一超臨界流體萃取（SFE）1.超臨界流體萃取分離過程的原理是利用超臨界流體的溶解能力與其密度的關系，即利用壓力和溫度對超臨界流體溶解能力的影響而進行的。在超臨界狀態下，將超臨界流體與待分離的物質接觸，使其有選擇性地把極性大小、沸點高低和分子量大小的成分依次萃取出來。當然，對應各壓力范圍所得到的萃取物不可能是單一的，但可以控制條件得到最佳比例的混合成分，然后借助減壓、升溫的方法使超臨界流體變成普通氣體，被萃取物質則完全或基本析出，從而達到分離提純的目的，所以超臨界流體萃取過程是由萃取和分離組合而成的。2. 超臨界流體萃取過程簡介將萃取原料裝入萃取釜。采用二氧化碳為超臨界溶劑。二氧化碳氣體經熱交換器冷凝成液體，用加壓泵把壓力提升到工藝過程所需的壓力(應高于二氧化碳的臨界壓力)，同時調節溫度，使其成為超臨界二氧化碳流體。二氧化碳流體作為溶劑從萃取釜底部進入，與被萃取物料充分接觸，選擇性溶解出所需的化學成分。含溶解萃取物的高壓二氧化碳流體經節流閥降壓到低于二氧化碳臨界壓力以下進入分離釜(又稱解析釜)，由于二氧化碳溶解度急劇下降而析出溶質，自動分離成溶質和二氧化碳氣體二部分，前者為過程產品，定期從分離釜底部放出，后者為循環二氧化碳氣體，經過熱交換器冷凝成二氧化碳液體再循環使用。整個分離過程是利用二氧化碳流體在超臨界狀態下對有機物有特異增加的溶解度，而低于臨界狀態下對有機物基本不溶解的特性，將二氧化碳流體不斷在萃取釜和分離釜間循環，從而有效地將需要分離提取的組分從原料中分離出來。3.超臨界流體萃取與化學法萃取相比有以下突出的優點： (1)可以在接近室溫(35-40)及CO2氣體籠罩下進行提取，有效地防止了熱敏性物質的氧化和逸散。因此，在萃取物中保持著藥用植物的全部成分，而且能把高沸點，低揮發度、易熱解的物質在其沸點溫度以下萃取出來； (2)使用SFE是最干凈的提取方法,由于全過程不用有機溶劑,因此萃取物絕無殘留溶媒,同時也防止了提取過程對人體的毒害和對環境的污染,是100%的純天然； (3)萃取和分離合二為一，當飽含溶解物的CO2-SCF流經分離器時，由于壓力下降使得CO2與萃取物迅速成為兩相（氣液分離）而立即分開，不僅萃取效率高而且能耗較少，節約成本； (4)CO2是一種不活潑的氣體,萃取過程不發生化學反應,且屬于不燃性氣體,無味、無臭、無毒，故安全性好； (5)CO2價格便宜，純度高，容易取得，且在生產過程中循環使用，從而降低成本；(6)壓力和溫度都可以成為調節萃取過程的參數。通過改變溫度或壓力達到萃取目的。壓力固定，改變溫度可將物質分離；反之溫度固定，降低壓力使萃取物分離，因此工藝簡單易掌握，而且萃取速度快。 4 從超臨界流體性質看，其具有的特點：(1)萃取速度高與液體萃取，特別適合于固態物質的分離提取；(2)在接近常溫的條件下操作，能耗低于一般精餾發，適合于熱敏性物質和易氧化物質的分離；(3)傳熱速率快，溫度易于控制；(4)適合于揮發性物質的分離二高效液相色譜法（HPLC）反相柱（流動相極性大于固定相）極性大的先流出 C18正相柱（流動相極性小于固定相）極性小的先流出 硅膠 1.高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。2.高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要氣化，因此不受試樣揮發性的限制。對于高沸點、熱穩定性差、相對分子量大（大于 400 以上）的有機物（ 些物質幾乎占有機物總數的 75% 80% ）原則上都可應用高效液相色譜法來進行分離、分析。因而廣泛應用于核酸、肽類、內酯、稠環芳烴、高聚物、藥物、人體代謝產物、表面活性劑，抗氧化劑、殺蟲劑、除莠劑的分析等物質的分析。 3.HPLC與經典液相色譜相比有以下優點和缺點：速度快通常分析一個樣品在1530 min，有些樣品甚至在5 min內即可完成。分辨率高可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。靈敏度高紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。色譜柱可反復使用用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收樣品經過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。缺點：高效液相色譜的缺點是有“柱外效應”。在從進樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質的任何擴散和滯留都會顯著地導致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。4.組成：高效液相色譜儀主要有進樣系統、輸液系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統組成。檢測系統：高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。 （1）紫外檢測器 該檢測器適用于對紫外光（或可見光）有吸收性能樣品的檢測。其特點：使用面廣（如蛋白質、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；靈敏度高（檢測下限為10-10gml）；線性范圍寬；對溫度和流速變化不敏感；可檢測梯度溶液洗脫的樣品。 （2）示差折光檢測器 凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測。 ，糖類化合物的檢測 使用此檢測系統。這一系統通用性強、操作簡單，但靈敏度低（檢測下限為10-7gml），流動相的變化會引起折光率的變化，因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測。 （3）熒光檢測器 凡具有熒光的物質，在一定條件下，其發射光的熒光強度與物質的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用于具有熒光的有機化合物（如多環芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質等）的測定，其靈敏度很高（檢測下限為10-1210-14gml），痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可采用。 5 . 測定方法定量測定時，可根據樣品的具體情況采用峰面積法或峰高法。但用歸一法或內標法測定雜質總量時，須采用峰面積法。面積歸一化法測定供試品（或經衍生化處理的供試品）中各雜質及雜質的總量限度采用不加校正因子的峰面積歸一法。計算各雜質峰面積及其總和，并求出占總峰面積的百分率。但溶劑峰不計算在內。色譜圖的記錄時間應根據各品種所含雜質的保留時間決定，除另有規定外,可為該品種項下主成分保留時間的倍數。 主成分自身對照法當雜質峰面積與成分峰面積相差懸殊時，采用主成分自身對照法。在測定前，先按各品種項下規定的雜質限度，將供試品稀釋成一定濃度的溶液作為對照溶液，進樣，調節檢測器的靈敏度或進樣量，使對照溶液中的主成分色譜峰面積滿足準確測量要求。然后取供試品溶液，進樣，記錄時間，除另有規定外，應為主成分保留時間的倍數。根據測得的供試品溶液的各雜質峰面積及其總和并和對照溶液主成分的峰面積比較，計算雜質限度。 內標法測定供試品中雜質的總量限度采用不加校正因子的峰面積法。取供試品，按各品種項下規定的方法配制不含內標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖；再配制含有內標物質的供試品溶液，在同樣的條件下注樣，記錄色譜圖。記錄的時間除另有規定外，應為該品種項下規定的內標峰保留時間的倍數，色譜圖上內標峰高應為記錄儀滿標度的30以上，否則應調整注樣量或檢測器靈敏度。 如果色譜圖中沒有與色譜圖上內標峰保留時間相同的雜質峰，則色譜圖中各雜質峰面積之和應小于內標物質峰面積（溶劑峰不計在內）。如果色譜圖中有與色譜圖上內標物質峰保留時間相同的雜質峰，應將色譜圖上的內標物質峰面積減去色譜圖中此雜質峰面積，即為內標物質峰的校正面積；色譜圖中各雜質峰總面積加色譜圖中此雜峰面積，即為各雜質峰的校正總面積，各雜質峰的校正總面積應小于內標物質峰的校正面積。 加校正因子測定供試品中某個雜質或主成分含量 按各品種項下的規定,精密稱（量）取對照品和內標物質，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測定用的對照溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算校正因子： Asms校正因子f- Armr 式中 As為內標物質的峰面積或峰高，Ar為對照品的峰面積或峰高； ms為加入內標物質的量,mr為加入對照品的量。 再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品（或其雜質）峰和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算含量：Ax 含量（mx）f-Asms 式中 Ax為供試品（或其雜質）峰面積或峰高； mx為供試品（或其雜質）的量。 f、As和ms的意義同上。 當配制校正因子測定用的對照溶液和含有內標物質的供試品溶液使用同一份內標物質溶液時，則配制內標物質溶液不必精密稱（量）取。 外標法測定供試品中某個雜質或主成分含量 按各品種項下的規定,精密稱(量)取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和供試品待測成分的峰面積（或峰高），按下式計算含量： A 含量（mx）mr-Ar式中各符號意義同上 由于微量注射器不易精確控制進樣量，當采用外標法測定供試品中某雜質或主成分含量時，以定量環進樣為好三氣相色譜法（gas chromatography 簡稱GC）1.氣相色譜是一種物理的分離方法。利用被測物質各組分在不同兩相間分配系數（溶解度）的微小差異，當兩相作相對運動時，這些物質在兩相間進行反復多次的分配，使原來只有微小的性質差異產生很大的效果，而使不同組分得到分離。2.特點：氣相色譜法具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優點，但是受技術條件的限制，沸點太高的物質或熱穩定性差的物質都難于應用氣相色譜法進行分析。3.組成：由載氣源、進樣部分、色譜柱、柱溫箱、檢測器和數據處理系統組成。進樣部分、色譜柱和檢測器的溫度均在控制狀態。 3.1 柱箱：色譜柱是氣相色譜儀的心臟， 樣品中的各個組份在色譜柱中經過反復多次分配后得到分離， 從而達到分析的目的， 柱箱的作用就是安裝色譜柱。 由于色譜柱的兩端分別連接進樣器和檢測器， 因此進樣器和檢測器的下端（ 接頭） 均插入柱箱。柱箱能夠安裝各種填充柱和毛細管柱， 并且操作方便。 色譜柱（ 樣品） 需要在一定的溫度條件下工作， 因此采用微機對柱箱進行溫度控制。并且由于設計合理， 柱箱內的梯度很小。 對于一些成份復雜、沸程較寬的樣品， 柱箱還可進行三階程序升溫控制。且程序設定后自動運行無需人工干預， 降溫時還能自動后開門排熱。 3.2 進樣器： 進樣器的作用是將樣品送入色譜柱。如果是液體樣品， 進樣器還必須將其汽化， 因此采用微機對進樣器進行溫度控制。 根據不同種類的色譜柱及不同的進樣方式， 共有五種進樣器可供選擇： 1）.填充柱進樣器 2）.毛細管不分流進樣器附件 3）.毛細管分流進樣器附件 4）.毛細管分流/不分流進樣器 5）.六通閥氣體進樣器 3.3檢測器: 檢測器的作用是將樣品的化學信號轉化為物理信號（ 電信號） 。 檢測器也需要在一定的溫度條件下才能正常工作， 因此采用微機對檢測器進行溫度控制。 根據各種樣品的化學物理特性， 共有五種檢測器可供選擇： 1）.氫火焰離子化檢測器(FID) 2).熱導檢測器(TCD) 3).電子捕獲檢測器(ECD) 4).氮磷檢測器(NPD) 5).火焰光度檢測器(FPD) 3.4 數據處理系統 該系統可對測試數據進行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。4.定量方法可分以下三種：1)、內標準法 取標準被測成分，按依次增加或減少的已知階段量，各自分別加入各單體所規定的定量內標準物質中，調制標準溶液。分別取此標準液的一定量注入色譜柱，根據色譜圖取標準被測成分的峰面積和峰高和內標物質的峰面積和峰高的比例為縱座標，取標準被測成分量和內標物質量之比，或標準被測成分量為橫坐標，制成標準曲線。然后按單體中所規定的方法調制試樣液。在調制試樣液時，預先加入與調制標準液時等量的內標物質。然后按制作標準曲線時的同樣條件下得出的色譜，求出被測成分的峰面積或峰高和內標物質的峰積或峰高之比，再按標準曲線求出被測成分的含量。 所用的內標物質，應采用其峰面積的位置與被測成分的峰的位置盡可能接近并與被測成分以外的峰位置完全分離的穩定的物質。 2）絕對標準曲線法1 取標準被測成分 按依次增加或減少階段法，各自調制成標準液，注入一定量后，按色譜圖取標準被測成分的峰面積或峰高為縱座標，而以標準被測成分的含量為橫坐標，制成標準曲線。然后按單體中所規定的方法制備試樣液。取試樣液按制標準曲線時相同的條件作出色譜，求出被測成分的峰面積和峰高，再按標準曲線求出被測成分的含量。 3）峰面積百分率法 以色譜中所得各種成分的峰面積的總和為100，按各成分的峰面積總和之比，求出各成分的組成比率。四薄層色譜法1.薄層色譜，或稱薄層層析(thinlayer chromatography)，是以涂布于支持板上的支持物作為固定相，以合適的溶劑為流動相，對混合樣品進行分離、鑒定和定量的一種層析分離技術。這是一種快速分離諸如脂肪酸、類固醇、氨基酸、核苷酸、生物堿及其他多種物質的特別有效的層析方法。2. 基本原理薄層層析是把支持物均勻涂布于支持板(常用玻璃板，也可用滌綸布等)上形成薄層，然后用相應的溶劑進行展開。薄層層析可根據作為固定相的支持物不同，分為薄層吸附層析(吸附劑)、薄層分配層析(纖維素)、薄層離子交換層析(離子交換劑)、薄層凝膠層析(分子篩凝膠)等。一般實驗中應用較多的是以吸附劑為固定相的薄層吸附層析。吸附是表面的一個重要性質。任何兩個相都可以形成表面，吸附就是其中一個相的物質或溶解于其中的溶質在此表面上的密集現象。在固體與氣體之間、固體與液體之間、吸附液體與氣體之間的表面上，都可能發生吸附現象。物質分子之所以能在固體表面停留，這是因為固體表面的分子(離子或原子)和固體內部分子所受的吸引力不相等。在固體內部，分子之間相互作用的力是對稱的，其力場互相抵消。而處于固體表面的分子所受的力是不對稱的，向內的一面受到固體內部分子的作用力大，而表面層所受的作用力小，因而氣體或溶質分子在運動中遇到固體表面時受到這種剩余力的影響，就會被吸引而停留下來。吸附過程是可逆的，被吸附物在一定條件下可以解吸出來。在單位時間內被吸附于吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時間內離開此表面的分子之間可以建立動態平衡，稱為吸附平衡。吸附層析過程就是不斷地產生平衡與不平衡、吸附與解吸的動態平衡過程。例如用硅膠和氧化鋁作支持劑，其主要原理是吸附力與分配系數的不同，使混合物得以分離。當溶劑沿著吸附劑移動時，帶著樣品中的各組分一起移動，同時發生連續吸附與解吸作用以及反復分配作用。由于各組分在溶劑中的溶解度不同，以及吸附劑對它們的吸附能力的差異，最終將混合物分離成一系列斑點。如作為標準的化合物在層析薄板上一起展開，則可以根據這些已知化合物的Rf值（后面介紹Rf值）對各斑點的組分進行鑒定，同時也可以進一步采用某些方法加以定量。3.方法：制造硅膠板點樣展開紫外燈下檢視對照4. 層層析有許多優點：它保持了操作方便、設備簡單、顯色容易等特點，同時展開速率快，一般僅需1520分鐘；混合物易分離，分辨力一般比以往的紙層析高10100倍，它既適用于只有001g的樣品分離，又能分離大于500mg的樣品作制備用，而且還可以使用如濃硫酸、濃鹽酸之類的腐蝕性顯色劑。薄層層析的缺點是對生物高分子的分離效果不甚理想。五柱色譜法又稱柱層析1.柱層析技術也稱柱色譜技術。一根柱子里先填充不溶性基質形成固定相，將蛋白質混合樣品加到柱子上后用特別的溶劑洗脫，溶劑組成流動相。在樣品從柱子上洗脫下來的過程中，根據蛋白質混合物中各組分在固定向和流動相中的分配系數不同經過多次反復分配，將不同蛋白組分逐一分離。2.柱色譜法又稱柱層析。固定相裝于柱內，流動相為液體，樣品沿豎直方向由上而下移動而達到分離的色譜法。它既區別于用于分離分析的GC和HPLC法，也區別于樣品在平面形固定相內移動的紙層析和薄層色譜法。本法主要用于分離，有時也起到濃縮富集作用。在環境分析測試中，本法廣泛用于樣品的前處理，如在水和氣溶膠的有機污染分析中，將萃取液轉移到層析柱內，而后用環己烷洗脫烷烴部分，用苯洗脫多環芳烴類污染物，用乙醇洗脫極性組分；在土壤分析中，用氧化鋁柱捕集分離稀土元素釷、鉈等。吸附柱色譜通常在玻璃管中填入表面積很大經過活化的多孔性或粉狀固體吸附劑。當待分離的混合物溶液流過吸附柱時，各種成分同時被吸附在柱的上端。當洗脫劑流下時，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脫的速度也不同，于是形成了不同層次，即溶質在柱中自上而下按對吸附劑的親和力大小分別形成若干色帶，再用溶劑洗脫時，已經分開的溶質可以從柱上分別洗出收集；或將柱吸干，擠出后按色帶分割開，再用溶劑將各色帶中的溶質萃取出來。柱色譜法column chromatography 將色譜填料裝填在色譜柱管內作固定相的色譜方法。根據色譜柱的尺寸、結構和制作方法的不同，又可分為填充柱色譜和毛細管柱色譜。六紫外分光光度法 工作原理許多有機化合物在紫外區具有特征的吸收光譜，因此可用紫外分光光度法對有機物質進行定性鑒定，結構分析及定量測定紫外分光光度法定量測定的依據是比耳定律。首先確定化合物的紫外吸收光譜，確定最大吸收波長。在選定的波長下，作出化合物溶液的工作曲線，根據在相同條件下測得待測液的吸光度值來確定待測液中化合物的含量。物質的吸收光譜本質上就是物質中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波長的光能量，相應地發生了分子振動能級躍遷和電子能級躍遷的結果。由于各種物質具有各自不同的分子、原子和不同的分子空間結構，其吸收光能量的情況也就不會相同，因此，每種物質就有其特有的、固定的吸收光譜曲線，可根據吸收光譜上的某些特征波長處的吸光度的高低判別或 測定該物質的含量，這就是分光光度定性和定量分析的基礎。分光光度分析就是根據物質的吸 收光譜研究物質的成分、結構和物質間相互作用的有效手段。紫外可見分光光度法的定量分析基礎是朗伯-比爾(Lambert-Beer)定律。即物質在一定濃度 的吸光度與它的吸收介質的厚度呈正比2.可見-紫外分光光度計。其應用波長范圍為200400nm的紫外光區、400850nm的可見光區。主要由輻射源（光源）、色散系統、檢測系統、吸收池、數據處理機、自動記錄器及顯示器等部件組成。七紅外光譜法1.紅外光譜法又稱“紅外分光光度分析法”。簡稱“IR”,分子吸收光譜的一種。利用物質對紅外光區的電磁輻射的選擇性吸收來進行結構分析及對各種吸收紅外光的化合物的定性和定量分析的一法。被測物質的分子在紅外線照射下，只吸收與其分子振動、轉動頻率相一致的紅外光譜。對紅外光譜進行剖析，可對物質進行定性分析。化合物分子中存在著許多原子團1，各原子團被激發后，都會產生特征振動，其振動頻率也必然反映在紅外吸收光譜上。據此可鑒定化合物中各種原子團，也可進行定量分析。2.紅外光譜法的一般特點特征性強、測定快速、不破壞試樣、試樣用量少、操作簡便、能分析各種狀態的試樣、分析靈敏度較低、定量分析誤差較大3對樣品的要求試樣純度應大于98，或者符合商業規格Ø 這樣才便于與純化合物的標準光譜或商業光譜進行對照Ø 多組份試樣應預先用分餾、萃取、重結晶或色譜法進行分離提純，否則各組份光譜互相重疊，難予解析試樣不應含水（結晶水或游離水）水有紅外吸收，與羥基峰干擾，而且會侵蝕吸收池的鹽窗。所用試樣應當經過干燥處理試樣濃度和厚度要適當，使最強吸收透光度在520%之間八凝膠色譜法（凝膠層析法）（蛋白質相對分子質量的測定）1.凝膠色譜法又叫凝膠色譜技術，由于設備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質有很高的分離效果。凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。凝膠色譜法主要用于高聚物的相對分子質量分級分析以及相對分子質量分布測試。根據分離的對象是水溶性的化合物還是有機溶劑可溶物，又可分為凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。 GFC一般用于分離水溶性的大分子，如多糖類化合物。凝膠的代表是葡萄糖系列，洗脫溶劑主要是水。凝膠滲透色譜法主要用于有 機溶劑中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)相對分子質量分布分析及分離，常用的凝膠為交聯聚苯乙烯凝膠，洗脫溶劑為四氫呋喃等有機溶劑。凝膠色譜不但可以用于分離測定高聚物的相對分子質量和相對分子質量分布，同時根據所用凝膠填料不同，可分離油溶性和水溶 性物質，分離相對分子質量的范圍從幾百萬到100以下。近年來，凝膠色譜也廣泛用于分離小分子化合物。化學結構不同但相對分子質量相近的物質，不可能通過凝膠色譜法達到完全的分離純化的目的。凝膠色譜主要用于高聚物的相對分子質量分級分析以及相對勿子質量分布測試。2.凝膠色譜法基本理論（一）分子篩效益一個含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經凝膠色譜柱時，各分子在柱內同時進行著兩種不同的運動：垂直向下的移動和無定向的擴散運動。大分子物質由于直徑較大，不易進入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所以在洗脫時向下移動的速度較快。小分子物質除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔中，即進入凝膠相內，在向下移動的過程中，從一個凝膠內擴散到顆粒間隙后再進入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入和擴散，小分子物質的下移速度落后于大分子物質，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，這種現象叫分子篩效應。具有多孔的凝膠就是分子篩。各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍，有最大極限和最小極限。分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的，就會全部被排阻在凝膠顆粒之外，這種情況叫全排阻1。兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能有分離效果。直徑比凝膠最小孔直徑小的分子能進入凝膠的全部孔隙。如果兩種分子都能全部進入凝膠孔隙，即使它們的大小有差別，也不會有好的分離效果。因此，一定的分子篩有它一定的使用范圍。綜上所述，在凝膠色譜中會有三種情況，一是分子很小，能進入分子篩全部的內孔隙；二是分子很大，完全不能進入凝膠的任何內孔隙；三是分子大小適中，能進入凝膠的內孔隙中孔徑大小相應的部分。大、中、小三類分子彼此間較易分開，但每種凝膠分離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對于分子大小不同，但同屬于凝膠分離范圍內各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的：分子較大的只能進入孔徑較大的那一部分凝膠孔隙內，而分子較小的可進入較多的凝膠顆粒內，這樣分子較大的在凝膠床內移動距離較短，分子較小的移動距離較長。于是分子較大的先通過凝膠床而分子較小的后通過凝膠床，這樣就利用分子篩可將分子量不同的物質分離。另外，凝膠本身具有三維網狀結構，大的分子在通過這種網狀結構上的孔隙時阻力較大，小分子通過時阻力較小。分子量大小不同的多種成份在通過凝膠床時，按照分子量大小“排隊，凝膠表現分子篩效應。（二）色譜柱的重要參數柱體積：柱體積是指凝膠裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。在色譜柱中充滿凝膠的部分稱為凝膠床，因引柱體積又稱“床”體積，常用Vt 表示。外水體積：色譜柱內凝膠顆粒間隙，這部分體積稱外水體積，亦稱間隙體積，常用Vo表示。內水體積：因為凝膠為三維網狀結構，顆粒內部仍有空間，液體可進入顆粒內部，這就分間隙的總和為內水體積，又稱定相體積，常用Vi表示。 不包括固體支持物的體積（Vg）。峰洗脫體積：是指被分離物質通過凝膠柱所需洗脫液有體積，常用Ve 表示。當使用樣品的體積很少時，（與洗脫體積比較可以忽略不計），在洗脫圖中，從加樣到峰頂位置所用洗脫液體積為Ve。 當樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時，洗脫體積計算可以從樣品體積的一半到峰頂位置。當樣品很大時，洗脫體積計算可以從應用樣品開始到洗脫峰升高的彎曲點（或半高處）。九原子吸收光譜法 (AAS) 原子吸收光譜法 (AAS)是利用氣態原子可以吸收一定波長的光輻射，使原子中外層的電子從基態躍遷到激發態的現象而建立的。由于各種原子中電子的能級不同，將有選擇性地共振吸收一定波長的輻射光，這個共振吸收波長恰好等于該原子受激發后發射光譜的波長，由此可作為元素定性的依據，而吸收輻射的強度可作為定量的依據。AAS現已成為無機元素定量分析應用最廣泛的一種分析方法。 原子吸收光譜法該法具有檢出限低（火熖法可達ng?cm3級）準確度高（火熖法相對誤差小于1%），選擇性好（即干擾少）分析速度快等優點。 在溫度吸收光程，進樣方式等實驗條件固定時，樣品產生的待測元素相基態原子對作為銳線光源的該元素的空心陰極燈所輻射的單色光產生吸收，其吸光度（A）與樣品中該元素的濃度（C）成正比。即 A=KC 式中，K為常數。據此，通過測量標準溶液及未知溶液的吸光度，又巳知標準溶液濃度，可作標準曲線，求得未知液中待測元素濃度。 該法主要適用樣品中微量及痕量組分分析。十原子發射光譜法 atomic emission spectrometry利用原子或離子在一定條件下受激而發射的特征光譜來研究物質化學組成的分析方法。根據激發機理不同，原子發射光譜有3種類型： 原子的核外光學電子在受熱能和電能激發而發射的光譜，通常所稱的原子發射光譜法是指以電弧、電火花和電火焰（如ICP等）為激發光源來得到原子光譜的分析方法。以化學火焰為激發光源來得到原子發射光譜的，專稱為火焰光度法。原子核外光學電子受到光能激發而發射的光譜，稱為原子熒光（見原子熒光光譜分析）。原子受到X射線光子或其他微觀粒子激發使內層電子電離而出現空穴，較外層的電子躍遷到空穴，同時產生次級X射線即X射線熒光(見X射線熒光光譜分析)。十一核磁共振技術 nuclear magnetic resonance， NMR 核磁共振技術可以直接研究溶液和活細胞中相對分子質