ICS65.020.01B05DB22備案號：56323-2017吉林省地方標準DB22/T2623.2—2017黑木耳菌種區別性及真實性鑒定第2部分：酯酶同工酶法VerificationofdistinctnessandgenuinenessforBlackwoodearspawnPart2:Esteraseisozyme吉林省質量技術監督局發布DB22/T2623.2—2017前言《黑木耳菌種區別性及真實性鑒定》分為以下3個部分：——DB22/T2623.1黑木耳菌種區別性及真實性鑒定第1部分對峙培養法——DB22/T2623.2黑木耳菌種區別性及真實性鑒定第2部分酯酶同工酶法——DB22/T2623.3黑木耳菌種區別性及真實性鑒定第3部分SRAP法本部分為第2部分：酯酶同工酶法。本標準按照GB/T1.1—2009和GB/T20001.4—2015給出的規則起草。本標準由吉林省農業委員會提出并歸口。本標準起草單位：吉林農業大學、吉林省海外農業投資開發集團有限公司。本標準主要起草人：姚方杰、張友民、方明、陳影、魯麗鑫、王鵬、姚允武、于婭、劉宏宇、李丹、王曉娥、陳艷秋、劉迪、張偉彤、孔祥會、馬曉旭、張媛媛、李玉。IDB22/T2623.2—2017黑木耳菌種區別性及真實性鑒定第2部分酯酶同工酶法1范圍本標準規定了黑木耳菌種真實性鑒定酯酶同工酶法的原理、試劑和材料、儀器設備、樣品、試驗步驟、試驗數據處理。本標準適用于黑木耳菌種真實性的鑒定。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T1097食用菌菌種真實性鑒定酯酶同工酶電泳法3術語和定義NY/T1097界定的以及下列術語和定義適用于本文件。為了便于使用，以下重復列出了NY/T1097在生物中，酶的表達受遺傳基因的調控。酯酶是多等位基因調控的酶類，在凝膠電泳中經聚丙烯酰胺凝膠的濃縮，在分子篩效應和電場的電荷效應作用下而發生分離。從食用菌菌絲體中提取的粗酶液經電泳后，進行酯酶的生物化學染色，不同的酯酶組分顯示在凝膠的不同位置而形成酯酶同工酶酶譜。相同的菌種遺傳背景相同，其酯酶同工酶酶譜也相同。因此可以用酯酶同工酶酶譜對黑木耳菌種的真實性進行鑒定。5.5分離膠緩沖液（pH8.9）：見附錄B.3。5.6濃縮膠緩沖液（pH6.7）：見附錄B.4。1DB22/T2623.2—20175.7分離膠母液：見附錄B.5。5.8濃縮膠母液：見附錄B.6。5.9酯酶同工酶電極緩沖液：見附錄B.7。5.10磷酸緩沖液：見附錄B.8。5.11酯酶同工酶電泳染色液：見附錄B.9。5.12液氮。6儀器設備6.1高速冷凍離心機（10000rpm以上）。6.2全溫搖瓶柜：精度±0.1℃。6.3垂直板電泳槽：凝膠面積（W×L）160×180mm。6.4穩壓穩流電泳儀。6.5分析天平：感量0.01g、0.0001g各一臺。7樣品7.1液體培養直接將接種塊接入三角瓶液體培養基中，25℃，120rpm振蕩避光培養20d。培養基的制備參見附錄A。將振蕩培養的黑木耳菌絲球過濾除去水分，獲得供檢黑木耳供試菌株與標準菌株的菌絲體各3份。稱取菌絲體0.5g，加液氮研磨，將樣品收集于1.5mL離心管中，加入0.5mL樣品提取液（附錄B.1）。將研磨后的樣品在4℃下12000rpm，離心10min，取其上清液，將上清液和上樣緩沖液按10:1比例混勻，混合液即為電泳樣品。分離膠濃度9%，按照分離膠緩沖液（附錄B.3）:分離膠母液（附錄B.5）:雙蒸水:過硫酸銨（附錄B.2）=2:5:1:8的比例配制，再加入膠溶液體積0.1%的TEMED，充分混勻。將分離膠灌入膠室至距短玻璃板上沿2.2cm～2.5cm，加入適量的水封住膠面，待凝膠聚合后將水吸出。濃縮膠濃度3%，按照濃縮膠緩沖液（附錄B.4）:濃縮膠母液（附錄B.6）:雙蒸水:過硫酸銨（附錄B.2）=1:2:1:4比例混合，再加入膠溶液體積0.1%的TEMED，充分混勻，灌入膠室，立即插入樣品梳，待凝膠。2DB22/T2623.2—2017濃縮膠聚合后，小心抽出樣品梳，用微量進樣器吸去點樣孔中多余的水分后，注入電極緩沖液（附錄B.7），上槽電極緩沖液面要高于短玻璃板，下槽電極緩沖液面要高于鉑金絲；用微量進樣器吸取15μL～20μL樣品加入點樣孔。8.3電泳將電泳槽放入冰箱內進行低溫電泳，采用穩壓電泳，電壓為130V，待指示劑進入分離膠后，電壓升至260V。待前沿指示劑距膠底部約1cm～1.5cm，停止電泳。8.4取膠染色倒出電極緩沖液，在水中啟開玻璃板，取出凝膠片，浸入染色液（附錄B.9）中，37℃染色15min～20min，用水沖洗干凈。9試驗數據處理9.1遷移率Rf值計算應按照NY/T1097的規定執行。9.2判斷將凝膠片用凝膠成像系統拍照存圖。對比供檢菌株和對照菌株酶帶數量與遷移率的大小，若酶帶數量或遷移率不同，用相關軟件分析遺傳相似系數，相似系數小于1，則供檢菌株與對照菌株為不同菌株，當相似系數等于1則須結合其他鑒定方法判斷。3DB22/T2623.2—2017AA附錄A（規范性附錄）培養基制備200g新鮮馬鈴薯，20g葡萄糖，加去離子水或相當純度的水補齊至1000mL，pH自然。100mL三角瓶裝50mL左右。4DB22/T2623.2—2017BB附錄B（規范性附錄）試劑的制備除非另有說明，在分析中僅使用分析純試劑和去離子水或相當純度的水。B.1樣品提取液（pH7.5）稱取6.02g磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、0.50g磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）溶于水中，定容至100mL。B.2過硫酸銨(1.4g/L)稱取0.14g過硫酸銨溶于水中，定容至100mL，現用現配。B.3分離膠緩沖液（pH8.9）稱取36.3g三羥甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris），用48mL1mol/LHCL溶解，TEMED0.23mL，定容至100mL，4℃貯存。稱取5.98g三羥甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris），用48mL1mol/LHCL溶解，TEMED0.46mL，定容至100mL，4℃貯存。稱取28.0g丙烯酰胺（C3H5NO，Arc）、0.735g甲叉雙丙烯酰胺（C7H10N2O2，Bis），溶于水中，定容至100mL，用棕色瓶4℃貯存。稱取10.0g丙烯酰胺（C3H5NO，Arc）、2.0g甲叉雙丙烯酰胺（C7H10N2O2，Bis）溶于水中，定容至100mL，用棕色瓶4℃貯存。稱取6.0g三羥甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris）、28.8g甘氨酸（C2H5NO2）溶于水中，定容至1L，使用時稀釋10倍，使用液pH8.3。5DB22/T2623.2—2017稱取22.6g磷酸氫二鈉（Na2HPO4·