常用標本制備技術一、常用光鏡標本制備技術1.切片標本的制備：常用的切片方法為石蠟切片，其制備程序如下：取材 從動物身體割取所需的新鮮組織一小塊（厚度約0.5厘米）。手術愈快愈好，以防組織的死后變化。固定 把切取的小塊組織，迅速投入預先配好的固定液如10%福爾馬林、0.5%鋨酸、包氏液、岑克氏液、卡氏等固定液中固定，使組織細胞的蛋白質變性，組織塊硬化，以保存組織細胞原有的形態。沖洗（洗滌） 組織塊自固定液取出后，須經流水沖洗或乙醇洗滌，使組織中含有的固定液全部除去，直至洗凈為止。脫水 脫水的目的在于除去組織中的水分。因為組織中的水分和石蠟是不相溶的，為不使組織塊在脫水時產生收縮，所以一定要經過各級濃度的脫水劑（如乙醇等）將水分脫凈。透明 組織塊脫水后，須經既可和乙醇相混，亦可作石蠟溶劑的透明劑（如二甲苯）透明，使組織中的乙醇被透明劑所替代，才能浸蠟包埋。浸蠟 浸蠟是將包埋劑（石蠟）透入整個組織的過程。石蠟透入組織需要一定的溫度（石蠟熔點）。所以浸蠟都在恒溫箱中進行。包埋 制備一定形狀的容器（如紙盒等），倒入熔化的石蠟，迅速夾取浸透石蠟的組織塊放入盒內，待表面石蠟凝固后立即將容器投入水中，使它凝固成蠟塊。切片 組織塊經上述處理后，不僅變硬，且有石蠟支撐，可用切片機將包埋組織的蠟塊切成薄片，一般厚度是58微米。貼片 把由切片機切下的蠟條，分割成小段，分別排放于滴有蒸餾水的載玻片上，在展片臺上微熱，使皺褶的蠟片伸展平正。烘片 把貼有蠟片的載玻片置于45恒溫箱中，烘烤34小時，使切片干燥。脫蠟與復水 組織切片的脫蠟等過程是在染色缸中進行的，因此須預先準備潔凈的染色缸，并分別放入二甲苯、各級濃度的乙醇及染料溶液，按順序貼好標簽。染色前須先進行脫蠟和復水，即用二甲苯溶去切片上的石蠟后再經各級濃度乙醇（自高濃度到低濃度）下行到水的過程。因為沒有經過復水處理的切片不能用水溶性染料染色，所以在染色前必須再度復水。脫蠟與復水的步驟如下：切片浸入二甲苯310分鐘二甲苯+純乙醇（1：1）純乙醇95%乙醇80%乙醇70%乙醇50%乙醇（以上每級乙醇停留的時間約25分鐘）蒸餾水2分鐘。染色 切片染色以后可增加組織細胞結構的對比度。常用的生物染料是蘇木素和伊紅，簡稱H.E.染色。蘇木素是一種堿性染料，經蘇木素染色的結構呈藍紫色（如細胞核）。組織中可被堿性染料著色的結構稱嗜堿性。伊紅是一種酸性染料，被伊紅染色的結構呈紅色或粉紅色（如細胞質）?？杀凰嵝匀玖现慕Y構稱嗜酸性。H.E.染色的程序如下：將已浸入水中的切片取出放入蘇木素染液510分鐘自來水洗2分鐘0.5%鹽酸水分色數秒種（在顯微鏡下檢查核褪至淺紅色，細胞質及結締組織近無色）蒸餾水1分鐘0.1%氨水（藍化）1分鐘自來水沖洗510分鐘蒸餾水1分鐘50%乙醇70%乙醇80%乙醇90%乙醇（以上每級乙醇停留的時間約25分鐘）0.5%伊紅（95%乙醇溶液）25分鐘95%乙醇分色（在顯微鏡下檢查核呈藍紫色，細胞質及結締組織呈粉紅色）95%乙醇輕洗（洗凈玻片上剩余的伊紅染液）。脫水 已染色的組織切片，為了長久保存，又須再經各級濃度的乙醇脫水。即將上述已被染色的組織切片依次放入95%乙醇1分鐘純乙醇（I）1分鐘純乙醇（）25分鐘。透明 透明的目的是除去組織切片中的乙醇，因組織中的乙醇不與樹膠相溶，所以必須用透明劑除去乙醇后才能封藏。即將上述已脫水的組織切片依次放入二甲苯+純乙醇（1：1）25分鐘二甲苯（I）25分鐘二甲苯（）25分鐘。封固 在切片上滴加中性樹膠，用蓋玻片進行封固，保存備用。機體內有些結構成分，需經硝酸銀處理（鍍銀或銀染）時可使硝酸銀還原，形成銀的微粒附著在組織結構上，呈棕黑色，稱這種性質為親銀性。有些組織結構本身不能使硝酸銀還原，需加還原劑使硝酸銀還原，稱此為嗜銀性。此外，為了顯示某些特殊結構成分，還可應用各種特殊染色方法，如雷鎖辛品紅染色液顯示彈性纖維等。在制作較硬組織（如骨組織等）或較大組織器官（如眼球）等切片，為了減輕因石蠟包埋所產生的收縮，可用火棉膠（celloidin）代替石蠟進行浸透包埋，再進行切片染色。為了較好地保存細胞內的酶活性，可選用冷凍切片。它是將組織在低溫條件下快速凍結，直接切片，進行染色。2、涂片、鋪片、磨片標本的制備：血液等液體材料，可直接在玻片上涂片，干燥后再進行固定和染色。疏松結締組織和腸系膜等薄層組織，可在玻片上撕開展平，制成鋪片，待干燥后進行固定和染色。骨和牙等堅硬組織除用酸（如稀硝酸等）脫鈣后再按常規制成切片處，還可直接研磨成薄的磨片進行染色觀察。二、大體解剖技術操作規程及其注意事項（一）大體解剖標本的收集與防腐固定處理 1、收集標本時，須登記死者的死亡原因、性別、年齡等，辦妥自愿捐獻手續、家屬簽字等手續，免留后患。若系無主尸體亦須在公安、保衛部門辦妥有關手續。2、進行消毒處理，避免傳染病蔓延。3、進行固定防腐注射，配制5%10%的甲醛溶液作頸總動脈與股動脈灌注，按照標本大小選擇注射劑量。如注射溶液過濃，解剖時容易造成肌纖維及血管斷裂，過淡時標本容易腐敗。溫度高時注射5%左右溶液，溫度低時注射10%左右溶液。根據季節氣溫的不同在5%10%之間浮動。4、注射完后標本在注射臺上保留一到兩天，使其毛細血管中溶液滲均勻，再行放入3%5%的甲醛溶液中保存。5、每具標本注射后必須在尸池中浸泡六個月后，方可進行大體解剖，如解剖過早則不易保存。6、若收集標本須作鑄型標本用，宜將標本即時放血，取材越新鮮越好。剩余部分作局部注射保存。若作關節韌帶等標本，取材后馬上將肌肉等及時剝離，以防腐敗發臭。收集腐敗標本后可作沙埋腐蝕后取骨架為標本。（二）大體標本解剖1、將收集保存六個月以上的標本撈出、沖洗后，放入尸體臺即可進行解剖。2、解剖前必須將鑷、鉗、剪、刀等工具準備完好，方可動手操作。視其操作部位，必須熟悉所作部位解剖層次結構，用圓刀切開皮膚并剝離之，用尖刀或剪等修潔神經、血管、肌肉等結構。大體標本制作之關鍵在于熟悉層次結構和熟練的操作技巧。否則易切斷或破壞相關結構，且制作的標本不美觀。若作系解教學標本宜采取兩側分別以深、淺層制作。完成后放入本院配制之保存液中待用。（三）特殊標本制作1、鑄型標本（1）根據所取材料，按需要處理。（2）配制好鑄型劑并加不同染料（一般示紅色動脈，示靜脈藍色，示膽道綠色，示神經黃色等）。（3）分別采取不同腐蝕法，腐蝕后沖洗，裝瓶保存。2、包埋標本（1）取出所需材料修潔涼干（有條件可抽空包埋）。（2）按需要選擇好包埋材料。（3）包埋造型。3、陳列標本制作（1）按要求進行標本取材。（2）修潔、涂色。（3）裝瓶、保存（若標本上涂色彩，不宜保存在本院配方的保存液中，以防脫色，仍須保留在5%10%的甲醛溶液中）。三、人體骨骼標本雙氧水法制作（一）目的利用局解后的廢舊材料制作人體骨骼標本（二）材料經防腐固定的局解后尸體標本、工業用雙氧水、汽油和帶蓋標本箱。（三）方法1、取材：取骨質無損的標本，整體的或局部的均可。 2、軟組織處理：將大塊軟組織包括筋膜、肌肉、內臟、腦等除掉后，常溫下浸入5%-10%的雙 氧水中，利用雙氧水放氧產生氣泡的機械作用使軟組織松動，15-30天后取出，用清水沖洗后將骨膜撕掉，但韌帶、關節囊、軟骨、肌腱、骨間膜等可按需修潔保留（如做散的骨標本，則可將這些軟組織很容易地清除掉）。 3、脫脂：將上述材料涼干后入汽油中脫脂4個月。注意材料要干燥，容器要密封，中途更換1次汽油即可。 4、清潔和保存：將脫脂后的材料置通風處讓汽油揮發，然后浸入1%的洗衣粉內將表面的油漬洗凈，再用清水沖洗干凈。之后，置陰涼干燥處風干（為防止肋骨縮水變形，可用木條或有機玻璃支撐固定，待干后拆掉），涂刷清漆兩遍即可保存。（四）結果及評價制作出的骨骼標本潔凈美觀，結構完整，骨的連結自然真實，骨間膜、椎間盤、肋軟骨、恥骨間盤、韌帶、關節囊、關節軟骨等牢固地與骨連結在一起，胸廓，骨盆，脊椎等完全保持了其本來形態。采用雙氧水浸泡處理軟組織，有以下優點：（1）雙氧水放氧產生氧泡的物理作用使與骨結合緊密的軟組織松動，與骨較易分離，而干燥后這些軟組織與骨的結合又變得緊密牢固了。（2）經雙氧水浸泡后骨標本脫脂效果很好。（3）低濃度的雙氧水對骨質的腐蝕性小，在常溫下進行，處理的時間容易控制。四、辣根過氧化物酶（HRP）法操作規程（一）實驗目的探討某一針灸穴位區傳入神經元的節段性分布。（二）藥品和試劑HRP：Sigma Type IV RZ：3.2硝普鈉（廣州化學試劑廠）聯大茴香胺（北京化學試劑廠）過氧化氫（上海桃浦化工廠）（三）儀器設備與材料100ml量筒、分析天平、500ml量筒、1000ml燒杯、2000ml燒杯、家免飼養籠、50l微量注 射器、精密試紙、普通光學顯微鏡，等。四）實驗對象本院動物室提供的家兔，體重200020g。（五）實驗環境室溫1825，相對濕度60%75%。（六）操作步驟1主要溶液的制備（1）20%HRP液20l、HRP粉末5mg加20l生理鹽水即此液。（2）2%多聚甲醛加1.25%戊二醛0.1M磷酸緩沖液（PH7.4）。0.1M磷酸緩沖液的制備：液：NaH2PO4H2O 27.6g加蒸餾水稀釋至1000ml。液：Na2HPO412H2O 71.6g加蒸餾水稀釋至1000ml.取液190ml、液810ml混合后加蒸餾水稀釋至2000ml即得0.1M磷酸緩沖液（PH7.4）。2%多聚甲醛0.1M磷酸緩沖液的制備:20g多聚甲醛加0.1M磷酸緩沖至1000ml即得此液。2%多聚甲醛1.25%戊二醛0.1M磷酸緩沖液的制備:25%戊二醛50ml溶液加2%多聚甲醛0.1M磷酸緩沖液至1000ml即得。（3）Tris液的配制取3.6ml冰醋酸加蒸餾水至300ml。取4.08g無水醋酸鈉加蒸餾水至150ml。取上液279ml和上液126ml混合，即為Tris液?；旌虾笥镁茉嚰垳y其PH為4.4則可用。（4）O-D法中有關溶液配制A液的配制 取0.1MTris液10ml、0.2%明明膠液50ml、硝普鈉200mg加蒸餾水至100ml、聯大茴香胺80mg加蒸餾水至40ml、1.5%H2O20.8ml混合即得A液。B液的配制 取0.1Mtris液10ml、0.2%明膠液50ml、硝普鈉8g、蒸餾水140ml混合即得B液。C液的配制 取0.1Mtris液20ml、0.2%明膠液100ml、蒸餾水280ml混合即可得C液。2定穴及針入深度：根據針灸學1、獸醫針灸手冊2確定。3動物分組、麻醉及HRP引入方式：將實驗用家兔隨機分成5組，即穴區組神經干組、切斷神經組、切斷血管組和空白對照組。用2%戊巴比妥納、接40mg/kg體重，進行腹腔麻醉。穴區組、切斷神經組、切斷血管組，均在家兔某一目標穴區直接注射20%HRP液20l，神經干組在家兔目標穴區下神經干內注射20%HRP液20l，空白對照組則在家兔目標穴區直接注射20l生理鹽水。4動物灌注：注射后45天進行，開胸經左心室升主動脈插管，同時剪開右心耳灌注如下藥液：（1）04檸檬酸鈉速灌300ml。（2）04生理鹽水速灌1000ml。（3）04 2%多聚甲醛1.25%戊二醛0.1M磷酸緩沖液1000ml。前300ml速灌。后700ml緩慢滴入。全過程約40分鐘。（4）04 10%蔗糖0.1M磷酸緩沖液800ml。前300ml速灌。后500ml緩慢滴入。約30分鐘。5取材：取出兩側相應節段（據大體解剖學而定）全部脊神經節，并放入10%蔗糖0.1M磷酸緩沖液內。置冰箱內過夜。6冰凍切片 厚4050微米，并收集于0.1M磷酸緩沖液中。7成色反應（O-D法，有關A液、B液、C液配制見上）（1）04蒸餾水沖洗切片三次。（2）放入A液30分鐘（置冰箱）。（3）04蒸餾沖洗切片三次。（4）放入B液30分鐘（置冰箱）。（5）04蒸餾水沖洗切片三次。（6）放入C液中（置冰箱）。8蛋白甘油貼片91%中性紅復染，脫水透明，最后中性樹膠封片，光鏡下觀察。（七）實驗結果及評價（以“上巨虛”穴區為例）1未注射側的情況：所有的實驗動物在未注射側的切片上，各脊神經節都未出現標記細胞。2五組實驗動物在脊神經節出現標記細胞的情況（1）穴區組 在切片上，可見注射側脊神經節L4S2節段中都出現了標記細胞，以L7S2節段的標記細胞為最多。占總數的83%，其次為L2、L5、L4節段。腰段以L7為最多，占總數的40%；骶段以S1為最多，占總數的26%。其它各節段都未出現標記細胞。（2）神經干組 在切片上，可見注射側在脊神經節L1S3節段中出現了標記細胞。以L7S2節段的標記細胞為最多。占總數的68.2%，其次為L5、L4、L3、S3、L2、L1、腰段以L7為最多，占總數31.3%。段以S1為最多，占總數的21%。其它各節段都未出現標記細胞。（3）切斷神經組、空白對照組 在切片上各脊神經節都未出現標記細胞。（4）切斷血管組 在切片上可見注射側脊神經節L4S2節段中都出現了標記細胞，以L7S2為最多。占總數的76.9%，其次是L6、L5、和L4。腰段以L7節段為最多。占總數的31.7%，骶段以S1節段為最多，占總數的2.4%。其它各節段都未出現標記細胞。3大、中、小三型標記細胞在脊神經節內出現的情況本實驗用Leitz測微尺測定實驗中所有出現細胞的大小，其穴區組、神經干組、切斷血管組都能見到大、中、小三型標記細胞，且都以中、小型細胞為主，各占