1、生物藥物分析生物藥物分析 第三章第三章 免疫分析法免疫分析法 一、一、概述概述 二、二、抗原抗原 三、三、抗體與免疫反應抗體與免疫反應 四、四、免疫分析方法及應用免疫分析方法及應用 主要內容主要內容 一、一、概述概述 二、抗原二、抗原 三、抗體與免疫反應三、抗體與免疫反應 四、免疫分析方法及應用四、免疫分析方法及應用 主要內容主要內容 免疫學是研究免疫系統的結構與功能免疫系統的結構與功能，了 解其在免疫應答反應中對機體有益的防衛功能 和有害的病理損傷的機制，研究有效的免疫措 施，實現以防病，治病為目的的一門現代醫學 學科。 一、概述一、概述 什么叫免疫分析？什么叫免疫分析？ 基于抗原和抗體的特

2、異性反應基于抗原和抗體的特異性反應進行檢測的一種技 術手段。抗原抗體反應是指抗原與相應的抗體之 間發生的特異性結合反應。它既可以發生在體內， 也可以發生在體外。 在體內發生的抗原抗體反應為體液免疫應答的效 應作用。體外的抗原抗體結合反應主要用于抗原 或抗體的檢測，用于免疫學診斷。 (1) 在實驗藥物動力學和臨床藥物學中在實驗藥物動力學和臨床藥物學中，測定生物利用度 和藥物代謝動力學參數等生物藥劑學中的重要數據，以 便了解藥物在體內的吸收、分解、代謝和排泄情況； (2) 在藥物的臨床檢測中在藥物的臨床檢測中，對治療指數小、超過安全劑量 易發生嚴重不良反應或最佳治療濃度和毒性反應濃度有 交叉的藥物

3、血液濃度進行監測； (3) 在藥物生產中在藥物生產中，從發酵液或細胞培養液中快速測定有 效組分的含量，以實現對生產過程的在線監測； (4) 對藥品中是否存在特定的微量有害雜質進行評價。 在藥物分析中，免疫分析法的在藥物分析中，免疫分析法的 應用主要集中在以下幾方面：應用主要集中在以下幾方面： 第三章 免疫分析法 免疫分析免疫分析： 利用抗原與抗體的特異性結合作用，來選擇性識別和測定， 可以作為抗體或抗原的待測物. 免疫分析方法免疫分析方法 非標記免疫分析（抗原抗體結合理化性質發生變化非標記免疫分析（抗原抗體結合理化性質發生變化） 標記免疫分析標記免疫分析 標記物標記物 有無有無 非放射免疫分析

4、非放射免疫分析 放射免疫分析（放射污染）放射免疫分析（放射污染） 酶聯免疫分析酶聯免疫分析 熒光免疫分析熒光免疫分析 電化學免疫分析電化學免疫分析 化學發光免疫分析化學發光免疫分析 免疫分析免疫分析 第三章 免疫分析法 免疫分析檢測的發展免疫分析檢測的發展 放射免疫檢測放射免疫檢測（興起于（興起于2020世紀世紀7070年代年代) ) 酶聯免疫檢測酶聯免疫檢測（興起于（興起于2020世紀世紀8080年代，年代， 各臨床機構普遍使用）；各臨床機構普遍使用）； 以化學發光為代表的光生物學標記及免以化學發光為代表的光生物學標記及免 疫檢測技術疫檢測技術（2020世紀世紀9090年代開始推廣使年代開始

5、推廣使 用，產品步入成長期）三個階段。用，產品步入成長期）三個階段。 特點特點 可逆性可逆性 比例性比例性 反應階段性反應階段性 特異性特異性 免疫分析法的特點免疫分析法的特點 特異性特異性 特異性特異性：抗原與抗體結合反應的專一性：抗原與抗體結合反應的專一性 分子基礎分子基礎: :抗原表位與抗體分子高變區之間抗原表位與抗體分子高變區之間 空間構型的互補性空間構型的互補性 可逆性可逆性 可逆性：可逆性：抗原與相應抗體結合成復合物后，在一定條抗原與相應抗體結合成復合物后，在一定條 件下又可解離為游離抗原與抗體，件下又可解離為游離抗原與抗體，解離后的抗原或抗解離后的抗原或抗 體均能保持原有的結構和

6、活性。體均能保持原有的結構和活性。 影響因素：影響因素： 抗體對相應抗原的親合力親合力越高，結合越抗體對相應抗原的親合力親合力越高，結合越 牢固，越不易解離牢固，越不易解離 環境因素對復合物的影響環境因素對復合物的影響pH、離子強度、離子強度 比例性和比例性和 反應階段性反應階段性 比例性：比例性：抗原與抗體發生可見反應需遵循一定的抗原與抗體發生可見反應需遵循一定的 量比關系量比關系 前帶前帶(prezone)：抗體過量：抗體過量 后帶后帶(postzone)：抗原過量：抗原過量 等價帶等價帶(equivalence zone)：抗原抗體比例合適：抗原抗體比例合適 一、概述一、概述 二、二、抗

7、原抗原 三、抗體與免疫反應三、抗體與免疫反應 四、免疫分析方法及應用四、免疫分析方法及應用 主要內容主要內容 第三章 免疫分析法 2.1 2.1 定義定義 抗原（抗原（antigen）：）：指在機體中引起特異性免疫應答 反應的物質。 免疫原性（immunogenicity）：被注射入動物體內后 ，使其產生循環抗體或改變免疫細胞產生循環抗體或改變免疫細胞的反應性 抗原特異性（antigenic specificity）：具有能與特異與特異 抗體作用抗體作用的性質 全抗原（complete antigen） 半抗原（hapten）：只能與特異抗體作用，但不引起 機體免疫應答的分子 第三章 免疫分析

8、法 2.2 2.2 藥物分子的抗原性藥物分子的抗原性 1、藥物分子的免疫原性、藥物分子的免疫原性 大多數的藥物分子通常都是半抗原； 一些蛋白類藥物、多肽類藥物、激素類藥物 也是完全抗原。 2、藥物分子的抗原特異性、藥物分子的抗原特異性 藥物分子和蛋白質載體結合后，抗原特異性 可能會發生改變。 第三章 免疫分析法 3、藥物分析中，為了得到高效價的抗血 清，通常會與蛋白質載體合成人工抗原與蛋白質載體合成人工抗原進 行試驗。 常用載體：牛血清白蛋白（BSA）、卵清 白蛋白（OA）、破傷風類毒素（TT）、 鑰孔蛋白（KLH）等。 第三章 免疫分析法 （1）半抗原和載體結合的化學反應）半抗原和載體結合的

9、化學反應 多肽類激素多肽類激素：活化蛋白質或多肽的游離羧基形成肽鍵 ；與蛋白質或多肽的游離羧基縮合形成肽鍵 甾體甾體：通過含游離羧基的甾體衍生物與載體蛋白相連 抗生素抗生素：-內酰胺環在偏堿性條件下可以與蛋白質的 自由氨基以酰胺鍵的形式共價結合；氨基糖苷類抗生 素用碳化二亞胺為連接劑實現藥物和載體蛋白的連接 第三章 免疫分析法 （2 2）半抗原和載體的選擇原則）半抗原和載體的選擇原則 半抗原半抗原：最好含有芳香結構；應考慮抗原 抗體反應的微環境；合理利用分子類似物 之間的交叉反應。 載體載體：載體對監測系統的影響；載體效應 在免疫過程中的影響。 第三章 免疫分析法 （3）合成抗原的測定 定性測

10、定方法定性測定方法：光譜分析、熱力學分析 定量測定方法定量測定方法：相對含量測定；絕對含量 測定。 一、概述一、概述 二、抗原二、抗原 三、三、抗體與免疫反應抗體與免疫反應 四、免疫分析方法及應用四、免疫分析方法及應用 主要內容主要內容 第三章 免疫分析法 免疫分析實際上是一種特殊的試劑分析， 特點是抗體成為分析試劑抗體成為分析試劑。 第三章 免疫分析法 1、抗體的結構與功能 抗體泛指與待測分子特異性結合的蛋泛指與待測分子特異性結合的蛋 白質分子白質分子，包括免疫球蛋白（ immunoglobulin）, 受體（receptor ）和其他結合蛋白質，主要是免疫球 蛋白，常用的是IgG分子 .

11、第三章 免疫分析法 免疫球蛋白的基本結構 IgG分子基本結構是由四個肽鏈組成的，二條 較小的輕鏈和二條較大的重鏈，輕鏈與重鏈是 由二硫鍵連接形成，分為氨基端（N端），羧 基端（C端）。 第三章 免疫分析法 抗體的基本結構 第三章 免疫分析法 IgG分子由四條多肽鏈四條多肽鏈構成，以二硫鍵相連以二硫鍵相連，有三個功能區。 抗體在Fab區結合抗原分子，同時通過hi區的轉動以適應不同距離的 抗原決定簇。 與抗原結合后，IgG分子構象改變，暴露出Fc上的活性位點，從而表 現出固定和激活補體以及粘結單核細胞等親細胞反應的功能。 Fab：抗原結合片段：抗原結合片段 Fc：可結晶片段：可結晶片段 第三章 免

12、疫分析法 第三章 免疫分析法 胃蛋白酶（pepsin）水解片段 裂解部位，鉸鏈區H鏈間二硫鍵（C端） 裂解片段，F（ab）2，無Fc片段 與抗原結合可發生凝集反應 第三章 免疫分析法 木瓜蛋白酶（papain）水解片段 裂解部位，鉸鏈區H鏈間二硫鍵（N端） 裂解片段，2個Fab（54KD），一個Fc（50KD） ,Fab與抗原結合，不發生凝集反應。 第三章 免疫分析法 2抗體作為分析試劑的評價抗體作為分析試劑的評價 抗體的特異性抗體的特異性是無與倫比的，不需或只需 要簡單的預處理。有較高的穩定性較高的穩定性。 這兩點奠定了分析免疫高度靈敏和高度專 一的基礎。 此外，抗體還有一個獨特的性質：每個

13、抗 體分子有兩個抗原的結合點，即多價性。 然而抗體缺乏高靈敏試劑應具備的分析信 號反差。 第三章 免疫分析法 3、抗體的制備、抗體的制備 （1）常規抗血清（多克隆抗體多克隆抗體）：指人 工被動免疫后制成的多克隆抗體，是免疫 分析中的重要工具。 免疫原的制備、動物免疫、放血、抗血清 分離及抗血清的分析鑒定。 第三章 免疫分析法 免疫原的制備免疫原的制備 免疫原由質量好的抗原與佐劑制成。通常 有免疫原水劑、福氏完全佐劑和福氏不完 全佐劑。 水劑由無菌生理鹽水將抗原制成一定濃度 的免疫原。 弗氏佐劑是由一定量的羊毛脂和石蠟油， 以及一定濃度的分支桿菌混合而成，經研 磨達到油包水的程度。 不完全福氏佐

14、劑即不含有分支桿菌。 第三章 免疫分析法 動物免疫動物免疫 通常的免疫動物為家兔和羊。 免疫的部位多采用腳掌、腹股溝淋巴結、 大腿肌肉、皮下多點、靜脈。 免疫抗原量通常為110mg或50100mg。 第三章 免疫分析法 試血及效價測定試血及效價測定 家兔的試血通常可由耳緣靜脈取血，取血 量0.5ml。 不同稀釋度的抗血清和1%的血細胞懸液按 1:1混合，37保溫2h后觀測血細胞的凝 聚情況，即可測得免疫血清的效價。 第三章 免疫分析法 （2）單克隆抗體 單克隆抗體單克隆抗體是建立在經細胞融合而獲得的 雜交瘤細胞基礎上的。所獲得的抗體具有 均一的特異性。 高度均質性的特異性抗體，由一個識別單 一

15、抗原表位的B細胞克隆所分泌。一般來 自雜交瘤細胞 細胞培養法 & 接種動物體內生產法 第三章 免疫分析法 制備步驟制備步驟 第三章 免疫分析法 2、抗體的純化 利用化學方法提純或濃縮某一類的免疫球 蛋白。 利用免疫吸附劑和親和色譜得到免疫學上 專一性的抗體。 第三章 免疫分析法 3 3、特異性抗體的篩選與效價測定、特異性抗體的篩選與效價測定 抗體的效價抗體的效價又稱滴度，指某一物質與一定 容量的另一物質產生反應所需要的量。 免疫分析中，免疫血清中抗體的效價指將 血清稀釋，測定與一定的抗原能發生反應 的最大稀釋度，此最大稀釋度即為血清的 效價。 常用的效價測定方法有免疫擴散法、間接 血凝法和EL

16、ISA法等。 一、概述一、概述 二、抗原二、抗原 三、抗體與免疫反應三、抗體與免疫反應 四、四、免疫分析方法及應用免疫分析方法及應用 主要內容主要內容 四、免疫分析方法及其應用四、免疫分析方法及其應用 放射免疫分析法（放射免疫分析法（RIA） 熒光免疫分析法（熒光免疫分析法（FIA） 克隆酶給予體免疫分析法（克隆酶給予體免疫分析法（CEDIA） 酶聯免疫吸附分析法（酶聯免疫吸附分析法（ELISA） 放射免疫分析法（放射免疫分析法（radioimmunoassay, RIA） 1968年年Miles和和Hales建立了免疫放射分析方法，利用標記抗體作建立了免疫放射分析方法，利用標記抗體作 示蹤劑

17、，在反應系統中加入過量的抗體，故其靈敏度比放射免疫示蹤劑，在反應系統中加入過量的抗體，故其靈敏度比放射免疫 分析法明顯提高，而且標準曲線的測量范圍也明顯擴大。分析法明顯提高，而且標準曲線的測量范圍也明顯擴大。 由于特異性單克隆抗體用于免疫放射分析，使本法得到了更快的由于特異性單克隆抗體用于免疫放射分析，使本法得到了更快的 發展。近年來，基因工程抗體和抗原應用于本技術，使得免疫放發展。近年來，基因工程抗體和抗原應用于本技術，使得免疫放 射分析法更加完善。射分析法更加完善。 放射免疫分析（放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是體外放射分析技術）是體外放射分析技術 中建立最早、應

18、用最廣的一類中建立最早、應用最廣的一類競爭性體外放射分析技術競爭性體外放射分析技術. 基本原理基本原理 基本原理：放射性標記抗原與非標記抗原（包括標準抗基本原理：放射性標記抗原與非標記抗原（包括標準抗 原或待測抗原）與有限量的特異性抗體發生可逆性競爭原或待測抗原）與有限量的特異性抗體發生可逆性競爭 結合結合 , ,這種競爭可用以下反應式來表示：這種競爭可用以下反應式來表示： Ag + Ab AgAb + Ag + * Ag *Ag + *AgAb 抗原抗原 抗體抗體 常用的標記物：常用的標記物：125 I和氚標記物和氚標記物 放射性活度（貝克，放射性活度（貝克，Bp） 1Bp：每秒一次核衰變：

19、每秒一次核衰變 比活度（比活度（Bp/g）：）： 每單位質量所含的放射性比活度每單位質量所含的放射性比活度 游離狀態游離狀態 結合狀態結合狀態 具體步驟具體步驟 抗原抗體反應 結合的和游離的 放射性物質的分離 放射性活度的測定 柱色譜法柱色譜法 吸附法吸附法 沉淀法沉淀法 抗抗體發抗抗體發 微孔濾膜法微孔濾膜法 固相法固相法 求出結合率，繪制標準曲線（劑量反應曲線）求出結合率，繪制標準曲線（劑量反應曲線） 熒光免疫分析法（熒光免疫分析法（Fluorescence immunoassay, FIA） 免疫熒光技術是將抗原抗體反應的特異性和 敏感性與顯微示蹤的精確性相結合的一項技術 以熒光素作為標

20、記物，與已知的抗體或抗原結合 、但不影響其免疫學特性。然后將熒光素標記的 抗體作為標準試劑，用于檢測和鑒定未知的抗原 熒光免疫分析法（熒光免疫分析法（Fluorescence immunoassay, FIA） 在熒光顯微鏡下，可以直接觀察呈現特異性熒光 的抗原抗體復合物及其存在的部位 在實際工作中，由于熒光素標記抗體檢查抗原的 方法較為常用，所以一般通稱為熒光抗體技術 根據實驗方法分類 直接法 間接法 補體法 其他 直接法直接法 將熒光標記的特異性 抗體（抗原）直接加 在抗原（抗體）上， 經一定的溫度和時間 染色，水洗-干燥-封 片-鏡檢 操作簡便、特異性高 、非特異性染色少 敏感性低 抗原

21、 標記抗體 熒光 間接法間接法 先用已知未標記的 特異抗體（一抗） 與抗原反應，再用 標記的抗體（二抗 ）與其反應，形成 抗原-抗體-抗體復 合物，水洗-干燥- 封鏡-鏡檢 未知抗原未知抗原 未標記未標記 抗體抗體 標記抗標記抗 體體 熒光熒光 補體法 利用補體反應，通過 形成抗原-抗體-補體 復合物發射熒光 補體補體 標記抗標記抗 補體抗補體抗 體體 時間分辨熒光免疫測定 利用具有雙功能基團結構的螯合 劑，將鑭系元素標記到抗體（或抗原 ）上，經免疫反應形成復合物，由于 鑭系元素能發出熒光，故分離除去未 結合的成分后，利用時間分辨熒光儀 即可測定熒光強度，從而推測待測物 含量。 基本原理基本原

22、理 它采用抗原與抗體的特異反應將它采用抗原與抗體的特異反應將待測物待測物 與酶連接與酶連接，然后通過，然后通過酶與底物產生顏色反應酶與底物產生顏色反應， 用于定量測定。用于定量測定。 測定的對象可以是抗體也可以是抗原。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。 在這種測定方法中有在這種測定方法中有3 3種必要的試劑：種必要的試劑： 固相的抗原或抗體（免疫吸附劑固相的抗原或抗體（免疫吸附劑） 酶標記的抗原或抗體（標記物酶標記的抗原或抗體（標記物） 酶作用的底物（顯色劑酶作用的底物（顯色劑） 酶聯免疫吸附分析法（酶聯免疫吸附分析法（ELISA） 雙抗體夾心法，屬于非競爭結合測定非競爭結合測定。 它是檢測抗原最常用ELISA，適用于檢測分子中具有 至少兩個抗原決定簇的多價抗原。 其基本工作原理是：利用連接于固相載體上的抗體 和酶標抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗 原決定簇結合，形成固相抗體固相抗體-抗原抗原-酶標抗體免疫復酶標抗體免疫復 合物合物。復合物的形成量與待測抗原的含