藥敏試驗方法簡介,耐藥菌問題日益嚴重,“目前藥物失去作用的速度與科學(xué)家發(fā)現(xiàn)新藥物的速度差不多?！?摘自WHO報告,抗微生物治療面臨的困境,抗藥性問題始終存在 細菌不斷獲得新的耐藥機制 以往對付耐藥性的策略收效不顯,一、 抗菌藥物敏感試驗（AST）,預(yù)測抗菌治療的效果； 指導(dǎo)抗菌藥物的臨床應(yīng)用； 發(fā)現(xiàn)或提示細菌耐藥機制的存在，指導(dǎo)合理用藥，避免產(chǎn)生或加重細菌的耐藥； 監(jiān)測細菌耐藥性，分析耐藥菌的變遷，掌握耐藥菌感染的流行病學(xué)，以控制和預(yù)防耐藥菌感染的發(fā)生和流行。,（1）抗菌藥物的選擇 在我國主要遵循臨床實驗室標準化委員會（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）制定的抗菌藥物選擇原則 A組：對特定菌群常規(guī)測試并報告的藥物 B組：可常規(guī)測試、選擇性報告的藥物 C組：替代性或補充性藥物 U組：僅用于泌尿道感染的抗菌藥物,葡萄球菌屬抗菌藥物藥敏試驗推薦分組,腸桿菌科抗菌藥物敏感試驗推薦分組,假單胞菌屬的抗菌藥物藥物敏感推薦分組,不動桿菌屬的抗菌藥物藥敏試驗推薦分組,腸球菌屬抗菌藥物藥敏試驗推薦分組,肺炎鏈球菌抗菌藥物藥敏試驗推薦分組,藥敏試驗的折點亦遵照每年最新公布的CLSI標準進行，分為敏感（S）、耐藥（R）和中介（I）。,敏感：分離菌株能被測試藥物使用推薦劑量時在感染部位通?？蛇_到的抗菌藥物濃度所抑制 耐藥：分離菌株不能被測試藥物常規(guī)劑量可達到的藥物濃度所抑制；分離菌株可能存在某些特定的耐藥機制；治療研究顯示藥物對分離菌株的臨床療效不可靠,耐藥治療無效；敏感治療有效,二、抗菌藥物的種類及作用機制,三、藥敏試驗方法學(xué),紙片擴散法（K-B法） 稀釋法（MIC法） 肉湯稀釋法 常量稀釋法 微量稀釋法 瓊脂稀釋法 E-test法,1.手工試驗,2.自動儀器藥敏系統(tǒng),紙片擴散法（K-B法） 原理：抑菌圈的大小反映受試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的MIC呈負相關(guān)。,耐藥 中介 敏感,R,I,S,Log2. MIC,d1 d2 抑菌圈直徑（mm),MIC與抑菌圈直徑的線性關(guān)系,準備抗菌藥物紙片和水解酪蛋白（M-H）培養(yǎng)基； 挑取孵育16 24小時已分純菌落，置于生理鹽水管中，振蕩混勻后校正濃度至0.5麥氏標準；,用無菌棉拭子蘸取菌液，在試管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)擠去多余菌液，然后在MH瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60度，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周； 平板在室溫下干燥35min，用無菌鑷子或商品化的紙片分配器將含藥紙片緊貼于瓊脂表面；,35孵育1624小時，量取抑菌圈直徑； 根據(jù)抑菌環(huán)的直徑，按照CLSI標準判讀，報告敏感、中介、耐藥。,2019/6/24,23,CLSI對K-B法的標準化規(guī)定 紙片藥物含量、細菌接種濃度、培養(yǎng)基、平皿厚度、孵育時間、環(huán)境、判定標準、質(zhì)控方法等；常規(guī)測試、報告的抗生素。 不同的藥判定標準不同；不同的菌判定標準也不同。,2019/6/24,擴散法藥敏影響因素,培養(yǎng)基 pH值7.2-7.4 營養(yǎng)程度（腸球菌能生長） 厚度 抗生素拮抗劑含量（用29212監(jiān)控） 鈣鎂離子含量、鋅離子含量（用27853氨基糖苷類和亞胺配能結(jié)果監(jiān)控） 菌懸液 濃度高抑菌環(huán)縮小（假耐藥） 濃度低則擴大（假敏感）,細菌純度 氣體環(huán)境 普通細菌放CO2時由于碳酸的影響，藥物活性受到影響，形成假敏感或假耐藥 苛養(yǎng)菌放普通環(huán)境生長不良，導(dǎo)致假敏感 培養(yǎng)時間 粘液性銅綠需48小時 測量方法,稀釋法 以一定濃度的抗菌藥物與含有受試菌的培養(yǎng)基進行一系列不同倍數(shù)稀釋（通常為雙倍稀釋），培養(yǎng)1624h后，通過觀察細菌生長現(xiàn)象來測得藥物對受試菌的最低抑菌濃度（MIC）。,2019/6/24,稀釋法（MIC法）,MIC法：分為常量法和微量法 常量法：肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法 微量法：微量肉湯稀釋法 簡化雙濃度折點法 ATB藥敏 簡化常規(guī)濃度分布MIC法 BD、德靈藥敏 動力學(xué)計算MIC法 VITEK32、VITEK2藥敏,肉湯稀釋法,不生長 = 抗生素抑制細菌生長 生長 = 抗生素?zé)o法抑制細菌生長 MIC (最小抑菌濃度) = 抗生素可抑制細菌生長的最小濃度。,常量稀釋法,藥敏試驗的參考方法： 將標準接種物加入含対倍稀釋抗生素的MH肉湯管中. 過夜培養(yǎng). MIC 即是能抑制細菌生長的含最低抗生素的濃度的那一管所標示的濃度值(瓊脂稀釋法是將対倍稀釋后的抗生素加入融化后平衡到50的MHA中再傾制平皿，接種物為一定大小的斑點，濃度也為104CFU/ml). 解釋標準(S or R) 是建立在體內(nèi)可達到的抗生素濃度水平上,微量肉湯稀釋法,接種后應(yīng)充分混勻，但不能有氣泡產(chǎn)生 靜置培養(yǎng) 培養(yǎng)溫度；35 氣體環(huán)境：所有細菌（包括苛養(yǎng)菌）均置大氣環(huán)境；厭氧菌置厭氧環(huán)境；微需氧菌置微需氧環(huán)境；淋菌瓊脂稀釋法置CO2 培養(yǎng)時間：18小時,藥敏結(jié)果報告可用MIC（g/ml）或?qū)φ誄LSI標準用S、R和I報告。 對于稀釋法的批量試驗，有時需要報告MIC50、MIC90。,2019/6/24,稀釋法藥敏影響因素,培養(yǎng)基 pH值 7.2-7.4 營養(yǎng)程度 抗生素拮抗劑含量 鈣鎂離子含量（鈣10-25；鎂10-12.5g/ml） 菌懸液（5104CFU/ml） 接種效應(yīng) 濃度高MIC抬高 濃度低MIC壓低,細菌純度 氣體環(huán)境 所有需氧細菌均放普通大氣環(huán)境。如果放CO2，由于碳酸的影響，藥物活性受到影響，形成假敏感或假耐藥 培養(yǎng)時間 真菌需48小時 奴卡菌需5天,E-test法 將稀釋法和擴散法的原理結(jié)合起來，直接測定藥物對受試菌的MIC 。,2019/6/24,MIC 值標注于試條的光面,Etest 試條,毛面貼于MHA上,Etest 操作程序,按照擴散法標準操作涂布接種,貼上試條并培養(yǎng)15-18小時,讀取抑菌濃度并按標準解釋,細菌生長區(qū),E試條,細菌生長抑制區(qū),256 128 8 0.16,判讀MIC,2019/6/24,肺炎鏈球菌 青霉素 MIC = 3 g/ml,結(jié)果讀取,BD PhoenixTM -100 鳳凰全自動細菌鑒定/藥敏檢測系統(tǒng),最大的標本容量：對100個標本同時進行鑒定與藥敏測試！,鑒定部分： 51孔鑒定實驗 改良經(jīng)典實驗 顯色熒光檢測 無需附加實驗與試劑,藥敏部分： 85孔藥敏實驗 比濁氧化還原（專利） 實測倍比稀釋MIC值 藥物種類與濃度梯度最多 耐藥機制檢測同步進行,封閉式設(shè)計，安全無泄漏,先進的鑒定/藥敏復(fù)合板設(shè)計,PhoenixTM100鑒定板 革蘭氏陽性板、革蘭氏陰性板生化反應(yīng)組合,革蘭氏陽性菌鑒定板,革蘭氏陰性菌鑒定板,鑒定部分： 51孔鑒定實驗,改良經(jīng)典實驗 顯色熒光檢測,無需附加實驗與試劑,鑒定實驗方法,在研究了上百種反應(yīng)底物基礎(chǔ)上，選擇了45種反應(yīng)底物。 檢測板每20分鐘檢測一次,Phoenix工作流程,從經(jīng)過夜純培養(yǎng)的新鮮平板上挑取菌落,Phoenix工作流程,在ID肉湯中制成標準濁度（0.50.6麥 氏單位）的菌懸液,加一滴AST指示劑到AST肉湯中,Phoenix工作流程,從ID肉湯管中準確吸取25 L菌懸液， 加入到AST肉湯中,Phoenix工作流程,將肉湯倒入檢測板，蓋蓋子。檢測板 已準備好，可以上機檢測。,Phoenix工作流程,巧妙的重力加樣技術(shù),掃描板條，輸入資料,Phoenix工作流程,將檢測板放入儀器（隨意位置）,Phoenix工作流程,僅需區(qū)別革蘭氏染色即可選板 板條種類齊全： 鑒定板、藥敏板、鑒定藥敏復(fù)合板 同時提供獨立密封包裝的鑒定肉湯和藥敏肉湯，無需用戶配制。 試劑常溫保存,配套試劑,強大軟件支持： BDXpert微生物專家系統(tǒng)幫助解釋和監(jiān)測檢測結(jié)果 檢測結(jié)果分別可分別傳入LIS系統(tǒng)或BD Epicenter數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)或打印機，并能進行各種統(tǒng)計學(xué)分析,強大的軟件系統(tǒng),鑒定能力 革蘭氏陽性菌鑒定180種 革蘭氏陽性球菌 革蘭氏陽性桿菌 革蘭氏陰性菌鑒定200種 革蘭氏陰性發(fā)酵桿菌 革蘭氏陰性非發(fā)酵桿菌 無需附加實驗 95-96% 準確性,鑒定時間 minimum 1:26 hr maximum 12:25 hr average 3:24 hr median 2:26 hr 95th % 6:26 hr,優(yōu)異的鑒定性能,檢測反應(yīng)孔內(nèi)微生物生長情況 濁度（傳統(tǒng)方法）： 微生物生長形成小顆粒和聚集成團塊 氧化還原作用（BD專利技術(shù)） ： 通過藥敏實驗指示劑顏色變化檢測微生物的新陳代謝 濁度與氧化還原的變化通過紅、藍、綠光每20分鐘檢測一次,藥敏實驗方法,藥敏種類與時間 葡萄球菌屬 鏈球菌 腸球菌屬 腸桿菌屬 其他革蘭氏陰性桿菌 GN - 90% in 5 Hrs GP - 80% in 6 Hrs 藥敏特點 對倍稀釋藥物濃度 真正的MIC檢測 延遲耐藥檢測 急診報告 快速完成功能,耐藥檢測無需附加板條 自動檢測18種耐藥機制 產(chǎn)超廣譜Beta內(nèi)酰胺酶檢測(ESBL) 耐甲氧西林葡萄球菌檢測(MRS) 鏈霉素高耐株檢測(HLSR) 慶大霉素高耐株檢測(HLGR) 耐萬古霉素腸球菌檢測(VRE) 產(chǎn)Beta內(nèi)酰胺酶革蘭氏陽性菌檢測,優(yōu)異的藥敏性能,儀器判讀結(jié)果,儀器自動記錄每次判讀的每個反應(yīng)孔的結(jié)果。 將反應(yīng)結(jié)果與上一次判讀結(jié)果進行比較。 當兩次結(jié)果沒有差別，則該反應(yīng)結(jié)束。 內(nèi)置的運算法則：顏色比率的變化 依時間而變的數(shù)據(jù)庫：2、3、4、6、12小時，依據(jù)每個測試周期的判讀結(jié)果產(chǎn)生“百分比圖”，如獲得足夠的信息，則給出鑒定結(jié)果。 標準菌量,可信度90，給出結(jié)果。,BDXpert微生物專家系統(tǒng),鑒定實驗,BDXpert專家 系統(tǒng) - NCCLS - DIN - SFM - BD Rules,報告 - ID - MI - Rule set SIR - BDXpert SIR - 特殊信息,藥敏實驗,BDXpert微生物專家系統(tǒng)目的,對藥敏結(jié)果進行解釋與修正，保證藥敏實驗結(jié)果準確可靠，從而指導(dǎo)臨床正確進行抗感染治療 專家規(guī)則來自于： 已確定的標準（NCCLS,DIN,SFM) 藥物研發(fā)單位的文獻資料 已廣為接受的文獻資料和經(jīng)驗 持續(xù)更新,BDXpert微生物專家系統(tǒng)規(guī)則的應(yīng)用,SIR結(jié)果的解釋來自于專家系統(tǒng)規(guī)則的設(shè)置 NCCLS, DIN, SFM, Custom 藥物分級規(guī)則 天然耐藥和天然敏感規(guī)則 耐藥標記規(guī)則 腸桿菌科： ESBL 葡萄球菌： MRS, beta-內(nèi)酰胺酶 (GP BL) 腸球菌：VRE, HLGR, HLSR,舉例：SIR解釋,規(guī)則規(guī)定 腸桿菌科細菌Ampicillin breakpoints: S8 (I=16) R32 Ref: Table 2A (NCCLS M100-S12, 2002),Phoenix 顯示 如果 待檢菌是腸桿菌科細菌，且藥物為 ampicillin，MIC = 2 那么 結(jié)果顯示為“S”,BDXpert微生物專家系統(tǒng)規(guī)則的應(yīng)用,舉例：天然耐藥,規(guī)則規(guī)定 規(guī)則： C. freundii 在體內(nèi)對ampicillin和 amoxicillin天然耐藥 Ref: Brownet, al. 1989J. Antimicrob. Chemother.,Phoenix顯示 如果 待檢菌是C. freundii 且 AM is “S” or “I” 或 AMX is “S” or “I” 那么 將AM or AMX 結(jié)果改為“R”，且報告顯示該待檢菌是對該抗生素天然耐藥；檢查鑒定結(jié)果和待檢菌是否純,BDXpert微生物專家系統(tǒng)規(guī)則的應(yīng)用,結(jié)果顯示 鑒定結(jié)果 (用戶可修改) MIC值 來自標準的解釋 BDXpert 專家系統(tǒng)SIR結(jié)果 最終結(jié)果 (用戶可修改),鑒定及藥敏結(jié)果顯示,中文報告系統(tǒng),TCP/IP 以太網(wǎng),EpiCenter 工作站,Phoenix ID/AST,BACTEC 9000 Bl