1、基于稀疏輪廓掃描的滑動(dòng)焦點(diǎn)光聲顯微成像方法摘要：在基于光聲共焦的超聲分辨光聲顯微成像系統(tǒng)中，只有焦點(diǎn)處的吸收體可以獲得高分辨率高信噪比的成像，而實(shí)際的生物組織往往具有不規(guī)則的輪廓，導(dǎo)致成像結(jié)果分辨率和信噪比不均勻。本文提出了一種基于手動(dòng)描繪輪廓的滑動(dòng)焦點(diǎn)光聲顯微成像方法，首先在固定的焦點(diǎn)上稀疏掃描輪廓，結(jié)合人工選擇輪廓點(diǎn)獲取輪廓的稀疏矩陣，然后通過(guò)線性擬合獲取完整的輪廓矩陣，并將輪廓矩陣的信息轉(zhuǎn)化為焦點(diǎn)位置信息，最后進(jìn)行二次掃描，根據(jù)焦點(diǎn)的位置信息在每次掃描之前調(diào)整焦點(diǎn)位置，使得在整個(gè)掃描過(guò)程中，樣品始終處于焦點(diǎn)的位置，從而獲得分辨率和信噪比均勻的光聲顯微圖像。通過(guò)在體皮下血管成像和皮下腫瘤血

2、管再生成像，證明了該方法可以有效提高光聲成像的質(zhì)量。關(guān)鍵詞：圖像處理；光聲成像；滑動(dòng)焦點(diǎn)1 引言光聲顯微成像（photoacoustic microscopy）是光聲成像技術(shù)的一種新興模式，通過(guò)使用聚焦型超聲傳感器探測(cè)1，或者聚焦光入射2的辦法，目前已實(shí)現(xiàn)亞波長(zhǎng)的高分辨成像3，在生物醫(yī)學(xué)研究和臨床應(yīng)用等領(lǐng)域展示了巨大的潛力。通過(guò)暗場(chǎng)反射式照明配合聚焦型超聲探頭，實(shí)現(xiàn)了軸向15 um、側(cè)向45 um的分辨率以及3 mm的最大成像深度，目前已用于小動(dòng)物的皮下血管成像4、腫瘤及周圍血管結(jié)構(gòu)與功能成像5、顱下血管成像6等領(lǐng)域。相對(duì)于激光散斑成像、光學(xué)相干成像、共聚焦顯微成像等高分辨光學(xué)成像技術(shù)，光聲顯

3、微成像可以在更深的深度實(shí)現(xiàn)高分辨的內(nèi)源及外源信號(hào)成像。暗場(chǎng)反射式光聲顯微成像的系統(tǒng)描述和成像原理可在文獻(xiàn)7中找到，這里簡(jiǎn)要介紹一下系統(tǒng)的圖像重建，通過(guò)時(shí)間分辨的超聲探測(cè)，乘以超聲在組織中的傳輸速度，可以獲取x-y平面上一個(gè)位置的深度信息（a scan），通過(guò)沿x軸掃描，可以獲取x-y平面上一條線的截面信息（b scan），通過(guò)在x-y平面上二維光柵掃描，可以獲取三維的結(jié)構(gòu)信息（c scan），通過(guò)三維可視化重建，即可得到組織的三維結(jié)構(gòu)圖。除此之外，二維的最大值投影圖（map）使用也很廣泛，由于血液的吸收遠(yuǎn)大于周圍組織，所以血管的光聲信號(hào)遠(yuǎn)大于周圍組織，從而在某個(gè)方向上求取最大值，可以保留血管的

4、信號(hào)，當(dāng)然最常用的還是在深度方向上求取最大值投影，這樣不但可以獲取x-y平面上的血管分布，而且可以抵消部分運(yùn)動(dòng)偽跡。本文展示的結(jié)果主要采用b型掃描和沿深度方向最大值投影圖的形式。在暗場(chǎng)反射式光聲顯微成像系統(tǒng)中，為了實(shí)現(xiàn)高分辨的光聲顯微成像，需要使用高中心頻率、寬帶寬、高數(shù)值孔徑的球形聚焦超聲傳感器，而這種結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的劣勢(shì)就是焦深也隨之降低8，這導(dǎo)致當(dāng)成像物體離焦時(shí)，成像質(zhì)量會(huì)迅速下降，在傳統(tǒng)的掃描方式下，探頭在x-y平面上以固定的高度掃描，樣品的輪廓波動(dòng)大于焦深時(shí)就會(huì)導(dǎo)致部分區(qū)域的成像質(zhì)量下降，在重建圖像上直觀的表現(xiàn)為分辨率下降導(dǎo)致的血管變粗以及信噪比的下降。一維8和二維9數(shù)值孔徑合成算法可以在

5、一定的離焦范圍內(nèi)改善這種惡化，但是目前只有一定的方向上進(jìn)行合成才能獲得比較好的效果，而且這種算法并未考慮組織與水的不同聲阻抗參數(shù)，故而存在一定的誤差10。因此有必要設(shè)計(jì)出一種能夠使得探頭的焦點(diǎn)沿樣品輪廓掃描的方法和系統(tǒng)，保證成像的分辨率和信噪比在整幅圖像上一致。本文設(shè)計(jì)了一種基于輪廓掃描的滑動(dòng)焦點(diǎn)光聲顯微成像方法，并在現(xiàn)有的光聲顯微成像系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)了該方法，通過(guò)在成像前稀疏掃描樣品輪廓，人工選擇部分輪廓點(diǎn)結(jié)合線性插值的辦法獲取樣品的輪廓矩陣，并將輪廓矩陣信息轉(zhuǎn)化為焦點(diǎn)的位置移動(dòng)信息，在成像時(shí)每移動(dòng)一個(gè)位置，就相應(yīng)調(diào)整焦點(diǎn)的位置，使得在整個(gè)掃描過(guò)程中樣品始終處于焦深范圍內(nèi)，從而獲得均一、高分辨、高

6、信噪比的圖像。2 方法2.1 輪廓信息的獲取焦點(diǎn)的滑動(dòng)是按照輪廓信息來(lái)執(zhí)行的，因此在成像之前需要首先獲取輪廓信息，這一過(guò)程主要分為以下兩步：2.1.1 稀疏輪廓b型圖像的獲取稀疏輪廓b型掃描基于傳統(tǒng)的固定焦點(diǎn)掃描，樣品放置好之后，先將焦點(diǎn)調(diào)整到感興趣區(qū)域，然后掃描多個(gè)位置的b型圖像，位置的選取要充分考慮樣品表面輪廓的波動(dòng)情況，當(dāng)波動(dòng)較大時(shí)，可以適當(dāng)?shù)拿芗瘨呙鑒型圖像，當(dāng)波動(dòng)較小時(shí)，可以適當(dāng)?shù)南∈钂呙鑒型圖像。為了方便后面的插值，一般要求輪廓b型圖像的掃描要包括視場(chǎng)的邊界。2.1.2 輪廓矩陣的獲取獲取輪廓稀疏b型掃描圖像之后，需要人工介入選擇每幅b型圖像上的輪廓位置，然后通過(guò)biharmoni

7、c樣條曲面插值獲取整個(gè)視場(chǎng)中的輪廓點(diǎn)位置（aij），該插值方法的原理簡(jiǎn)述如下11：對(duì)于二維空間中分布的n個(gè)控制點(diǎn)，i=1n，biharmonic樣條曲面插值可以轉(zhuǎn)化為求取方程組（1）的解：（1）其中為biharmonic算子，為單位沖擊函數(shù)，p為二維空間中待插值的位置，為p處插值的結(jié)果。方程組（1）的解為：（2）式中的可以通過(guò)求解線性方程組（3）獲得：（3）式中為二維green函數(shù)，即。插值得到的輪廓矩陣aij即為（2）式中的。該插值方法整體平滑且局部性能好，而且對(duì)控制點(diǎn)的分布和數(shù)量沒(méi)有限制12。插值得到的位置是絕對(duì)位置，為了避免水和組織聲阻抗特性的差異造成的誤差，將絕對(duì)位置換算為相對(duì)位置：（

8、4）式中rij為每次b型掃描的焦點(diǎn)移動(dòng)矩陣，ti為每次b型掃描起點(diǎn)的焦點(diǎn)移動(dòng)矩陣，即認(rèn)為在起始點(diǎn)時(shí)感興趣區(qū)域（如血管）處于焦深范圍，后面各點(diǎn)的掃描焦點(diǎn)的移動(dòng)均以該點(diǎn)為參照。將相對(duì)位置矩陣乘以z軸每個(gè)像素代表的深度（6 um），即可得到焦點(diǎn)的移動(dòng)信息矩陣，由于z軸的移動(dòng)指令數(shù)據(jù)格式為整形，所以最后還需要進(jìn)行數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換。輪廓信息的獲取過(guò)程示意如圖1所示。圖 1 輪廓信息的獲取過(guò)程示意2.2 滑動(dòng)焦點(diǎn)掃描滑動(dòng)焦點(diǎn)掃描依然基于b型掃描，每次b型掃描之前，首先將該線所對(duì)應(yīng)的焦點(diǎn)移動(dòng)矩陣（aik）送入內(nèi)存，然后在激光器觸發(fā)脈沖的觸發(fā)下依次完成信號(hào)的采集、掃描軸（x軸）的步進(jìn)以及焦點(diǎn)（z軸）的調(diào)整。一次b

9、型掃描完成之后，掃描軸電機(jī)回歸至初始位置，正交軸（y軸）步進(jìn)，同時(shí)z軸帶動(dòng)焦點(diǎn)也回歸到起始點(diǎn)的位置，這時(shí)再將tk送入內(nèi)存，控制焦點(diǎn)移動(dòng)到下一條b型掃描線的起始位置，重復(fù)上述b型掃描過(guò)程，完成整個(gè)視場(chǎng)的掃描。這里之所以在每條b型掃描線結(jié)束后焦點(diǎn)歸零（起始位置），是為了防止掃描過(guò)程中的一個(gè)可能的焦點(diǎn)移動(dòng)錯(cuò)誤帶入到后面的掃描過(guò)程中，從而避免了誤差的蔓延與累積。滑動(dòng)焦點(diǎn)掃描過(guò)程對(duì)應(yīng)于圖2所示的流程圖。圖2 滑動(dòng)焦點(diǎn)掃描流程圖3 實(shí)驗(yàn)3.1 模型實(shí)驗(yàn)對(duì)一塊表面包被黑色pvc絕緣膠帶的圓柱形金屬塊沿橫截面方向進(jìn)行b型掃描，掃描圖像如圖3a所示，圖中自上而下第一條亮帶為絕緣膠帶的上表面產(chǎn)生的光聲信號(hào)，第二條

10、亮帶為絕緣膠帶的下表面產(chǎn)生的光聲信號(hào)，在9 mm的掃描范圍內(nèi)，絕緣膠帶豎直方向的跨度約為1 mm，超出了超聲探頭的焦深（約0.3 mm），因此圖像兩側(cè)的信噪比逐漸下降。采用滑動(dòng)焦點(diǎn)掃描的圖像如圖3b所示，由于探頭沿著膠帶的輪廓滑動(dòng)，因此b型掃描的結(jié)果不再有明顯的弧度，而且均處于焦深范圍內(nèi)，表現(xiàn)出一致的信噪比。這里需要說(shuō)明的是：圖3b中的亮帶可見(jiàn)細(xì)微波動(dòng)，主要原因在于插值的誤差和電機(jī)驅(qū)動(dòng)的格式轉(zhuǎn)換誤差，但圖中的亮帶波動(dòng)峰值在70 um以內(nèi)，因此依然處于焦深范圍內(nèi)。圖3 表面包被黑色pvc膠帶的圓柱塊b型掃描結(jié)果。a為固定焦點(diǎn)掃描結(jié)果，b為滑動(dòng)焦點(diǎn)掃描結(jié)果3.2 小鼠皮下血管成像使用一只26 g的

11、昆明小鼠進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)證明該方法對(duì)皮下血管成像的有效性，實(shí)驗(yàn)使用584 nm的激光激發(fā)光聲信號(hào)，在這個(gè)波長(zhǎng)下血液產(chǎn)生的光聲信號(hào)比周圍軟組織高出10倍以上5。實(shí)驗(yàn)前腹腔注射0.2 g/kg水合氯醛和1 g/kg烏拉坦進(jìn)行麻醉，對(duì)該小鼠的背部同一區(qū)域的皮下血管先后進(jìn)行固定焦點(diǎn)掃描成像和滑動(dòng)焦點(diǎn)掃描成像，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，其中a為固定焦點(diǎn)掃描的最大值投影圖，b為滑動(dòng)焦點(diǎn)掃描的最大值投影圖，可以明顯的看出，a圖左側(cè)由于離焦導(dǎo)致血管逐漸模糊，而且信噪比逐漸下降，而滑動(dòng)焦點(diǎn)的方法可以使得圖像具有均勻的分辨率和信噪比，在最大值投影圖上表現(xiàn)為整個(gè)視場(chǎng)內(nèi)血管清晰可辨。c和d分別為a和b圖中虛線標(biāo)示位置的b型掃描

12、結(jié)果圖，可以清晰的看到由于沿著輪廓掃描，滑動(dòng)焦點(diǎn)的結(jié)果保證了皮下血管均處在焦深的范圍內(nèi)。圖4 皮下血管掃描結(jié)果對(duì)比。(a)固定焦點(diǎn)掃描最大值投影圖；(b)滑動(dòng)焦點(diǎn)掃描最大值投影圖；(c)和(d)分別為(a)和(b)中虛線所示區(qū)域的b型掃描結(jié)果3.3 大鼠顱下血管成像使用一只140 g的wistar大鼠進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)證明該方法對(duì)顱下血管成像的有效性，實(shí)驗(yàn)依然使用584 nm的激光激發(fā)光聲信號(hào)。實(shí)驗(yàn)前腹腔注射0.2 g/kg水合氯醛和1 g/kg烏拉坦進(jìn)行麻醉，然后將圖5a黑色方框所示區(qū)域的顱骨敲除，對(duì)該區(qū)域的顱下血管先后進(jìn)行固定焦點(diǎn)掃描成像和滑動(dòng)焦點(diǎn)掃描成像，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別如圖5b和5c所示，圖5b

13、自上而下血管逐漸模糊，同時(shí)伴隨著信噪比逐漸下降，而滑動(dòng)焦點(diǎn)的方法沿著顱骨的走向移動(dòng)焦點(diǎn)，從而在整個(gè)視場(chǎng)內(nèi)血管清晰可辨。圖5 顱下血管掃描結(jié)果對(duì)比。(a)開(kāi)顱成像區(qū)域示意圖；(b)固定焦點(diǎn)掃描結(jié)果；(c)滑動(dòng)焦點(diǎn)掃描結(jié)果3.4 荷瘤小鼠皮下血管再生成像對(duì)一只背部種有b16黑色素瘤細(xì)胞的c57小鼠（體重26 g）進(jìn)行成像，腫瘤直徑約有1 cm，凸起約有3 mm，同時(shí)導(dǎo)致腫瘤周圍皮膚有1 mm左右的起伏。成像前腹腔注射0.2 g/kg水合氯醛和1 g/kg烏拉坦進(jìn)行麻醉，用脫毛膏對(duì)腫瘤及周圍區(qū)域脫毛，利用滑動(dòng)焦點(diǎn)掃描的方法對(duì)黑色素瘤周圍的皮下血管進(jìn)行成像，成像結(jié)果如圖6所示。雖然肉眼還無(wú)法識(shí)別成像區(qū)

14、域是否已侵染腫瘤，但是從光聲成像的結(jié)果可以看出，血管的形狀變得異常，分布也變得雜亂無(wú)章，同時(shí)信噪比下降，表明腫瘤已經(jīng)在逐漸侵染這一區(qū)域。圖6的右上角為黑色素瘤部位，由于腫瘤部位分泌了非常多的黑色素，導(dǎo)致光聲信號(hào)非常強(qiáng)。圖6 腫瘤周圍皮下血管光聲顯微成像結(jié)果4 結(jié)論本文設(shè)計(jì)了一種滑動(dòng)焦點(diǎn)光聲顯微成像方法及系統(tǒng)，并通過(guò)模型實(shí)驗(yàn)、在體皮下血管成像和顱下血管成像證明了該方法的有效性，最后展示了這種方法對(duì)于腫瘤周圍血管成像的結(jié)果。本文提出的方法在獲得輪廓信息時(shí)需要人工介入，事實(shí)上在實(shí)際應(yīng)用中完全可以根據(jù)樣本的信號(hào)特點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算機(jī)擬合，本文提出的方法預(yù)留了這種改進(jìn)的接口函數(shù)，可以很方便的實(shí)現(xiàn)自動(dòng)獲取輪廓，但

15、是需要指出的是，由于生物組織的多樣性，很難保證一種計(jì)算機(jī)擬合方法在所有的樣品上獲得好的效果，因此，人工介入的辦法依然具有很強(qiáng)的實(shí)用性。參考文獻(xiàn)1 k. maslov, g. stoica,l. h. v. wang, in vivo dark-field reflection-mode photoacoustic microscopyj, optics letters, 2005, 30(6): 625-627.2 k. maslov, h. f. zhang, s. hu, etc, optical-resolution photoacoustic microscopy for in viv

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