人外周血淋巴細胞微核測定,一、目的要求 1、掌握人外周血淋巴細胞微核標(biāo)本制備方法。 2、熟悉人外周血淋巴細胞微核的形態(tài)特征。 3、了解微核的發(fā)生機制及微核檢測技術(shù)的用途。,二、實驗原理: 人外周血淋巴細胞大都處于細胞周期的G0期，在含有PHA的培養(yǎng)基中進行體外培養(yǎng)后，原來處于G0期的淋巴細胞可轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞，恢復(fù)分裂能力。在細胞分裂過程中，由于化學(xué)物質(zhì)或輻射作用影響，可以引起淋巴母細胞染色體損傷，致使染色體斷裂，無著絲粒的染色體斷片不能隨染色體移動進入子細胞核，結(jié)果在細胞質(zhì)中形成微核。本試驗是一種體外測試有害因子遺傳毒性的方法，通過在人類外周血淋巴細胞體外培養(yǎng)過程中加入受試物，檢測細胞微核情況來評價受試物的遺傳毒性。同時也成為檢測致突變、致癌、致畸物質(zhì)對機體遺傳效應(yīng)的一種重要手段。,三、實驗用品 （1）器材：離心管、注射器、培養(yǎng)瓶（10ml）、吸管、離心機、載玻片、冰箱、培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱。 （2）試劑：Giemsa染液、pH6.8磷酸緩沖液、RPMI1640培養(yǎng)液、PHA溶液、0.075molL KCl溶液、甲醇:冰醋酸固定液 （3）材料：人外周血、環(huán)磷酰胺溶液。,四、實驗步驟 1、按人類外周血染色體培養(yǎng)常規(guī)方法采血、接種，按組分別加入受試物（CP終濃度100ug/ml）培養(yǎng)72小時，收獲前不用加秋水仙素，收獲標(biāo)本，離心，去上清液。 2、低滲：加入0.075molL KCl溶液4m1。混勻后放入37恒溫水浴箱中低滲處理10分鐘。低滲時間可根據(jù)預(yù)實驗中細胞完整程度進行調(diào)整。 3、預(yù)固定：低滲結(jié)束后加入甲醇冰乙酸（3:1）固定液lml，混勻后離心（1000rpm）5分鐘。 4、固定：棄上清液，加入5ml固定液，混勻后離心（1000rpm）5分鐘。棄上清液，留沉淀物。可按本方法再固定一次。 5、滴片：加入少量固定液混勻成細胞懸液，滴片。 6、染色：用Giemsa染液染色 10分鐘。自來水細水沖洗后，晾干。,7、觀察與計數(shù)：先以低倍鏡、高倍鏡粗檢，選擇細胞分散均勻，染色良好的區(qū)域，轉(zhuǎn)到油鏡下觀察轉(zhuǎn)化的淋巴細胞，進行微核的觀察和計數(shù)。轉(zhuǎn)化淋巴細胞與未轉(zhuǎn)化淋巴細胞比較，前者細胞較大，胞核明顯偏離中心，染色質(zhì)較細致疏松或呈網(wǎng)狀、核仁多，胞漿豐富，常見空泡和偽足。 微核的識別：微核是存在于已轉(zhuǎn)化的胞漿完整的淋巴細胞中的小核，其直徑為主核的13以下，形態(tài)為圓形或橢圓形，嗜色性和主核一致或略淺，必須與主核完全脫離。一個細胞中，不論出現(xiàn)一個微核或多個微核，均按一個有微核的細胞計數(shù)，微核細胞率以千分率表示，即1000個已轉(zhuǎn)化的淋巴細胞中有微核的細胞