細胞融合概述 細胞融合 cellfusion 又稱體細胞雜交 somatichybridiazation 是指兩個或更多個相同或不同細胞通過膜融合形成單個細胞的過程 一 細胞融合的定義 Muller于1838年觀察到脊椎動的腫瘤細胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細胞 Virchow于1858年描述了正常組織 發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細胞現(xiàn)象 Luginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細胞存在 Lange于1875年第一個觀察到脊椎動物 蛙類 的血液細胞發(fā)生融合的過程 Cienkawski 1876 Buck 1877 Geddes 1880 在無脊椎動中發(fā)現(xiàn)了細胞合并現(xiàn)象 1958年日本學者岡田 Okada 發(fā)現(xiàn)仙臺病毒具有觸發(fā)動物細胞融合的效應(yīng) 1974年華裔加拿大學者高國楠創(chuàng)立了聚乙二醇 PEG 化學融合法 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B 淋巴細胞和骨髓瘤細胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細胞 20世紀80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù) 二 細胞融合研究進展 幾種細胞融合成功的例子 植物融合細胞成長狀態(tài)對比 右瓶為地面融合的細胞 左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細胞 動物細胞融合實驗使用的小白鼠 三 動植物細胞的融合過程 植物細胞融合過程 人造小鼠培育過程示意圖 四 細胞融合的意義 理論上說任何細胞 都有可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源 這對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠的意義 融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制 為遠緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑 體細胞雜交產(chǎn)生的雜種細胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng) 在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體 線粒體DNA亦可發(fā)生重組 從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng) 淋巴細胞雜交瘤和單克隆抗體的制備 細胞融合的基本原理 顯微鏡下細胞融合過程 融合過程中兩個細胞膜從彼此接觸到破裂形成細胞橋的變化過程圖解 用滅活的病毒誘導(dǎo)的動物細胞融合過程示意圖 細胞融合的常用方法 一 仙臺病毒法 仙臺病毒誘導(dǎo)細胞融合經(jīng)四個階段 兩種細胞在一起培養(yǎng) 加入病毒 在4 條件下病毒附著在細胞膜上 并使兩細胞相互凝聚 在37 中 病毒與細胞膜發(fā)生反應(yīng) 細胞膜受到破環(huán) 此時需要Ca2 和Mg2 最適PH為8 0一8 2 細胞膜連接部穿通 周邊連接部修復(fù) 此時需Ca2 和ATP 融合成巨大細胞 仍需ATP 病毒促使細胞融合的主要步驟如下 兩個原生質(zhì)體或細胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近 通過病毒與原生質(zhì)體或細胞膜的作用使兩個細胞膜間互相滲透 胞質(zhì)互相滲透 兩個原生質(zhì)體的細胞核互相融合 兩個細胞融為一體 進入正常的細胞分裂途徑 分裂成含有兩種染色體的雜種細胞 用滅活的病毒誘導(dǎo)的動物細胞融合過程示意圖 優(yōu)點是易得 用法簡單 融合效果穩(wěn)定 聚乙二醇 PEG 結(jié)構(gòu)為 HOH2C CH20CH2 nCH2OH 分子量大于200小于6000者均可用作細胞融合劑 PEG濃度以W W 如將10克PEG與10mlEagLe氏液混合 假定1ml培養(yǎng)液為1g重 即成50 PEG溶液 PEG經(jīng)高壓滅菌后 與溫熱的Engle氏液混合 通常用分子量低于1000的PEG作融合劑最好 50 PEG溶液能產(chǎn)生最多雜交細胞 PEG溶液在pH6 0時細胞融合率最高 二 聚乙二醇 PEG 法 聚乙二醇 PEG 法細胞融合過程 PEG的作用機理 Kao等認為 由于PEG分子具有輕微的負極性 故可以與具有正極性基團的水 蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵 從而在在質(zhì)膜之間形成分子橋 其結(jié)果是使細胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進而促使質(zhì)膜的融合 另外 PEG能增加類脂膜的流動性 也使細胞的核 細胞器發(fā)生融合成為可能 PEG誘導(dǎo)融合的特點 其優(yōu)點是融合成本低 勿需特殊設(shè)備 融合子產(chǎn)生的異核率較高 融合過程不受物種限制 其缺點是融合過程繁瑣 PEG可能對細胞有毒害 聚乙二醇 PEG 法細胞融合步驟 1 將兩種不同親本細胞各5 l06混勻 2 離心沉淀 吸去上清液 3 加1ml50 PEG溶液 用吸管吹打 使之與細胞接觸1分鐘 4 加9ml培養(yǎng)液 離心沉淀 吸去上清液 5 加5ml培養(yǎng)液 分別接種5個直徑60mm平皿 每個平皿加培養(yǎng)液至5ml 37 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6 6 24小時后 換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細胞 三 電融合法 電融合法是80年代出現(xiàn)的細胞融合技術(shù) 在直流電脈沖的誘導(dǎo)下 細胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變 使異種細胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂 進而質(zhì)膜開始連接 直到閉和成完整的膜 形成融合體 電融合法的優(yōu)點 融合率高 重復(fù)性強 對細胞傷害小 裝置精巧 方法簡單 可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程 免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程 誘導(dǎo)過程可控性強 電融合的基本過程 細胞膜的接觸 當原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時 電場通電后 電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液 其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子 從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串 膜的擊穿 原生質(zhì)體成串排列后 立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿 從而導(dǎo)致兩個緊密接觸的細胞融合在一起 電融合誘導(dǎo)法原理示意圖 雜種細胞的篩選 雜種細胞的篩選 原理 兩種親本細胞融合的混合物中可能有多種類型細胞 篩選的目的是獲得優(yōu)良的雜種細胞 1 親本2 同核體 同源原生質(zhì)體的融合體3 異核體 非同源的原生質(zhì)體的融合體4 多核體 含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體5 異胞質(zhì)體 具有不同胞質(zhì)來源的雜合細胞 6 核質(zhì)體 有細胞核而帶有少量細胞質(zhì)的亞原生質(zhì)體 基于酶缺陷型細胞和藥物抗性所建立的雜種篩選基于營養(yǎng)缺陷型細胞所建立的雜種篩選由溫度敏感型細胞組成的雜種細胞的篩選具有所需性狀雜種細胞的篩選 常用的雜種細胞篩選方法 植物細胞篩選方式 1 遺傳互補篩選法 利用每一親本貢獻一個功能正常等位基因 糾正另一親本的缺陷 令雜種細胞表現(xiàn)正常 如親本1 葉綠體缺陷型親本2 光致死型兩親本在光照下一種死亡 另一種呈白色 融合細胞長成植株呈綠色 并能成長 2 抗性互補篩選法 利用親本細胞原生質(zhì)體對抗生素 除草劑及其它有毒物質(zhì)抗性差異選擇雜種細胞 如 親本1 對放線菌素D抗性 但在MS培養(yǎng)基上不能超過50個世代親本2 對放線菌素D很敏感 但能在MS上生長雜種細胞能在含有放線菌素的MS培養(yǎng)基上生長 而親本和其它細胞死亡 3 利用物理特性篩選法 根據(jù)親本的原生質(zhì)體大小 顏色 漂浮密度及電泳遷移率 形成的愈傷組織的差異篩選雜種細胞 親本1 用異硫氰酸熒光素染色原生質(zhì)體親本2 葉肉細胞原生質(zhì)體在熒光顯微鏡下 親本1為紅色 親本2為綠色 雜種細胞可以區(qū)分 4 利用生長特性篩選法 利用原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細胞 例如粉蘭煙草與朗氏煙草細胞原生質(zhì)體均需外源激素才能生長 但其融合細胞可以產(chǎn)生內(nèi)源激素 在培養(yǎng)基上不需加激素 動物細胞的篩選方式 1 利用抗藥性篩選系統(tǒng) 利用生物細胞對藥物敏感性差異篩選雜種細胞 親本A 對氨芐青霉素敏感 對卡娜霉素不敏感親本B 對卡娜霉素敏感 對氨芐青霉素不敏感雜種細胞可以在含有兩種抗生素的培養(yǎng)基上生長 2 營養(yǎng)互補篩選系統(tǒng) 細胞在缺乏一種或幾種營養(yǎng)成分時 不能生長繁殖 即營養(yǎng)缺陷型細胞 利用兩種親本細胞營養(yǎng)互補作用原理可以篩選雜種細胞 親本A 色氨酸缺陷型親本B 蘇氨酸缺陷型雜種細胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng) 而親本細胞均會死亡 3 溫度敏感突變型雜種細胞的篩選 一般的培養(yǎng)細胞能在32度到40度的范圍內(nèi)生長 但溫度敏感突變型的細胞能在高溫或低溫下生長 由此篩選雜種細胞 親本一 具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生長 親本二 高溫敏感突變型 但不能抗卡娜霉素 雜種細胞能在高溫和含卡娜霉素的培養(yǎng)基上生長 1雜種細胞的遺傳特性和應(yīng)用2雜種細胞在細胞生物學研究中的應(yīng)用3雜種細胞在植物育種中的應(yīng)用 1雜種細胞在細胞生物學研究中的應(yīng)用 1 基因定位不同種屬的細胞融合時 常會出現(xiàn)一個親本細胞的染色體被優(yōu)先排除 而另一個親本的染色體被選擇性留下 即染色體分離的現(xiàn)象 由此 可根據(jù)表型和與表型特征相對應(yīng)的基因在特定染色體上 例如 HGPRT 人細胞與TK 的小鼠細胞融合后 可用HAT培養(yǎng)基分離得到一種僅含一條人E組染色體的雜種細胞 具有TK活性 由此得到人的TK基因是在E組染色體上的 2 體細胞雜種的致瘤性分析通過正常二倍體細胞和致瘤性或病毒轉(zhuǎn)化細胞的融合來進行致瘤性的遺傳分析 3 遺傳缺陷的基因互補基于雜種細胞的基因互補作用 可分為基因間和基因內(nèi)的互補作用 即雜種細胞可以具有兩種親本在遺傳上缺陷的基因表型 通過這種基因互補 可以用正常基因來治療由于基因突變或基因缺失的疾病 4 分化功能表達調(diào)控的研究通過細胞融合可將不同分化狀態(tài)或組織類型的細胞構(gòu)建成為能夠存活的種內(nèi)或種間雜種 同時對雜種細胞內(nèi)的基因組和胞質(zhì)觀察和分析 了解如何通過相互作用而最終導(dǎo)致原先表達的分化性狀熄滅或保留 2雜種細胞在植物育種中的應(yīng)用 雜種細胞是一條新的育種途徑 可以產(chǎn)生新經(jīng)濟性狀的良種 科學家已經(jīng)在禾本科 茄科 豆科 十字花科等植物中得到了雜種再生植株 一些近親植物 有性不親和的組合 如馬鈴薯 番茄等都得到了再生植株 目標 地上和地下部兼用種 固氮禾等具有兩種不同優(yōu)勢性狀的新品種 3 細胞融合技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用 1 酵母菌的育種 2 氨基酸生產(chǎn)菌的育種 3 酶制劑生產(chǎn)菌株的育種 思考 1 植物雜種細胞篩選有哪些方法 2 動物雜種細胞篩選有哪些方法 3 促進細胞融合的方法有哪些 各自的優(yōu)缺點及應(yīng)用 細胞雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體 一 何謂單克隆抗體 只針對某一抗原決定簇的抗體分子稱為單克隆抗體 單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細胞 myelomacell 與經(jīng)特定抗源免疫刺激的B淋巴細胞 antigenstimulatedBlymphoblast 融合得到雜交瘤細胞 hybridomacell 雜交瘤細胞既能象骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖 又具有B淋巴細胞產(chǎn)生特異性抗體的能力 因此 單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù) hybridomatechnology NielsK Jerne G Kohler C Milstein 二 雜交瘤技術(shù)的基本原理 三 雜交瘤細胞的制備 一 骨髓瘤細胞選擇及選擇性培養(yǎng)基 骨髓瘤細胞本身不能分泌抗體選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型 HGPRT 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型 TK HAT培養(yǎng)基 次黃嘌呤 hypoxanthine H 氨基喋呤 aminopterin A 胸腺嘧啶脫氧核苷 thymidine T 次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型 HGPRT 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型 TK 二 免疫小鼠 免疫程序是取6 8周齡Balb C雌鼠 基礎(chǔ)免疫2周 靜脈再加強免疫一次 3 5天后用于融合 免疫時是否采用佐劑和事先處理抗原 要依抗原性的強弱而定 一般來講可溶性抗原用完全佐劑效果較好 抗原量同樣與抗原強弱有關(guān) 以IgG為例 第一次為loo g 第二次為50 g 免疫途徑第一次可經(jīng)腹腔注射 對于細胞性抗原不用佐劑 每次腹腔注射1 l06一1 107 三 脾細胞的制備 1 引頸處死小鼠 用酒精消毒體表 2 無菌條件下取出脾臟 剃除結(jié)締組織和脂肪 用5ml無血清培養(yǎng)液沖洗一次 3 把脾臟置于已消毒的90一100目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中 4 在脾中部切開一小口 用注射器芯從一端輕輕壓擠 再用無血清培養(yǎng)液沖洗 令細胞通過紗網(wǎng) 收集入平皿中 或用注射器向脾臟內(nèi)注入3ml無血清培養(yǎng)液 反復(fù)抽吸數(shù)次方法獲取細胞 再制成細胞懸液亦可 5 把細胞懸液注入50ml離心管中 加l0一20ml培養(yǎng)液 輕輕吹打數(shù)次 室溫中置5分鐘 6 離心 800一1000轉(zhuǎn) 分 計數(shù) 備用 四 細胞準備 1 收集骨髓瘤細胞 用無血清培養(yǎng)液洗3次 37 計數(shù)活力細胞 不少于90 2 收集小鼠脾細胞 用無血清培養(yǎng)液洗3次 37 并計細胞數(shù)和測定活力細胞 3 按1 5或1 10混合脾細胞和骨髓瘤細胞后 離心棄去上清 并以消毒濾紙吸凈多余上清 五 細胞融合 1 將1ml40 的PEG液一滴滴加入列細胞團中 在60秒內(nèi)加完 同時并不斷輕微轉(zhuǎn)動離心管或用手指輕彈離心管 2 在不斷轉(zhuǎn)動離心管中加1ml無血清培養(yǎng)液 60秒鐘內(nèi)加完 3 于5分鐘內(nèi)慢慢加完20ml無血清培養(yǎng)液 此時細胞對機械損傷非常敏感 4 離心 800轉(zhuǎn) 分 8分鐘 去上清 用完全培養(yǎng)液10ml懸浮 輕輕混勻 5 取96孔板 每孔加50 l 6 取等體積細胞懸液 向另一96孔板中加50P1 7 送入5 CO2 溫箱中37 培養(yǎng) 24小時后更換成HAT選擇性培養(yǎng)掖 六 融合后細胞培養(yǎng) 1 融合后7 10天用HAT培養(yǎng)液半量換液 留一半舊的加一半新的 后每隔2 3天半量換液一次 2 兩周后可改用HA培養(yǎng)液半量換液 或仍用HAT培養(yǎng)液 3 2 3周后出現(xiàn)雜交細胞集落 細胞個大 圓且透明 4 待集落增殖生長至1 3孔時 應(yīng)進行抗體檢測 HAT培養(yǎng)基 次黃嘌呤 hypoxanthine