程論文（作業）封面（ 2011 至 2012 學年度 第 2 學期）課 程 名 稱：_ _課 程 編 號：_學 生 姓 名：_ _學 號：_年 級：_ _ 任 課 教 師: _ _提 交 日 期： 年 月 日成 績：_教 師 簽 字：_開課-結課：第 周-第 周評 閱 日 期： 年 月 日植物的功能基因組學研究進展摘要: 基因組研究計劃包括以全基因組測序為目標的結構基因組學和以基因功能鑒定為目標的功能基因組學兩方面的內容。目前基因功能鑒定的方法主要有:基因表達的系統分析(SAGE) 、cDNA 微陣列、DNA(基因) 芯片、蛋白組技術以及基于轉座子標簽和T-DNA 標簽的反求遺傳學技術等。本文對上述各種技術的優缺點以及它們在植物基因功能鑒定中的應用進行了綜述。關鍵詞:功能基因組學; 基因表達的系統分析;cDNA 微陣列;DNA 芯片;蛋白組以擬南芥和水稻為代表的植物基因組研究已取得了迅速的進展,到目前為止,占擬南芥基因組(100Mb) 近三分之一的DNA 序列已被測定并在GenBank 數據庫中登記注冊,預期到2001 年通過全球合作將完成擬南芥全基因組的序列測定工作。隨著植物基因組計劃的實施和進展,GenBank 中累積了大量的未知功能的DNA 序列,如何鑒定出這些基因的功能將成為基因組研究的重點課題, 因此, 基因組研究應該包括兩方面的內容: 以全基因組測序為目標的結構基因組學(structural genomics) 和以基因功能鑒定為目標的功能基因組研究, 后者往往又被稱為后基因組研究。功能基因組研究的內容是利用結構基因組所提供的信息, 發展和應用新的實驗手段系統地分析基因的功能1 。目前人類和酵母的功能基因組研究已經全面展開, 尤其是對已完成全基因組測序的酵母來說, 其功能基因組研究任務更加緊迫。植物的基因組研究雖然起步較晚, 但由于吸取了人類基因組研究中積累的一些經驗, 所以進展也相當迅速, 對植物功能基因組學的研究目前也已經受到重視, 在1998 年12月出版的最新一期Plant Cell (10 :1771) 和Plant Physiol . (118 :713) 上均編發了關于植物功能基因組學研究的編者按, 并由Bouchez 和Hofte (1998) 2 綜述了植物尤其是擬南芥功能基因組學研究的現狀, 本文在此基礎上綜述了目前植物功能基因組學研究中使用的主要技術手段以及最新的研究進展。1 基因功能的含義基因的功能主要包括: 生物化學功能, 如作為蛋白質激酶對特異的蛋白質進行磷酸化修飾; 細胞學功能, 如參與細胞間和細胞內的信號傳遞途徑; 發育上的功能, 如參與形態建成等。目前,獲得一段DNA 序列的功能信息的最簡單的方法是將該DNA 序列與GenBank 中公布的基因序列進行同源性比較,如利用BLASTn 和BLASTx 兩種軟件分別進行核苷酸和氨基酸序列同源性比較等。同源性比較的結果大體可以分為如下類型: 與生化和生理功能均已知的基因具同源性; 與生化功能已知的基因具同源性, 但該基因的生理功能未知;與其它物種中生化和生理功能均未知的基因具同源性; 雖與生化和生理功能均已知的基因具同源性, 但對該基因功能的了解尚不深入, 仍停留在表觀現象上。上述同源性檢索分析方法僅僅為該DNA 片段的功能提供了間接的證據,對基因功能的直接證據還需要實驗上的數據。Bouchez 和Hofte (1998)2 將所需要的實驗證據歸納如下: (1) 通過研究基因的時空表達模式確定其在細胞學或發育上的功能, 如在不同細胞類型、不同發育階段、不同環境條件下以及病原菌侵染過程中mRNA 和/ 或蛋白質的表達的差異等。(2) 研究基因在亞細胞內的定位和蛋白質的翻譯后調控等。(3) 利用基因敲除(knock - out) 技術進行功能喪分析或通過基因的過量表達(轉基因) 進行功能獲(gain2of2function) 分析,進而研究目的基因與表型性狀間的關系。(4) 通過比較研究自發或誘發突變體與其野生型植株在特定環境條件下基因表達的差異來獲取基因功能的可能信息。2 植物的表達序列標記(EST) 與基因組大規模測序通過從cDNA 文庫中隨機挑取的克隆進行測序所獲得的部分cDNA 的5或3端序列稱為表達序列標記( EST) ,一般長300500bp 左右, 利用EST作為標記所構建的分子遺傳圖譜被稱為轉錄圖譜。目前植物EST計劃主要集中在擬南芥3 5 和水稻6 上,其他植物的EST相對較少,截止到1998 年12 月底,在美國國家生物技術信息中心(NCBI) 數據庫中公布的各種植物EST的數目總和已達幾萬條(見表1) 。這些EST不僅為植物基因組遺傳圖譜的構建提供了大量的分子標記, 而且來自不同組織和器官的EST也為基因的功能研究提供了有價值的信息,此外,EST計劃還為基因的鑒定提供了候選基因(candidates) 。EST計劃的一個不足之處在于通過隨機測序有時難以獲得那些低豐度表達的基因和那些在特殊環境條件下(如生物脅迫和非生物脅迫) 誘導表達的基因,因此為了彌補EST計劃的不足, 必須開展基因組測序計劃。通過分析基因組序列能夠獲得基因組結構的完整信息, 如基因在染色體上的排列順序, 基因間的間隔區結構, 啟動子的結構以及內含子的分布等。3 植物基因的功能分析方法基因的時空差異表達是植物發育、分化、衰老和抗逆等生命現象的分子基礎。基因在不同組織、不同器官以及不同環境條件下的差異表達特征, 為基因的功能提供了重要的信息。Velculescu 等(1997) 12 將在特定組織或細胞內轉錄的所有基因及其表達豐度稱為轉錄組(transcriptome) , 因此在轉錄水平上進行的基因表達差異分析實際上就是進行轉錄組研究。經典的減法雜交(subtractive hybridization) , 差示(differentialscreening) , cDNA 代表差異分析(representative difference analy2sis ,RDA) 以及mRNA 差異顯示(differential display) 等技術已被廣泛用于鑒定和克隆差異表達的基因, 但是這些技術不能勝任對大量的植物基因進行全面、系統的分析, 于是, 基因表達的系統分析(serial analysis of gene expression , SAGE) 、cDNA 微陣列(cDNA microarray) 和DNA芯片(DNA chip) 等能夠大規模地進行基因差異表達分析的技術應運而生。3. 1 基因表達的系統分析( SAGE)SAGE 技術的主要理論依據是: 來自cDNA 3端特定位置的一段911bp 長的序列能夠區分基因組中95 %的基因。這一段基因特異的序列被稱為SAGE標簽(SAGE tag) 。通過對cDNA 制備SAGE 標簽并將這些標簽串聯起來, 然后對上述串聯起來的SAGE 標簽進行測序不僅可以顯示各SAGE標簽所代表的基因在特定組織中是否表達, 還可以根據各SAGE 標簽所出現的頻率作為其所代表的基因表達豐度的指標13 。應用SAGE技術的一個必要前提是GenBank 中必須有足夠的某一物種的DNA 序列資料,尤其是EST序列資料。目前該技術在人類14 和酵母12 基因組研究中已得以應用,但是尚未用于植物基因組研究。SAGE 技術的不足是不能夠檢測出稀有轉錄物。3. 2 cDNA 微陣列和DNA 芯片技術cDNA 微陣列和DNA 芯片都是基于reverse Northern 雜交以檢測基因表達差異的技術。二者的基本思路都是首先把cDNA , 或EST, 或基因特異的寡聚核苷酸固定在固相支持物上, 并與來自不同細胞、組織或整個器官的mRNA 反轉錄生成的第一鏈cDNA 探針進行雜交, 然后用特殊的檢測系統對每個雜交點進行定量分析, 理論上雜交點的強度基本上反映了其所代表的基因在不同細胞、組織或器官中的相對表達豐度。這兩項技術的優點是可以同時對大量基因, 甚至整個基因組的基因的表達差異進行對比分析。cDNA 微陣列技術是Schena 等(1995) 15 發展起來的,其主要優點是: 靈敏度極高,mRNA 豐度低至10 萬分之一仍能被檢測出; 使用幾種不同顏色的熒光染料標記探針, 這樣在同一張陣列膜上進行一次雜交實驗就可以同時分析不同細胞間或不同環境脅迫下基因表達的差異。cDNA 微陣列技術的主要不足是成本非常高,如需要機器人點膜和特殊的信號檢測分析系統, 點在玻璃片上的array 不能重復使用等。最近,Desprez 等(1998)16 和胡玉欣等(中科院遺傳所,私人交流) 分別獨立發展了利用尼龍膜作固相支持物和使用同位素標記探針進行雜交的cDNA 表達陣列技術,從而降低了成本,但檢測的靈敏度卻降低了(萬分之一) 。DNA 芯片技術是Affymetrix 公司率先研制出來的, 該技術利用結合化學手段在玻璃固相支持物上原位合成大量的基因特異的寡聚核苷酸, 并與熒光標記的探針進行雜交, 再利用特殊的檢測系統進行信號分析, 就可以獲得基因的時空差異表達譜,最近Ramsay (1998) 17 對DNA 芯片技術的原理和應用進行了較全面的介紹,這里不再贅述。3. 3 蛋白組( proteome) 研究轉錄不是基因表達的最終結果, 基因功能的實現最終是以蛋白質的形式體現的, 因此, 在轉錄水平上所獲取的基因表達的信息有時并不足以揭示該基因在細胞內的確切功能。蛋白組指的是由基因組表達產生的總蛋白質的統稱, 由英文單詞protein 的前半部加上單genome 的后半部組合而成。蛋白質雙向電泳是目前蛋白組研究的首選技術18 , 但是該技術在以下方面尚需改進: 分辨率和可重復性; 蛋白質斑點的自動定量檢測系統, 以及蛋白質N端和內部氨基酸序列測定技術等。利用蛋白質雙向電泳技術對基因敲除(knock - out) 突變體或轉基因重組體與野生型個體間雙向電泳蛋白圖譜的差異進行對比分析就可以對目的基因的功能進行分析。在植物上該技術已被用來分離新的基因, Damerval 等(1998) 19 分析了玉米Opaque2 基因的近等基因系之間的雙向電泳蛋白圖譜的差異, 結果鑒定克隆了一個新的轉錄激活因子基因。對水稻鹽脅迫處理和ABA 處理前后的雙向電泳蛋白圖譜進行的對比分析同樣克隆了幾個與水稻耐鹽性相關的胚胎晚期豐富蛋白(lea) 基因20 ,21 。3. 4 反求遺傳學研究傳統的遺傳學或稱為正向遺傳學(forward genetics) 主要研究自發或誘發突變體中某一突變性狀的遺傳行為, 如控制突變性狀的基因的數目及其在染色體上的位置、突變性狀在后代中的傳遞規律等。反求遺傳學(reverse genetics) 是在已知基因序列的基礎上研究基因的生物學功能, 一般通過創造功能喪失(loss-of-function) 突變體并研究突變所造成的表型效應。在微生物和小鼠中可以通過同源重組的方法用突變的基因取代野生型基因創造功能喪失突變體進行反向遺傳學研究, 但在植物中很難進行同源重組試驗22 , 不過植物中有成熟的轉座子標簽(transposon tagging) 系統和T-DNA 標簽系統,而且目前已經獲得了擬南芥、金魚草、番茄、玉米和水稻等植物的轉座子插入誘變的突變體群體, 以及T-DNA 插入誘變了的擬南芥突變體群體。從這些突變體群體中篩選出特異基因被突變了的植株, 并對突變株進行表型分析將有助于揭示目的基因的生物學功能。篩選突變體的常用方法是利用PCR 技術,這是在果蠅23 和線蟲( C. elegans) 24 中發展起來的比較成熟的方法, 其基本思路是根據目的基因的序列設計一個引物, 再根據插入元件(轉座子或T- DNA) 的序列設計第二個引物, 用上述引物對突變體群體進行PCR 擴增, 由于只有目的基因插入轉座子或T-DNA 的突變體才有PCR 擴增產物,這樣根據擴增產物的有無就可以很容易地從數以千計的突變體群體中篩選出所需要的突變體。該技術已經在矮牽牛25 、玉米26 ,27 和擬南芥28 35 等植物中得以成功應用。但是對數以千計的材料進行PCR 反應工作量十分巨大, 為克服這一困難,Winkler 等(1998)33 設計了利用DNA 混合池(pooling) 進行突變體篩選的實驗程序, 結果只需要進行36 個PCR 反應就可以從由6000 個突變體組成的群體中篩選出單個的突變株,大大減輕了篩選的工作量,同時這些突變體的DNA 樣品及構建的DNA 池也可以向其他研究者免費提供。當然,要對基因組中所有的基因進行功能分析所需要的突變體的數目也是十分可觀的, 理論上, 要達到95 %的概率使基因組中每一個基因均因插入元件而致突變, 則所構建的突變體群體中個體的數量至少應為該植物基因總數的5 倍左右。在進行反求遺傳學研究時, 有時篩選出來的突變體在正常生長條件下并不表現出突變的表型效應, 這種情況一方面可能是由于突變的表型效應需要在特定的生長環境中才能得以表現出來,如擬南芥的鉀離子通道基因突變體Akt1 只有在缺鉀的培養條件下才表現出突變的表型效應35 。另一方面, 植物基因組中有些基因是以基因家族的形式存在的, 即存在基因冗余, 這樣只要基因家族中有一個成員未發生插入突變, 該基因的表達就能夠補償其他家族成員由于發生突變所造成的功能喪失效應。因此, 對植物的家族基因的功能進行反求遺傳學研究時必須對該基因家族中的各個成員均已發生插入突變的突變株進行表型分析, 才能揭示該基因家族的生物學功能。植物的功能基因組學研究才剛剛開始, 上述的各種技術手段都各有優缺點,隨著植物基因組研究的進展和深入,在完善現有的研究手段的同時, 還必須發展一些新的基因功能的研究技術,同時加強國際間的學術和材料交流,建立全球共享的植物基因組數據庫系統, 以最終闡明植物基因組的結構與功能。另外,進一步的研究應從模式植物擬南芥的基因組研究轉向作物的基因組研究,為作物的遺傳改良作出貢獻。參考文獻:1Hieter P , Boguski M. Functional genomics : it s all how you read itJ. Science ,1997 ,278 :601602.2Bouchez D ,Hofte H. Functional genomics in plantsJ. Plant Physi2ol . ,1998 ,118 :725732.3Hofte H, et al. An inventory of 1151 expressed sequence tags obtainedby partial sequencing of cDNAs from Arabidopsis thalianaJ. PlantJ ,1993 ,4 :10511061.4Newman T, et al. Genes galore :a summary of methods for accessingresults from large2scale partial sequencing of anonymous ArabidopsiscDNA clonesJ. Plant Physiol ,1994 ,106 :12411255.5Cooke R , et al. Further progress towards a catalogue of all Arabidop2s2isgenes : analysis of a set of 5 000 non2redundent ESTsJ. Plant J ,1996 ,9 :101124.6Yamamoto K,Sa