中國農業科學院 碩士 學位論文 型 豬流感病毒進化分析及重組 白間接 斷方法的建立 3N2 of an A1 3N2 of an A1 要 型豬流感病毒在全世界豬群中廣泛存在，不僅給養豬業帶來了巨大的經濟損失 ，而且對人類健康造成威脅。為了了解我國 2004 2005 年豬流感病毒流行情況，我們對中國某些省市豬群進行豬流感血清學和病原調查研究，從 1238 份豬鼻棉拭子和豬肺、氣管樣品中分離到 5 株 型豬流感病毒。 通過比較發現分離的 5 株 型豬流感病毒 因同源性較高， 都 達到99%以上。對其中一株 A/(縮寫 D/9/05)的 全基因進行克 、測序，構建 分基因片段的系統進化樹， 從系統進化樹來看它屬于近期人流感病毒分支，通過 對 碼的氨基酸序列和參考毒株進行比較， 得知其 在某些氨基酸位點發生了突變。 將 增得到的 全長 為 因 克隆到 體上，篩選 、鑒定陽性重組子 以此為模板 擴增出 段，去除編碼 號肽的核苷酸序列，然后亞克隆到原核表達載體 ，經雙酶切、 定 ， 篩選重組表達質粒 序列分析 進一步驗證 因完整 。將 重組表達質粒 化到表達菌 ，經終濃度為 1 的 導，表達產物經 析，結果顯示 型豬流感病毒 因在原核表達系統中已表達， 白表達量 占 細胞總蛋白的 40%，分子量近似 42測 結果表明表達蛋白具有 良好 的 抗原 性 。 利用表達并純化后的重組蛋白作為抗原，建立檢測 型豬流感病毒抗體的間接了優化 應條件，我們 用 型豬流感病毒的標準陽性血清和標準陰性血清進行反應 ，最終確定了抗原的最適包被濃度為 00l，最適血清稀釋度為 1:100，酶標 最適工作濃度為 1:1000。 該 檢測 方法 不與 型豬流感病毒及 豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、偽狂犬病等豬病的陽性血清發生交叉反應 。 與 對比實驗 ， 同時 對 來自不同 地區患有呼吸道疾病 的 96 份現地 豬 血清 進行 檢測， 檢測結果表明法的 特異性和敏感性都較高， 并且 兩者的符合率達到 85以上，建立的間接 型豬流感病毒抗體檢測提供了快速、準確、簡便的方法。 關鍵詞 ： 豬流感病毒 ， 原核表達系統，間接 3N2 as a to To I 004 005, I in 1238 5 3IV A A 3a To of 3N2 （ IV of A1 of NA A NA A1 of A A1 of as We CR A in 0% in by A1 3N2 as We 3 To 3 00l, of :100, gG :1000. no 1I, 6 I It be as an to 3 錄 第一章 引言 . 1 基本概況 . 1 生物學活性 . 2 基因組結構及編碼蛋白 . 2 復制 . 3 抗原性變異 . 4 間傳播的分子機理 . 4 I 的公共衛生 . 5 V I 的流行現狀 . 5 清學診斷方法 . 6 I 血凝和血凝抑制試驗 . 6 I 神經氨酸酶抑制試驗 . 7 I 中和試驗 . 7 脂凝膠擴散試驗 . 7 疫熒光法 . 7 聯免疫吸附試驗 . 8 試驗研究的目的和意義 . 8 第二章 型 傳演化分析 . 9 料 . 9 驗用病毒株 . 9 胚 . 9 要試劑 . 9 要儀器 . 10 種 . 10 物設計 . 10 法 . 10 毒分離及有限稀釋克隆純化 . 10 細胞凝集（ 驗 . 11 細胞 凝集抑制 (驗 . 11 毒核酸的提取 . 11 因的 增 . 11 物的 瓊脂糖凝膠電泳 . 12 物回收和純化 . 12 腸桿菌感受態 制備 . 13 的基因 物的連接與轉化 . 13 性重組質粒的篩選 . 13 組質粒的 定 . 13 粒 化 . 14 粒 序 . 14 列拼接與分析 . 15 果與分析 . 15 株 型病毒表面基因 物 . 15 株 D/9/05 內部基因 物 . 16 株病毒 因的陽性克隆 . 16 株病毒 因編碼區核苷酸序列同源性比較 . 17 五株病毒八個基因片段同源性最高的毒株 . 17 W/（ 定 . 25 組表達質粒的構建 . 25 組表達質粒的鑒定 . 27 白在大腸桿菌中表達 . 28 達產物的 析 . 28 疫印跡檢測 . 29 合蛋白的純化 . 29 果 . 30 I 結果分析 . 30 因的 . 30 組質粒 鑒定 . 31 組蛋白 泳 . 33 組蛋白的 測 . 33 合表達蛋白的純化 . 34 論 . 34 第四章 型 組 白間接 測方法的建立. 36 料 . 36 原 . 36 清和酶標抗體 . 36 關溶液 . 36 要儀器和設備 . 37 接 法的建立 . 37 接 作程序 . 37 同抗原包被濃度和血清稀釋度試驗 . 37 同封閉液的對比試驗 . 37 同封閉時間的對比試驗 . 38 抗最佳作用時間的試驗 . 38 標二抗稀釋倍數和作用時間試驗 . 38 接 法陰陽性臨界值的確定 . 38 重復性試驗 . 38 測方法比較 . 39 叉試驗 . 39 果 . 39 原最適包被濃度及血清最佳稀釋度的確定 . 39 閉液的選擇 . 41 適封閉時間的確定 . 42 抗最佳作用時間 . 43 標抗體最適稀釋濃度的確定 . 44 標抗體最適作用時間的確定 . 45 陽性判定標準的確定 . 46 復性試驗 . 47 叉試驗 . 48 較試驗 . 48 論 . 48 第五章 結 論 . 50 參考文獻 . 51 附 錄 . 55 致 謝 . 64 作 者 簡 介 . 65 主 要 符 號 說 明 縮略語 全稱 對照解釋 脂擴散試驗 流感病毒 芐青霉素抗性 bp 基對 血清白蛋白 補 d 巰基蘇糖醇 二胺四乙酸 炭酸二乙酯 聯免疫吸附試驗 g HA 凝 素 h 時 HI 凝抑制 根過氧化物酶 丙基 kb 堿基 道爾頓 那霉素抗性 L LB mg 克 鐘 ml 升 摩爾 /升 爾 /升 nm 米 經氨酸酶 OD 密度 苯二胺 開放性閱讀框架 丙烯酰氨凝膠電泳 酸鹽緩沖液生理鹽水 合酶鏈式反應 PH 離子濃度 P/N 性值 /陰性值 乙二醇 /分 轉錄 搪核酸 糖核酸酶 糖核蛋白體 體破壞酶 s 二烷基磺酸鈉 特定病原體的 流 感 流感病毒 (羥 )甲基氨基甲烷鹽酸鹽 g 克 l 升 g/克 /毫升 X 插圖和附表清單 序號 圖表名稱 頁碼 圖 1感病毒粒子構成示意圖 3 圖 2株 型病毒 因 物 15 圖