1、測定細菌生長曲線一、 實驗目的1 了解細菌生長曲線特征，測定細菌繁殖的代時；2 學習液體培養基的配制以及接種方法；3 反復練習無菌操作技術；4 了解不同細菌，不同接種方法在同一培養基上生長速度的不同；5 掌握利用細菌懸液混濁度間接測定細菌生長的方法；二、 實驗原理將一定量的菌種接種在液體培養基內，在一定的條件下培養，可觀察到細菌的生長繁殖有一定規律性，如以細菌活菌數的對數做縱坐標，以培養時間做橫坐標，可繪成一條曲線，稱為生長曲線。單細胞微生物發酵具有4個階段，即調整期（遲滯期）、對數期（生長旺盛期）、平衡期（穩定期）、死亡期（衰亡期）。生長曲線可表示細菌從開始生長到死亡的的全過程動態。不同微生

2、物有不同的生長曲線，同一種微生物在不同的培養條件下，其生長曲線也不一樣。因此，測定微生物的生長曲線對于了解和掌握微生物的生長規律是很有幫助的。測定微生物生長曲線的方法很多，有血細胞計數法，平板菌落計數法，稱重法和比濁法。本實驗才用比濁法，由于細胞懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可以利用分光光度計測定菌懸液的光密度來推知菌液的菌液的濃度。將所測得的光密度值（od600）與對應的培養時間做圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線。注意，由于光密度表示的是培養液中的總菌數，包括活菌和死菌，因此所測生長曲線的衰亡期不明顯。從生長曲線我們可以算出細胞每分裂一次所需要的時間，即代時，以g表示，其計算公式為：

3、g（t2-t1）/(lgw1-lgw2)/lg2式中t2和t1為所取對數期兩點的時間，w1和w2分別為對應時間測得的細胞含量或od。三、 實驗器材 大腸桿菌，枯草桿菌菌液及平板； 培養基(100ml/250ml三角瓶10瓶/大組):牛肉膏蛋白胨葡萄糖培養基； 取液器(5000ul, 1000ul 各一支)，無菌1000ul吸頭若干，無菌5000ul吸頭若干，比色皿10個及共用參比杯一個，培養箱3臺，722s分光光度計；四、 實驗步驟1 活化菌種 將細菌接種到牛肉膏蛋白胨葡萄糖三角瓶培養基中，37振蕩培養18h，另外準備單菌落平板各1塊；2 接種6人大組分為3個小組，按表1接種。表1.各培養基接

4、入菌種及培養條件編號接入菌種培養條件0放置在實驗臺上做對照第1小組11.0ml大腸桿菌菌液37 200rpm23.0ml大腸桿菌菌液37 200rpm35.0ml大腸桿菌菌液37 200rpm第2小組4一個大腸桿菌菌落37 200rpm51.0ml大腸桿菌菌液37 110rpm61.0ml大腸桿菌菌液30 200rpm第3小組71.0ml枯草桿菌菌液37 200rpm81.0ml枯草桿菌菌液30 200rpm91.0ml枯草桿菌菌液37 110rpm3 培養并測量每培養一小時取樣一次：取500ul培養液到2000ul蒸餾水中，以蒸餾水為對照，測od600，固定參比杯，不要調動波長旋鈕；固定一臺

5、分光光度計; 零小時也要測。全班同時取樣,同時開始振蕩, 取樣期間時間不算。培養開始時，測0號瓶ph。實驗結束后，測19號瓶ph。五、 結果1.od600od600記錄結果見表2。表2. 發酵過程od600測量值。劃線結果表示明顯錯誤，作圖時棄去；綠色表示用于計算代時。發酵時間/小時0.00 0.98 2.17 2.73 3.31 3.95 4.55 5.67 6.78 7.93 8.98 10.07 編號od600（除0小時外均是測量值減基準值）10.032 -0.030 0.156 0.233 0.301 0.249 0.309 0.312 0.309 0.315 0.317 0.317

6、20.123 -0.031 0.163 0.217 0.284 0.226 0.285 0.267 0.277 0.284 0.287 0.274 30.141 -0.008 0.191 0.253 0.280 0.225 0.163 0.213 0.292 0.297 0.286 0.256 4-0.021 -0.026 -0.022 -0.031 -0.029 -0.088 -0.020 0.044 0.224 0.344 0.371 0.365 5-0.012 0.029 0.184 0.224 0.255 0.203 0.269 0.259 0.250 0.239 0.254 0.20

7、6 6-0.013 0.003 0.089 0.173 0.258 0.270 0.317 0.409 0.415 0.415 0.383 0.401 70.002 -0.040 -0.039 0.153 0.344 0.021 0.062 0.194 0.242 0.297 0.372 0.427 8-0.007 -0.027 -0.034 0.166 0.318 -0.023 -0.008 0.052 0.107 0.199 0.277 0.337 9-0.008 -0.034 -0.018 0.189 0.397 -0.020 0.069 0.245 0.288 0.285 0.372

8、0.412 對各組數據做生長曲線圖，可得圖1。abcdefghi圖1.生長曲線。ai圖分別繪出19號培養瓶的od600發酵時間曲線，每幅圖上方小標題表示該圖的培養條件。gi組2.7和3.3小時數據明顯錯誤，未繪入圖。2ph 對照組初始ph7.0， 用實驗室的兩種試紙：6.48.0，4.05.0，各實驗組均未測出準確ph值。看來ph都處在5.06.4之間，精確值未知。3代時計算根據表1中的紅色數字對應的時間及od600，我們用公式： g（t1-t2）/(lgw1-lgw2)/lg2來計算各瓶的代時。計算結果見表2。表2.各發酵條件下的代時t1/ht2/hw1w2代時g/min12.172.730

9、.1560.23358.122.172.730.1630.21781.432.172.730.1910.25382.845.676.780.0440.22428.452.172.730.1840.224118.462.172.730.0890.17335.074.555.670.0620.19440.886.787.930.1070.19977.194.555.670.0690.24536.8 理論上，大腸桿菌代時為37min，枯草桿菌代時為25min，我們的計算結果還與之相去甚遠。原因主要是培養條件不行，不是連續發酵，沒有營養補充，而且細菌生長時經常被我們“打擾”，不能一直保持高速生長狀態。

10、而且我們都是用原始數據點進行計算的，可能會有較大偏差。可以利用軟件對生長曲線進行擬合，得到平滑的s型曲線再計算。可惜我沒有相關軟件，只好湊活用excel。 六、 討論 從上面的實驗結果可以看出，不同菌種、不同溫度、不同轉速條件下，發酵的生長曲線和代時有很大差異。下面我們分別對這些影響因素進行討論。1 溫度我們選取培養瓶1號和6號、7號和8號分別做對比，在同一張圖內做生長曲線(圖2)。不同溫度下大腸桿菌的生長曲線不同溫度下枯草桿菌的生長曲線圖2.溫度對于生長曲線的影響。上圖菌種為大腸桿菌，下圖菌種為枯草桿菌。除溫度外，其余條件均一樣。由圖可以看出，大腸桿菌在37條件下調整期較短，迅速進入對數期。

11、在30條件下，調整期、對數期均有明顯增長，穩定期到來較晚，且維持在一個較高的水平上。可以認為37更利于大腸桿菌的生長，30條件下細菌需要更長的時間來適應溫度。但是比較代時發現，37的代時要長于30，這與生長曲線數據矛盾，可能是od600測量中的微小誤差積累起來所致，下面將討論。而在枯草桿菌中，37的調整期較短，代時也短于30。說明37更利于枯草桿菌生長。2 轉速我們選取培養瓶1號和5號、7號和9號分別做對比，在同一張圖內做生長曲線(圖3)。不同轉速下大腸桿菌的生長曲線不同轉速下枯草桿菌的生長曲線圖3.轉速對于生長曲線的影響。上圖菌種為大腸桿菌，下圖菌種為枯草桿菌。除轉速外，其余條件均一樣。 從

12、圖3看出，轉速對于調整期和對數期沒有太大影響，但是高轉速帶來的高溶氧可以顯著縮短大腸桿菌的代時。大腸桿菌是兼性厭氧，在高溶氧條件下生長較快，在低溶氧條件下也可生長，只是速度較慢而已。對于枯草桿菌，從生長曲線、代時上看都沒有顯著改變。但是枯草桿菌是需氧菌，理論上講應該高轉速有利生長。可能是因為振蕩作用不足以使溶氧增加到影響枯草桿菌生長的闕值，或是低轉速已經足夠提供其快速生長所需氧氣。3 細菌種類 我們選取培養瓶1號和7號、5號和9號、6號和8號分別做對比，在同一張圖內做生長曲線(圖4)。圖4.各個培養條件下大腸桿菌和枯草桿菌的生長曲線對比。溫度、轉速表于每幅圖上方。 由圖4可以看出，在各個培養條

13、件下，枯草桿菌的調整期均明顯長于大腸桿菌，而對數期也要長于大腸桿菌，代時較短。說明大腸桿菌能夠很快地適應發酵環境，快速生長，而枯草桿菌調整能力較弱，但生長能力較強。4 菌種狀態我們選取培養瓶1號和4號，在同一張圖內做生長曲線(圖5)。圖5.大腸桿菌不同菌種狀態的生長曲線對比。培養條件為37，200rpm。從圖5可以明顯看出，固體菌種的調整期約為5個小時，遠長于液體菌種（約為1個小時），可能原因是固體菌種需要一定時間來分散到培養基中，以免局部過濃發生種內競爭。但是可能是因為固體菌種里菌數較多，生長起來速度非常快，其代時很短，而且對數期較長，如果繼續發酵的話可能會達到很高的穩定期平臺。5 菌種數量

14、 我們選取培養瓶1號、2號和3號，在同一張圖內做生長曲線(圖6)。圖6.大腸桿菌不同菌種數量的生長曲線對比。培養條件為37，200rpm。 從圖6的3條曲線可以看出，不同接種量對生長曲線沒有什么影響，而代時也沒有顯著改變。唯一的不同是基礎od600值有所差別，接種量越大，初始od600值也越大。可是理論上講接種量越大，生長會越快。至于為什么不符合理論，可能是因為菌種活性的問題，盡管接種量大但活性沒有相應的成正比提高。6 od600測量 按照要求，各組要使用固定的分光光度計和比色杯，連參比杯也不能換，這是為了 減小系統誤差而采取的措施。這點我們做的很好，但是在分光光度計的使用上犯了錯誤。在表2中

15、可以看出有一些數據明顯不符合生長曲線，在測量時很有可能是沒有對準光路，用光柵去擋了光，而我們還以為是已經開始生長，沒有在意。所以就繼續實驗下去，沒有重新校正、測量。直到后來發現數據又降下去重新開始增長才發現當時的錯誤，可惜沒辦法補救了，只好把那幾組數據作廢。 除了光路的影響，還有取樣的影響。雖然培養瓶在搖床中不斷振蕩，成分混合的比較均勻，但在取出后到取樣前的一段時間里（約2min）還是有可能沉降造成測量誤差的。所以吸之前也要用無菌槍頭吹打均勻，測之前再吹打一次。另外，分光光度計本身是有一定精度范圍的，0.05以內的偏差可以接受。所以如果眾多數據均在0.05范圍內波動，可以認為是相同的。但是如果

16、用于計算代時的數據一個取0.05，一個取0.05，算出來的代時就會有很大偏差了。這也解釋了為什么代時計算結果和預期有不符合的地方。7 取樣時間取樣時間要盡量短，讓細菌有一個穩定地生長環境，才能得到短代時、高產量的結果。我們的取樣開始時間和結束時間記錄見表4。表4.各取樣時間及中斷培養時間記錄發酵時間/h0.00 0.98 2.17 2.73 3.31 3.95 4.55 5.67 6.78 7.93 8.98 10.07 開始取樣時間9:4010:4911:5912:3413:0913:4714:2315:3016:3717:4618:4919:54結束取樣時間9:5010:5212:0212

17、:3713:1113:5114:2615:3216:4017:4818:5119:56開始培養時間9:5011:0012:0512:4013:1813:5514:3115:3816:4717:5118:56由表中數據可見，我們的間斷培養時間多為810分鐘，這相對于1小時的發酵時間來說占了不小比例。較長時間處在不太適合生長的低溫（室溫約25度）、低溶氧（無振蕩）環境中，這對快速生長中的細菌的影響無異于高速行駛中的汽車猛踩剎車。細菌需要一段時間來重新進入快速生長狀態。這大大增長了代時。因此我們要全班有序、配合，最好能在5分鐘內取完樣，使中斷時間盡可能的短。推薦在即將取樣前點燃酒精燈，在比色皿中預加

18、稀釋用的2ml水，拿出樣品后一起解開皮筋，逐一取樣。之后立即封口，放回培養箱，再去測od600。8 無菌操作 盡量避免雜菌污染。雖說相對于培養瓶中大量的實驗菌來說，雜菌勢孤力單，競爭起來毫無優勢，但是培養時間較長，多少都會影響實驗菌的生長，而且會消耗一部分培養基。每次取樣時都要在酒精燈火焰旁操作，同時注意不要燒到封口膜和移液器及槍頭。一旦封口膜被燒，沒有滅過菌的替代品，此瓶即報廢。希望以后做實驗時可以多準備35張滅菌封口膜備用，要不然因為封口膜被燒而報廢一組數據，覺得非常可惜。七、 思考題1. 為什么可用比濁法來表示細菌的相對生長狀況？細胞懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可以利用分光光度計測定菌懸液的光密度來推知菌液的菌液的濃度，從而在一定程度上反應細菌的相對生長狀況。 2. 生長曲線中為什么會有穩定期和衰退期？平衡期：當細胞繁殖的速度達到最高峰時，期細胞總量就不會再增加，是因為調整期、對數期糖類營養物質的消耗，代謝產物的積累以及培養基中ph值、氧化還原電勢的改變，對細胞產生了很大的抑制性。這時，細胞總數將處于穩定狀態，死亡細胞數和繁殖細胞數處于平衡狀態。死亡期：平衡期后如果繼續培養，細胞總數不再穩定，死亡細胞數將逐漸增加，死亡速度超過繁殖速度，使進入死亡期。3. 什么條件下接種為宜？液體種子比固體種子有什么優越性？從實驗結果可知，在細菌的最適溫度、溶氧條件下，接種適當數量的對