后，病毒表達量較低，甚至“定

13、性”檢測不出抗原。可檢測出BsAg, 并極有可能同時檢測出HBsAg、Anti-HBs。國內外學者研究表明HBsAg的細胞免疫應答與肝細胞損傷有一定關系血清中HBsAg 含量和病人對HBsAg細胞免疫成反比關系，而肝功能改就則與此種細胞免疫成反比而定 量檢測HBsAg是反映這一關系的唯一手段。般來說，慢性肝炎HBsAgCOI相對恒定：而活動性肝炎HBsAgCOI往往較高且不穩定。2、乙肝表面抗體Anti-HBs ）定量Anti-HBs的定量檢測能夠地機體是否真正具有“中和HBV免疫力作為正確評價，避 免誤誤導病人，對乙肝的預防起到監督作用。Anti-HBs含理在10 100IU/L之間的樣本，

14、乙肝兩對半定性的結果為陽性，但此時 機體對HBV并無中和作用，仍有感染HBV的危險。只有定量檢測Anti-HBs在100UI/L 以上時才具有抵抗HBV入侵的作用。因此，定量檢測乙肝兩對半對乙肝疫苗免疫力的評價 和高危人群預防具有重要意義。3、乙能e抗原（HBeAg ）定量HBeAg是乙肝病毒在肝細胞在繁殖時出現的tC/C基因的產物，經蛋白酶水解后HBe 蛋白質以非顆粒形式分泌入血清中。在急性HBV感染時，血清中可出現HBeAg，但維持 可測水平的時間很短暫（數天一數周）HBeAg陽性一般是提示有大量病毒存在，是急性 乙肝恢復期的首選血清學指標。由前C基因突變HBV感染所致的急性或慢性乙肝，始

15、終不出HBeAg，但HBV-DNA 進行性復制。HBeAg亦在高COI水平波動。與前者HBeAg陽性慢性乙肝類型中的轉換期 比較，兩對半定性均表現為小三陽，但后者主要表現在高BeAgCOI值，忽高忽低的ALT 值和HBV-DNA始終陽性。4、乙肝e抗體（Anti-HBe定量由HBV野型株感染所引起的急性或慢性乙型肝炎，其自然史分為HBeAg陽性期和 Anti-HBe陽性期癥量監測能明確出HBeAg向Anti-HBe換的時期，即表現為HBeAgCOI 下降（含量降低）和Anti-HBeCOI下降（含量升高）的過程。因此,Anti-HBe定量與HBeAg 定量聯合檢測對監測HBV感染的病程及藥物的

16、療效觀察有很好的實際意義。由前C基因突就株HBV感染所致異型慢性乙肝，由于患者始終不出現HBeAg。因此，長期監測患者Anti-HBe含量對判斷其預后和轉歸具有十分重要的價值。5、乙肝核心抗體 An ti-HBc)定量乙肝病毒由外殼HBsAg和內核HBcAg組成。乙肝病毒感染期間，一般會產生Anti-HBc，在HBcAg出現后即可從血清中檢測到。偶爾也有nti-HBc陰性的HBV感染 者，多見于免疫抑制的病人。在乙肝感染康復者HBsAg攜帶者中，Anti-HBc可長期存在。因此，在特殊人群中開 展Anti-HBc篩選試驗對預防乙肝的傳播有重要參考價值。Anti-HBc定量懷其他HBV試驗一同檢

17、測有助于乙肝感染的診斷和監測。在其他指標 缺乏的情況下(如HBsAg陰性)，Anti-HBc定量可能是現存HBV感染的唯一指標 時間分辨免疫熒光法檢測乙型肝炎病毒標志物臨床工作中發現少部分經酶聯免疫吸附法ELISA)檢測僅乙型肝炎表面抗原HBsAg) 和抗HBc IgG陽性的患者，病毒含量卻很高。為此，采用時間分辨免疫熒光分析法(F)對 34例此類患者進行乙型肝炎標志物HBV M )的檢查，現將結果報道如下：一、資料與方法1病例選擇：為2002年2月至9月住院或門診患者，共34例，男21例，女13例，年 齡558歲，平均(29.2 18.7)歲。采靜脈血分離血清，用ELISA進行HBV標志物(

18、HBV M) 檢測及HBV DNA定量檢查。留取血清置30 C保存。(1) HBsAg、抗HBc IgG陽性，乙型 肝炎 e 抗原(HBeAg )、抗-HBs、抗-HBc IgM 陰性；(2) HBV DNA 含量104 拷貝/ml; (3) 近3個月未使用抗病毒藥物。每人進行2次抗原抗體檢查，結果一致。2次HBV DNA檢查， 結果相差1個數量級以下。2. 常規HBV M檢測：用ELISA法，試劑為上海科華生物工程股份有限公司產品，按產 品說明書操作。3. HBV DNA含理測定：采用實時熒光定量PCR法，試劑盒購自廣州中山醫科大學達安 基因診斷中心。儀器為美國Perkin Elmer公司G

19、ene Amp E5700型PCR儀。嚴格按說明 書操作，檢測靈敏度為103拷貝/ml。4. TRF法檢查HBV M :試劑為上海新波生物技術有限公司產品，采用nytest2000時 間分辨檢測儀。嚴格按照說明書操作。5統計分析：取HBV DNA含量的對數值進行成組設計的兩樣本均數比較，行檢驗。二、結果1. HBV M :用TRF法檢查發現，34例患者中HBsAg、HBeAg、抗-HBc陽性者15 例，HBsAg、抗-HBe、抗-HBc均陽性者14例，僅HBsAg、抗-HBc陽性者5例。即用ELISA 檢查時HBeAg假陰性15例，抗-HBe假陰性14例(表1)。2. HBV DNA含量：HB

20、eAg及抗-HBc均陰性組、HBeAg陽性組、抗HBc陽性組HBV DNA含量的對數平均值分別為3.451.74、7.291.59、5.801.46。將前者與后兩組分別 進行成組設計的兩樣本均數比較的t檢驗，t值分別為1.005、0.816, P值均0.05，差異 無顯著性。三、討論HBV M的變化是評估HBV感染后病情轉歸的重要依據，也是抗病毒治療的療效考核指 標之一。通過TRF檢查發現，大部分ELISA法檢測為HBsAg、抗-HBc陽性模式的患者其實 為HBeAg假陰性(15/34 , 44.12%)及抗HBe假陰性(14/34 , 41.18%)。僅少部分可能 為病毒變異的結果。研究發現

21、，HBsAg、抗-HBc濃度顯著高于正常,ELISA及 TRF符全率 為100%, 抗-HBs濃度明顯低于正常，兩者符合率為00%。而HBeAg、抗HBe濃度僅稍 高于正常，因此ELISA易出現假陰性。目前TRF主要用于激素的檢測。隨著儀器及試劑的國產化，檢測費用的降低,TRF因其突出的高敏感性、特異性強、無放射污染等特點，在BVM的檢測中有著廣泛的應用前景。作者單位：410011長沙，中南大學湘雅二醫院肝病研究中心目前我院已正式開展了乙肝二對半的時間分辨定量分析，其每一項的正常值范圍均是由 我國衛生部根據美國雅培的標準而制定，其靈敏度，準確度，及精確度都有遠遠優于一般的 ELISA法，乙肝兩

22、對半的定量制定將給臨床提供一個關于乙肝診斷及療效，預后判斷的更可 靠的實驗結果。時間分辨熒光免疫定量測定乙肝兩對半的臨床意義極大地提高了檢測的靈敏度時間分辨熒光免疫定量技術TRFIA)檢測HBsAg靈敏度可達0.2ng/ml,而酶標(EIASA) 檢測的靈敏度是2ng/ml,極大地提高檢測的靈敏度。因此，在急性乙肝早期能及早檢出 HBsAg，確證HBV感染，縮短窗口期；其次，可發現低濃度IBsAg攜帶者；在部分慢性乙 肝患者中，由于機體缺乏對HBV包膜蛋白的免疫應答，HBsAg表達較低，酶標檢測可出現 HBsAg和HBsAb均陰性的情況,TRF技術則可避免這些情況的發生為正確判斷病情提供依 據

23、。能動態觀察療效和監測病情1 ）定量分析HBsAg和HBsAb的濃度變化可預見急性乙肝是否處于恢復期如HBsAg 濃度降低，HBsAb濃度逐漸升高，可說明病情正往恢復期發展；反之HBsAg濃度處于較 高水平或上升趨勢，而HBsAb 直處于較低水平，則易發展為慢性乙肝或病毒攜帶者。2）定量分析HBeAg和HBeAb的濃度變化，可反映病情變化和治療效果。定量測定能 明確檢測HBeAg向HBeAb轉換的時期那表現為HBeAg濃度下降和HBeAb升高的過程。 高濃度的HBeAg還可以間接提示病毒處于高復制狀態具有較高的傳染性高濃度的HBeAb 一方面提示病情好轉，而在某些時候（如肝功能指標很差）則可能

24、與肝壞死、肝硬化、肝癌 有關。3）HBsAb濃度的高低可反映病毒感染的狀態。高濃度的抗Hbc提示乙肝急性感染， 恢復期濃度降低。慢性乙肝呈抗Hbc持續高濃度。而低濃度的抗Hbc 般為恢復期或既往 感染。4）有利于對慢性肝炎活動性或非活動性的判斷。非活動性慢性乙肝各項指標相對穩定, 活動性往往呈現進行性變化。 TRFIA和定量PCR技術可互相補充血清HBV DNA熒光定量PCR測定可以直接反映血液中病毒復制狀態具有很多臨床 應用價值，但不能完全反應病毒復制靜息期細胞內HBV病毒狀態。HBV DNA陰性并不完 全代表體內HBV已被清除，結合“兩對半”各項指標更能客觀反映體PHBV病毒狀態。 HBs

25、Ab的定量測定能夠對乙肝的預防起到監督作用嗎？HBsAb的定量測定能夠對抗體是否真正具有“中和HBV的免疫力作出正確評價，對 乙肝的預防起到監督作用HBsAb的含量在100mlU/ml以上病人ELISA檢測即可呈陽性結 果，但并不提示機體都一定具有免疫力而HBsAb的含量在10 100mlU/ml之間的樣本， 定性雖為“陽性”但此時機體對HBV的免疫力較弱，甚至不能預防HBV感染。只有HBsAb 的含量達到100mlU/ml以上時才可確定具有抵抗HBV入侵的作用。作定量檢測，可根據 HBsAb的含量判斷機體對HBV的免疫狀態及乙肝疫苗的免疫效果。因此定量測定對乙肝疫 苗免疫力的評價和高危人群預

26、防免疫具有重要意義，特別是在少年兒童預防乙肝方面。時間分辨熒光免疫分析在乙肝的應用中南大學湘雅二醫院肝病研究中心教授：楊旭乙肝抗原體測定是診斷乙肝最常用的方法。酶聯免疫測定由于操作簡便，成本低廉，敏感性和特異性較好，80年代中期以來就成為乙肝抗原體檢測最主要的方法。但是本法只能定性， 作為定量測定的方法，其重復性很差。據觀察，不同乙肝感染者表面抗原的濃度相8差0倍,e 抗原的濃度相差100倍，僅用“陽性”來表示，實在太粗糙，太不科學，難以滿足臨床的需要。觀察指標的量化是提高診斷水平的基本要求，也是科學發展的必然趨勢，因此，進入0 年代以來，國外先后推出第四代檢測方法：化學發光法、電化學發光法。

27、但是這兩個方法需要 昂貴的設備，試劑成本高，難以普遍應用。為了滿足臨床的需要，根據國情和省情，我科瞄準抗原抗體檢測發展的方向2002年 10月引進具有世界先進水平的時間分辨熒光免疫檢測儀，在省內率先建交時間分辨熒光免疫 分析（TRFIA）檢測乙肝抗原抗體的新方法，我院也是國內少數應用本法檢測乙肝的醫院之一。 時間分辨熒光免疫分析的原理和通常的免疫測定方法基本相同，只是標記物和測定方法不同。 時間分辨熒光免疫分析以三價稀土離子（常用的是銪）及其螯合劑代替同位素、熒光素或酶， 作為標記抗原或抗體的示蹤物，檢測未知的抗體或抗原，用特制的時間分辨熒光儀測定最后反 應產物中熒光的強度，根據熒光強度來判斷

28、待測物質的濃度在免疫復合物中的稀土離子自身 可產生微弱的熒光信號，而當加入增強液以后，稀土離子從免疫復合物中釋放出來，受到激發 光照射時，熒光強度可增強100萬倍。稀土離子發出性熒光不僅光度強，而且壽命長。反應 系統中許多物質也可以發出熒光，但他們的熒光的壽命極短，因此，通過簡單的延時檢測，就 可以將特異性熒光與非特異性熒光區別開來，所以這個方法的名稱冠以“時間分辨”時間分 辨熒光免疫分析是一種超靈敏的高度特異性的檢測技術是今后抗原抗體檢測發展的方向其 靈敏度比化學發光和電化發光高10倍100倍，比放免法和酶標法高1000倍以上。據我科 現場測評，其特異性、敏感性和重復性均極強，幾乎沒有假陰性

29、，假陽性率低于1%，同一 標本連續20次檢測CVV1%，同一批Q0個）連續3天檢測CV= 0.9%，檢測后反應板連續 3天重復閱讀CVV1%。這一方法的建立必將極大的提高我科的乙肝診斷水平，使我們對乙肝感染者的病情、預 后、病毒復制程度、抗病毒藥物的療效等的判斷更變科學。乙肝時間分辨熒光免疫分析試劑盒 共5項，包括表面抗原、表面抗體、e抗原、e抗體和核心抗體，可任選 1項或多項，全套需 備血3ml （不加抗凝劑），記賬后（每項45元）標本送傳染科實驗室，當天下午出結果。時間分辨熒光免疫測定技術在HBV M定量檢測及臨床應用分析【摘要】目的研究乙肝病毒感染者血清免疫學標志物，利用時間分辨熒光免疫

30、分析技術(TRFIA)檢測其含量結果與ELISA法結果的任合程度、靈敏度、特異性；了解RFIA測定 HBV-M的準確性、可行性及臨床應用價值。方法分別用TRFIA和ELISA法測定260例隨 機血清標本HBV-M結果及含量。結果HBsAg( ELISA)陽性36例，TRFIA陽性40例， x2=4,Pv0.05,兩法符合率98.46%;抗-HBs(ELISA陽,性 130 性,TRFIA陽性 160 例,x2=30 ,PV0.01，兩法符合率88.5%; HBeAg(ELISA)陽性 17 例，TRFIA陽性 18 例，x2=1 , P 0.05,兩法符合率99.6%;抗-HBe(ELISA陽

31、日性 86 例，TRFIA陽性 73 例 x2=6.76 , Pv0.01, 兩法符合率90.4%; 抗-HBc(ELISA陽性 54 例，TRFIA陽性 72 例，x2=15.6 , P0.01, 兩法符合率91.5%;結論TRFIA法與ELISA法比較，特異性、敏感性都高,TRFIA作用于 HBV-M含量檢測可為臨床間接反映病毒的感染狀況，同時也為臨床療效提供動力學觀察及 接種乙肝疫苗提供依據。關鍵詞HBV-M時間分辨熒光免疫分析技術酶聯免疫吸附試驗【文獻標識碼】A【文章編號】1606-8106 (2004) 06-0486-02The time-resolved fluoroi mmun

32、o assay TRFIA used in theHBV-M rati on test and the an alysis on cli nical applicati onCai Y iheDepartme nt of Laboratory,Chaozhou Cen tral Hospital,Gua ngdon g521021.【Abstract Objective to study the substanee of blood immunity HBV-M,Applyi ng,the tech no logy of TRFI -A to test the result and the n

33、 compare itwith the result of the ELISA in fixness,sensivity and specificity and to compre-hcnd the accuracyfeasibility and the value of clinical application in testing HBV-M by TRFlA.Metfods to deter-mi nate the result and content of260a nd HBV-M by TRFIA and ELISA respectirely.Results HBsAg positr

34、e is36by ELISA,a nd40by TRFIA, x2=4,Pv 0.05,the fix rate is98.46%;anti-HBs positive is130by ELISA,and160by TRFIA, x2=30 , P 0.05; the fix rate is99.6% ; Anti-HBe positive is86by ELISA,and73by TRFIA, x2=6.76 , P 0.01 , the fix rate is90.4%; Anti-HBc positive is54by ELISA,and72by TRFIA, x2=15.6 , P0.0

35、1, the fix rate is91.5%.Con-clusion TRFIA has higher specificity and sen sitivity tha n ELISA,TRFIAin test ing HBV-M co ntent may in directly n eflect the virus in fecti on in cli ni cal and offer dyn amics observati on in the cli ni cal iffects and basis in ino culati on a-ga inst HBV.Key words HBV

36、-M TRFIA ELISA時間分辨熒光免疫測定技術在HBV-M 定量檢測及臨床應用分析目前國內臨床實驗室最常用的乙型肝炎病毒HBV）感染者的血清學標志物檢測主要靠 ELISA法，由于ELISA法簡單、方便、快速的優點在臨床得到廣泛應用，但受方法學本身的 限制，它不能提供HBV-M的具體含量，只能作為陰陽性判斷，故不可能完囲BV感染的 動力學觀察，而時間分辨熒光免疫技術的出現提供了對HBV-M進行定量檢測的手段。本文 采用TRFIA法對260份血清標本進行HBV-M檢測，并與ELISA法結果進行比較和分析。 現報告如下：1對象與方法1.1對象血清標本均來自本院門診及住院病260例，無年齡性別要

37、求。早晨空腹抽取 靜脈血，分離血清后產即檢測。1.2檢測試劑ELISA試劑盒由上海榮盛生物技術有限公司提供TRFIA試劑盒由廣州市 豐華生物工程有限公司提供。1.3儀器EL-312e酶標儀。泰萊-1時間分辨熒光分析儀。Egate2310全自動洗滌。2510 變頻振蕩器。1.4質控物由衛生部臨床檢驗中心提供。1.5方法ELISA法和TRFIA法測定HBV-M，嚴格按照試劑操作規程操作，同時加入相 應質控物監測。1.6統計學方法采用配對X2檢驗。2結果2.1HBsAg ELISA法結果陽性36例，陽性率13.8%; TRFIA法結果陽性40例，陽性 率15.4%;兩法都陽性36例，兩法都陰性220

38、例，TRFIA陽性而ELISA陰性4例，TRFIA 陰性而ELISA陽性無，采用配對X2檢驗，x2=4,Pv0.05，差異有顯著性，兩法比較符合率 為 256/260=98.46% ;其中 HB-sAg 含量 0.55ng/ml 占 4 例,625ng/ml 占 7 例,26 50ng/ml 占 8 例，51 50ng/ml 占 8 例，150ng/ml 以上占 13 例。2.2 抗-HBs ELISA法結果陽性130例，陽性率50%; TRFIA法結果陽性160例，陽性率 61.5%;兩法都陽性130例，兩法都陰性100例，TRFIA陽性而ELISA陰性30例，TRFIA 陰性而ELISA陽

39、性無，采用配對x2檢驗，x2=30,P0.05，差異無顯著性，兩法比較符合率 為 259/260=99.6% ;其中 HBeSg 含量 0.030.1NCU/ml 占 1 例，0.11 0.5NCU/ml 占4 例，0.51 2NCU/ml11 例，2.1 8NCU/ml12 例。2.4抗-HBe ELISA法 結果陽性86例，陽性率33%; TRFIA法結果陽性73例，陽性率 28%;兩法都陽性67例，兩法都陰性168例，TRFIA陽性而ELISA陰性6例，TRFIA陰性 而ELISA陽性19例，采用配對X2檢驗,x2=6.76,Pv0.01，差異有非常顯著性，兩法比較 符合率為 235/2

40、60=90.4% ;其中抗-HBe 含量 1.52NCU/ml14 例，2 .1 5NCU/ml14 例，5.1 10NCU/ml23 例，20NCU/ml 以上24 例。2.5抗-HBe ELISA法結果陽性54例，陽性率20.8%; TRFIA法結果陽性72例，陽性 率27.7%;兩法都陽性52例，兩法都陰性186例，TRFIA陽性而ELISA陰性20例，TRFIA 陰性而ELISA陽性2例，采用配對X2檢驗，x2=15.6,Pv0.01，差異有非常顯著性，兩法比 較符合率為238/260=91.5% ;其中抗-HBe 含量0.1 0.5NCU/ml11 例,0.51 1NCU/ml1 例

41、，1 5NCU/ml10 例，5.1 10NCU/ml36 例，10NCU/ml 以上 14 例。3討論TRFIA法檢測HBV-M與ELISA法相比，其特異性和敏感性都高，特別是能夠檢測低濃 度HBsAg和HBeAg,對減少HBV感染漏診和誤診具有較高價值。因HBsAg陽性是HBV 感染的金標準。有學者對血清呈低水平存在、血清HBsAg約在5ng/ml以下者做過研究 】2】，對象是非肝炎患者住院人群結果是占總人群的2.34%,占HBsAg陽性人群的23.16%。 而本文只檢測出1.5%和10%。此結果存在一定差異，有待進一步探討。擁Bs是對HBV 的保護性免疫指標，有學者認為仍有保護作用的最低

42、掏Bs的濃度為10mIU/ml，提出基 礎免疫后高度抗體滴度的再接種方案最后一次接種后4周，如抗-HBsv10mlU/ml立即再 接種；10100mlU/ml , 36個月后必須再接種。實際工作中發現抗HBs定量檢測對 于監測、指導肝移值中乙型肝炎免疫球蛋白的應用具有肯定作用。說明了對抗Bs定量的 檢測是很有必要的，同時也可了解人體是否有抗HBs、是否有足夠的量可抵御HBV的侵襲。 本文抗-HBs結果顯示,160例TRFIA法陽性79例，抗HBs濃度值在10100mlU/ml以 內，此量因無確切的抵御能力，建議加強預防措施。對于IHBs陰性的人群更應做好預防， 至于100mIU/ml以上含量的

43、人群，說明他們已有好的抵御能力。另外結果提示ELISA法 的抗-HBe陽性率明顯高于TRFIA法，由于本身方法學的限制，最好在發出報告時加以綜合 分析或提高Cutoff值。從實驗結果表明HBV-M各項陽性結果都顯示了不同的含量說明了人體感染HBV后， 病毒的復制程度或經抗病毒藥物治療后,HBV-M含量也隨之變化，提示了動力學關系。據 所掌握的資料觀察，患都治療前及治療后HBV-M含量變化結果比較。見表 1。表1 2例病人HBV-M治療前后結果比較 略可以看出，HBsAg和HBeAg逐漸下降，而所有抗體逐步增高，這說明抗病毒治療是 有效的，同時也給臨床預后判斷提供了依據。目前臨床上對檢測HBV-

44、M的血清常用方法是血清免疫學檢測，也就是檢測患者對病 毒侵染機體產生的免疫反應，因此免疫血清學指標可間接反映病毒的感染狀況。隨著檢測水 平的不斷提高，TRFIA技術的問世給免疫自身的研究和發展提供了新的手段。雖網NA是 直接反映病毒本身在機體內的存在情況，而人們越來越意識到兩者既相關，又不盡一致，高 靈敏準確的HBV-M定量結果可與HBV-DNA的檢測相互印證,給臨床提供更客觀有效的實 驗報告，臨床上需要將兩者結合起來對患者進行綜合診斷、治療和預后等判斷。如果在沒有 開展HBV-DNA項目檢測的單位，HBV-M含量檢測其本身也就是一個很好監測病毒動力學 變化的輔助指標。參考文獻1、陳紫榕，病毒

45、性肝炎，北京：人民衛生出版社2002, 6, 191.2、陳瑜，鐘步云，徐根云，等低水平血清乙肝病毒表面抗原測定及臨床意義。中華檢測 醫學雜志，2001, 24： 1.3、Klaus-peter Maier著，郝連杰等譯第四版；北京人民衛生出版社，1997, 8, 35。作者單位：521021廣東省潮州市中心醫院檢驗科關于乙肝病毒標記物“兩對半”定量測定和肝功能（肝纖維化）檢測的通知各臨床科室：為增加我院臨床診斷、治療和觀察病情的參考依據，進一步提高我院的醫療水平和我院的綜合競爭能力。我們要積極開展應用技術、新項目。最近檢驗科在院領導的大力支持下引進了 WALLAC公司生產的時間分辨熒光免疫分

46、析系統，該時間分辨熒光免疫分析系統可進行多種檢測（見附錄）其中對“乙肝兩對半”可進行準確的定量測定。歡迎各臨床科選用醫務科2002年12月25日一、兩對半定量測定乙肝病毒（HBV）標記物的檢測方法常用測定乙肝病毒的抗原、抗體標記物，由0年代末 70年代初的瓊脂擴撒法，依次發展為血凝法-酶聯免疫吸（ELISA）、同位素免疫標記（RIA） -化學發光免疫分析、生物發光、電化學發光免疫標記禾80年代中建立的稀土離子熒光標 記（時間分辨熒光免疫分析）等不同的檢測方法。隨著科學的發展和檢驗技術的進步，其方 法每發展一步，乙肝標記物檢出的靈敏度和準確性都得到不同的提高（其中 RIA為 10-12mol/L

47、、ECL 10 為 10-19 mol/L、CLIA 為 10-15m ol/L、ECL10為-17/L、TRF為 10-19 mol/L ）。其中時間分辨熒光免疫分析TRF）為近年新研制成功的用三價稀土離子作為示蹤 物，以單克降抗體包被支持物與樣品中抗原反應，再加入有銪EU）標記的抗體，進行反應 檢測,可大大降低一般同位素和熒光標記受環境干擾缺點提高了檢測的靈敏和準性，該TRF 法檢測乙肝病毒標記物較其他方法靈敏度高、特異性好，因干擾因素少可大地優于以上各種 方法，可與HBV-DNA的檢測相比（未經規范化要求開展的HBV-DNA檢測，多年的臨床 實驗證明，假陽性、假陰性率較高，重復性差，且不

48、能定暈。TRF為目前檢測乙肝病毒標 記物最理想怕方法。TRF定量檢測乙肝病毒“兩對半”為臨床診斷乙肝提供了新手段，有助 于臨床客觀的分析HBV感染情況、療效的觀察和轉歸等情況的分析，至少可對一列情況更 具有獨特的診斷價值：1、治療前進行病毒定量檢測，可以指導選擇抗病毒藥物，避免盲目用藥。2、治療后定量間接判斷體內病毒數量，有助于療效的觀察。3、懷孕前進行定量測定，有助于選擇有利的懷孕時機。乙肝孕婦進行定量檢查，有 助于使部分病人得到及進的正確的診斷 二、兩對半定量與定性組合測定今后檢驗科對乙肝“兩對半”檢查，可給臨床提供兩種選擇，一種是乙肝病毒項定 量測定；另一種是定量與定性組合檢查，即在乙肝

49、“兩對半”的五項檢查中HbsAg （表面 抗原）、抗-HBs （表面抗體）、，HbeAg （E-R抗原）此3項重要的指標中必須有一項是定量 的（其余4項定性；也可選擇其中2項做定量，其余3項做定性）。任上臨床根據病人的經 濟情況選擇，但如果臨床不注明，檢驗科一律做HbsAg定量與其余4定性檢查。5項定量 測定收費105元，1項定量與其余4項定性檢查收費45元。此舉意義1使“兩對半”檢查得到更加準確的結果與及更好解釋和發揮“兩對半”檢查 的臨床意義；2使臨床檢查“兩對半”有更多、更切合患者利益選擇，如病人經濟許可，可 選擇5項定量測定，如果經濟困難即可注明選擇其中項與其它4定性檢查。馬此種組合合

50、 理，檢查意義大，符合國家循征醫學的要求。（“兩對半”定量檢查，收費105元，如同時做生化全套，開檢驗單時請分開單，如“兩 對半”為1項定量其余4項為定性檢查在一張檢驗單同時申請即可、南通醫學院論著甲胎蛋白、癌胚抗原時間分辨熒光法與化學發光法比較王桂蓮朱利國黃飚蔡剛明譚成金堅單位：江蘇省江原醫院，無錫241063關鍵詞：時間分辨熒光免疫分析；化學發光免疫分析；甲胎蛋白；癌胚抗原摘要DTPA法制備了 Eu3+標單抗，采用夾心法建交了 AFP和CEA IFMA。它們的靈敏度分別為43ng/L和90ng/L ;批內CV為1.599%和1.36% ;批間CV為* *7.139%和2.89%:平均回收率

51、為103.98%和92.78%。與CLIA進行臨床應用比較顯 示結果高度相關(AFP r=0.9040,CEA r=0.9705 )。中圖分類號0657.9文獻標識碼A文章編號1000-2057(2000)02-0159-01甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA是迄今較為肯定的腫瘤標志物，憶廣泛用于臨床 腫瘤診斷，兩者的檢測已有RIA、EIA和IRMA等方法。近來發展的時間分辨熒光和化 學發光測量技術，信噪比較高，分析靈敏度超過了上述方法】2o我們在完成了 AFP、 CEA和IRMA工作的基礎上，采用時間分辨熒光測量技術，建交了時間分辨免疫熒光 分析(Time-resolved Immunof

52、luormetric assay,IFMA),并與化學發光免疫分析(Chemiluminescenee Immunoassay,CLIA )進行比較。1材料與方法1.1試劑與設備抗CEA單抗C17和C50,抗AFP單抗137#和47#由無錫市第二制藥廠提供。Eu3+標記盒(1244-302 ), Eu3+發光增強液(B118-110 )、AFP 和CEA參考標準，EG&G-Wellac產品。二乙烯三胺五乙酸酐(DTPA), Sigma產 品。PD-10 和 Sepharose CL-6B,Pharmecia 產品。CA-19-9、CA-12-5 和 CA-15-3 參考標準，AFP和CEA C

53、LIA藥盒，CIBA-CORNING產品。牛IgG自制。去離子超 純水由本室采用Barnsteed公司超純水器(D7033)制備。96孔微扎板，Nunc產 品 o BSA,上海生物制品的產品。其他試劑均為國產分析純。全自動IFMA檢測儀(AutoDELFIA1235)為 EG&G-Wellac 產品。全自動 CLIA檢測儀(ACS180 )為 CIBACORNING產品。1.2方法1.2.1CEA IFMA (1)固相 C17 和 Eu3+ -C50 制備：將C17 單抗用 5 0 nmol/LNa2CO3-NaHCO3 Ph9.6 釋至10 mg/L。每孔加 200ul,4 C放置過夜oEu

54、3+ -C50制備參照Eu3+標記盒進行。每個C5 0lgG上連接了 13個Eu3+ , 產率達 52.6%。(2)測定方法：用含8mmol/LNaCI,0.1%BSA,0.2%牛 IgG,50umol/LDTPA,0.1ml/LTween-80 和 0.1%NaN3 的 50mmol/L Tris-HCI ph7.8為反應沖液，以含 14.5 水 mmol/L NaCI,0.2ml/L Tween-80 和 0.2%NaN3 的上述緩沖液為洗滌液采用固相二步順序夾心法建立CEA-IFMA,即在包被有C17的96 孔微孔板上,每孔依次加入25ul CEA參考標準或待測血清及200ul反應緩沖

55、液,37C振蕩孵育2h后，用洗滌液洗4次。再加200ul1:1000稀釋的Eu3+ -C50 , 37 C孵育1h，洗滌6次，加入增強液200ul,370170反應5min,熒光檢測。全部 過程在Auto DELFIA1235上自動完成。1.2.2 AFP IFMA (1)固相 C47 和 Eu3+ -C137 制備：方法同上，每個C137IgG上連接了 7.52個Eu3+，產率達53.07%o (2)測定方法：反應緩沖液和洗滌液同上。采用固相二步順序夾心法建交AFP-IFMA, C47包被板每孔依次加入25ulAFP參考標準或待測血清及200ul反應緩沖液,37C孵育仆后，加200ul :

56、1000 稀釋的Eu3+ -C50，孵育1h。后續方法同上。* *123 CEA和AFP CLIA參照藥盒說明書，全部過程均在ACS180上自勸完成。2結果2.1CEA IFMA 以零劑量測量結果均值加上0.2S代入標準曲線分析,CEA IFMA 的靈敏度為90ng/L ； AFP對本法無交叉反應，CA-19-9的交叉反應可達2.81% ； 方法的批內和批間CV分別為1.36%和2.89%。平均回收率為92.78%，可測范 圍為 1.45 508.9ug/L。2.2 AFP IFMA以零劑量測量結果均值加上0.2S代入標準曲線分析,AFP IFMA的 靈敏度為43ng/L ; CEA、CA-12-5、CA-15-3和CA-19-9對方法無交叉反應； 方法的批內和批間CV分別為1.599%和7.139%。平均回收率為103.98%;可測 范圍為 4.22 1210ul/L。2.3 IFMA與CLIA同步比較137例正常人經CEAMA和CLIA測量，結果高度相 關(r=0.9705)。148例正常人經AFP IFMA和CLIA測量，結果相符(r=0.9040 )。 3討論以往超微量免疫分析技術應用的普遍問題是穩定性難以滿足于臨床工作的需 要。鑒于放射性同位素示蹤劑自身衰變