飼料發酵工藝對益生菌增殖及大腸桿菌數量變化的影響摘 要：以植物乳桿菌和大腸桿菌 E.colik88 為指示菌株，研究了飼料的液態轉固態發酵與固態發酵兩種工藝在 20 與 30 兩種溫度下的 pH 值變化及菌數的動態變化。結果表明：30 溫度下，物料的酸度變化（pH 值）比 20 溫度時下降的速度快、幅度大；在固態發酵過程中，液態轉固態發酵的起始 pH 值低于固態發酵（P0.05），但液態轉固態發酵和固態發酵在發酵過程中 pH 值差異不顯著(P0.05)；在 30 的發酵溫度下，乳酸細菌數呈先增值后下降趨勢，但液態轉固態發酵與固態發酵之間差異不顯著(P0.05)；在液態轉固態發酵工藝下，大腸桿菌 E.colik88 菌數呈直線下降趨勢，而在固態發酵工藝下，大腸桿菌 E.colik88 菌數呈先升后降，證實液態轉固態工藝對原料中大腸桿菌直接產生抑菌作用。關鍵詞：益生菌；發酵工藝；乳酸菌數；抑菌特性隨著飼料中抗生素類生長促進劑在歐盟的全面禁用，飼料微生物發酵技術在動物生產中受到高度重視，歐盟已實現廣泛應用。飼喂微生物發酵飼料有提高動物生長性能和改善腸道健康的作用（Scholten 等，1999；Canibe 等 2007），荷蘭至少有 50的豬在飼喂發酵飼料，丹麥有 30以上的母豬飼喂發酵飼料，母豬泌乳期的使用更達 70%以上。另外，法國、瑞典、西班牙也陸續開始使用微生物發酵飼料。飼料發酵目前主要采用液態發酵和固態發酵兩種工藝，液態發酵（Submerged Fermentation,SmF）具有周期短、易控制、微生物的繁殖重復性強等優點，但需要配套昂貴的系統設備，難以被大眾所接受；固態發酵（Solid StateFermentation,SSF）具有培養基簡單，基料來源廣泛；投資少，能耗低，操作方便等優點，但勞動強度大，難以與現實規模化養殖生產所需的系列化日糧配合加工結合。為此，本課題設計飼料液態發酵轉固態發酵新工藝并展開了系列研究。試驗以植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum） 和致病性大腸桿菌 E.colik88 為指示菌株，研究在液態轉固態發酵飼料中目標益生菌和指示菌的動態變化情況，為建立適合我國養殖生產條件的生物發酵飼料新工藝提供科學依據。1 材料與方法1.1 試驗材料1.1.1 菌株來源植物乳桿菌由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所分離、鑒定并保存；大腸桿菌 E.colik88 購于中國獸醫藥品監察所。1.1.2 培養基選擇及菌株培養參照何濤等介紹的方法，植物乳桿菌采用 MRS培養基，大腸桿菌 E.colik88 采用伊紅美蘭培養基培養。1.1.3 主要儀器設備超凈工作臺（蘇州安泰 SW-CJ-1CU 型）、酸度計(上海理達 PHS-25C 型)、高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安ZDX-35BI 型）、恒溫培養箱 （黃石恒豐 SP-01 型）、微型發酵瓶(罐頭瓶)。1.1.4 發酵基料設計原則以生長后期仔豬配合飼料為發酵的基礎原料，即不含預混料的配合飼料（配方見表 1）。在此基礎上，制備如下三種發酵基料，固態發酵基料：為不含微量元素、維生素、礦物質的配合飼料；液態發酵基料：玉米、豆粕按質量分數 1： 3 混合均勻；液態轉固態發酵基料：為固態發酵基料中減去液態發酵基料的部分。飼料工業2011 年第 32 卷第 5 期試 驗 研 究30表 1 固態發酵基料配方原料名稱玉米豆粕魚粉麩皮膨化大豆比例（%）66183581.2 試驗方法1.2.1 試驗設計與方案采用 2 因子試驗設計。研究了2 種發酵溫度（20 ，T1；30 ，T2）下，不同發酵工藝（液態轉固態發酵和固態發酵）對 pH 值及菌落數的影響，設計方案見表 2。表 2 設計方案發酵溫度T1（20）T2（30）發酵工藝液態轉固態發酵固態發酵液態轉固態發酵固態發酵1.2.2 試驗操作方法1.2.2.1 液態轉固態發酵工藝操作方法第一階段（液態發酵）：稱取 20 g 液態發酵基料于微型發酵瓶中，以料水比 1： 3.5 加入 70 g 水，按106cfu/g 物料接入植物乳桿菌，在 25 的恒溫條件下靜置培養 48 h。第二階段（固態發酵）：直接在液態發酵料中加入80 g 的固態配合料，攪拌均勻，使終水分在 40%左右。并按每 106cfu/g 物料接種 E.colik88，密封置恒溫培養箱中培養。1.2.2.2 固態發酵工藝操作方法與液態轉固態發酵工藝的第二個階段同時進行，具體操作如下：稱取 20 g 液態發酵基料和 80 g 的固態配合料于微型發酵瓶中，加入一定質量的水，使終水分在 40%左右，按 106cfu/g 物料分別接種植物乳桿菌和 E.colik88，攪拌均勻，密封置恒溫培養箱中培養。1.2.3 指標測定分別于固態發酵開始后第 0、24、48、72、120、168 h無菌取樣，進行 pH 值和微生物的測定。pH 值測定：取鮮樣 10 g，用 100 ml 蒸餾水浸提 12 min 后，經紗布過濾，水浸液當即用酸度計測定 pH值。微生物測定采用 10 倍稀釋法，植物乳桿菌測定應用 MRS 瓊脂培養基，37 培養 36 h，大腸桿菌 E.colik88 測定采用 EMB 培養平板，37 培養 24 h。1.3 數據處理微生物及 pH 值數據采用 SAS6.12 的 t-test 過程進行兩組均數的差異顯著性檢驗。2 結果與分析2.1 發酵過程中 pH 值的動態變化2.1.1 不同發酵工藝對 pH 值的影響（見表 3）在發酵過程中，液態轉固態發酵起始（0 h）pH 值明顯優于固態發酵，差異顯著（P0.05）。在隨后的發酵時間里，2 個發酵溫度下，液態轉固態發酵和固態發酵 pH 值差異都不顯著(P0.05)。這主要是因為液態轉固態發酵工藝中接種的益生菌株植物乳桿菌發酵過程中產生的乳酸、乙酸等有機酸成分，在液態轉固態發酵時直接降低了飼料的 pH 值。因而隨著發酵時間的延長，pH 值趨向一致，所以差異不顯著。2.1.2 不同發酵溫度對 pH 值的影響（見圖 1）76543210pH值0 2448 72 120168液態轉固態發酵 T1液態轉固態發酵 T2固態發酵 T1固態發酵 T2時間（h）圖 1 不同發酵溫度對 pH 值的影響1684.050.05a3.960.04a3.940.03a4.010.02a表 3 不同發酵處理對 pH 值的影響05.820.02a6.400.03b5.820.02a6.400.03b244.540.10a4.490.01a4.220.04a4.190.01a484.280.06a4.290.05a3.970.03a3.960.05a724.150.02a4.150.02a3.860.01a3.870.02a1203.950.01a3.940.06a3.900.04a3.860.04aT1液態轉固態發酵固態發酵T2液態轉固態發酵固態發酵項目培養時間（h）注：同一溫度下同列標注字母不同者差異顯著（P0.05）。 下表同。楊雪海等：飼料發酵工藝對益生菌增殖及大腸桿菌數量變化的影響試 驗 研 究31從圖 1 可見，液態轉固態發酵和固態發酵在 T1、T2 兩個發酵溫度下隨發酵時間的延續均表現出逐漸下降的趨勢，在 120 h 時降到最低，隨后出現輕微的上升。在 24、48、72 h 三個時間點兩種發酵工藝的pH 值T2 明顯低于 T1（P0.05），在隨后的時間未表現出明顯的差異(P0.05)。2.2 發酵過程中植物乳桿菌菌數變化2.2.1 不同發酵工藝對植物乳桿菌菌數的影響（見表 4）從表 4 可知，發酵溫度為 20 （T1）時，48 h 以前2 種發酵工藝的植物乳桿菌菌數差異顯著 （P0.05），72 h 以后的各點差異不顯著；而發酵溫度為 30 （T2）時，24 h 以前 2 種發酵工藝的植物乳桿菌菌數差異顯著（P0.05），24 h 以后的各點差異不顯著。2.2.2 不同發酵溫度對植物乳桿菌菌數的影響（見圖 2）121086420菌數(logcfu/g)0 2448 72 120168液態轉固態發酵 T1液態轉固態發酵 T2固態發酵 T1固態發酵 T2時間（h）圖 2 不同發酵溫度對植物乳桿菌菌數的影響從圖 2 可知，在 72 h 以內，液態轉固態發酵和固態發酵植物乳桿菌數菌數在 T1、T2 發酵溫度下未表現明顯差異(P0.05)。但在隨后的發酵時間里，表現出顯著的差異（P0.05）。T1 發酵溫度下的植物乳桿菌菌數優于 T2 發酵溫度。2.3 發酵過程中 E.colik88 的菌數變化2.3.1 不同發酵工藝對 E.colik88 菌數的影響（見表 5）由表 5 可見，在 T1 發酵溫度下，液態轉固態發酵工藝和固態發酵工藝大腸桿菌 E.colik88 菌數表現出較大的差異。液態轉固態發酵大腸桿菌 E.colik88 呈直線下降趨勢，在 72 h 降到檢測限以下，固態發酵則表現為先上升后下降趨勢，固態發酵在 120 h 才降為檢測限以下。在 T2 發酵溫度下，2 種發酵工藝大腸桿菌 E.colik88 菌數在發酵 24 h 時差異顯著（P0.05)，隨后均降為檢測限以下。2.3.2 不同發酵溫度對 E.colik88 菌數的影響（見圖3）從圖 3 可見，液態轉固態發酵大腸桿菌 E.colik88 的菌數在 T1、T2 發酵溫度下，呈直線下降趨勢，在 T1 溫度下 72 h 降到檢測限以下，而在 T2 溫度下48 h 就降到了檢測限以下。固態發酵 E.colik88 菌數則表現為先上升后下降，在 T1 溫度下，48 h 達到最高值，隨后出現下降，120 h 降到檢測限以下，在 T2 溫度1689.590.17a9.540.20a8.910.12a8.930.09a表 4 不同發酵處理對植物乳桿菌菌數的影響（logcfu/g）08.200.20a6.150.15b8.200.20a6.150.15b249.530.10a9.410.11b9.630.23a9.490.14b489.620.08a9.470.09b9.590.09a9.570.21a729.630.23a9.540.14a9.600.18a9.530.05a1209.560.14a9.560.17a8.860.08a8.930.13aT1固態發酵液態轉固態發酵T2固態發酵液態轉固態發酵項目培養時間（h）1683.00.003.00.003.00.003.00.00表 5 不同發酵工藝對 E.colik88 菌數的影響（logcfu/g）06.000.12a6.000.12a6.000.12a6.000.12a245.960.15a7.000.05b4.400.20a6.850.15b485.100.08a8.300.15b3.00.003.00.00723.00.005.450.08a3.00.003.00.001203.00.003.00.003.00.003.00.00T1液態轉固態發酵固態發酵T2液態轉固態發酵固態發酵項目培養時間（h）注：“”表示當微生物的數目低于檢測限時，該微生物數目用檢測限表示。 大腸桿菌的檢測限為 3.0 logcfu/g。 數據以“平均值標準差”的形式表示。楊雪海等：飼料發酵工藝對益生菌增殖及大腸桿菌數量變化的影響試 驗 研 究32下，24 h 升到最高值，隨后降為檢測限以下。0 2448 72 1201689876543210E.colik88菌數(logcfu/g)液態轉固態發酵 T1液態轉固態發酵 T2固態發酵 T1固態發酵 T2時間（h）圖3 不同發酵溫度對 E.colik88 菌數的影響3 討論有些發酵飼料的加工并不是人為接種微生物，這種發酵叫做自然發酵。目前國外大多數液態發酵飼料采用這種發酵方式。但是自然發酵的方向不容易控制，結果可預見性比較差。微生物接種發酵做為一種新型的發酵方式，在優化的發酵條件下，可以產生預見性更強的發酵結果。因此本試驗比較了在不同的發酵溫度下，微生物接種后進行液態轉固態發酵和固態發酵兩種不同的發酵工藝對發酵過程中的 pH 值、乳酸菌菌數及 E.colik88 菌數的影響。3.1 酸化日糧能改善動物消化機能研究表明，只有動物消化道 pH 值穩定在適合的范圍內，才能維持正常的消化生理，pH 值過高能顯著地抑制胃蛋白原的活化，當 pH 值高于 6 時，胃蛋白就會失活。發酵飼料較低的 pH 值滿足動物的這種需要。試驗中液態轉固態發酵和固態發酵均能在 24 h 內使pH 值降到 4.5 以下，隨著發酵溫度的升高降低的幅度更大，并且相同時間內 30 的發酵溫度 pH 值要低于20 的。在固態發酵過程中，液態轉固態發酵起始 pH值優于直接固態發酵（P0.05），主要是因為在液態轉固態發酵工藝中，液態發酵產生的乳酸、乙酸等短鏈脂肪酸在轉固態發酵時具有明顯的酸化日糧的作用。3.2 發酵影響乳酸菌數乳酸菌由于其具有降低消化道內 pH 值、抑制其它病原性微生物生長、保持或恢復腸道內微生物群落的平衡、防病促生長等作用，現已被廣泛應用于食品加工、醫藥保健、飼料發酵及畜禽疾病防治等方面。有資料報道，益生菌發揮功能的最低劑量為 6 logcfu/g，因此，其數量就成為各種產品追求的主要指標。本次試驗中，液態轉固態發酵和固態發酵乳酸菌數均達到了9.5 logcfu/g 左右，這與 Van Winsen(2002)、Demeckova(2006)等所報道的乳酸細菌數 9.4 logcfu/g 相一致。在固態發酵的初始階段，液態轉固態發酵工藝乳酸菌數優于直接固態發酵（P0.05），隨后無明顯差異 (P0.05)。這是因為在液態轉固態發酵工藝中液態發酵過程使乳酸菌得到大量的增值，所以在轉固時較直接固態發酵乳酸菌數占明顯優勢，隨著發酵的過程進行乳酸細菌數趨向一致。3.3 發酵過程中不同菌增殖特點飼料和水接觸后，發酵即開始。在發酵的起始階段，發酵飼料以低的乳酸菌含量、高的 pH 值和大腸桿菌的增值為特點。隨后發酵將進入一個穩定階段，以高的乳酸菌和低的大腸桿菌含量為特點。試驗中固態發酵大腸桿菌 E.colik88 出現先增殖后下降的趨勢，這與 Jensen（1998）、Canibe（2003）報道的相一致。而液態轉固態發酵指示菌株 E.colik88 成直線下降趨勢，對 E.colik88 有明顯的抑制作用。這可能是在液態發酵過程中，接種的