ICS11.220DB22B41吉林省地方標準DB22/T2560—2016水貂病毒性腸炎檢疫技術規范Quarantineprotocolforminkviralenteritis吉林省質量技術監督局發布DB22/T2560—2016前言本標準按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015給出的規則起草。本標準由吉林出入境檢驗檢疫局提出并歸口于吉林省畜牧業管理局。本標準起草單位：吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，中國農業科學院特產研究所。本標準主要起草人：王偉利、王建科、孟慶峰、程悅寧、易立、姚貴哲、王準、宋翱、程世鵬。IDB22/T2560—2016水貂病毒性腸炎檢疫技術規范1范圍本標準規定了水貂病毒性腸炎的病原分離鑒定、HA-HI試驗、PCR、Real-timePCR及動物回歸試驗等診斷技術要求。本標準適用于水貂病毒性腸炎的檢疫、疫情監測和流行病學調查。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析試驗室用水規格和試驗方法3縮略語下列縮略語適用于本文件MEV：水貂腸炎病毒F81：貓腎傳代細胞CPE：細胞病變——離心管（1.5mL、0.2mL）——試驗動物：3月齡健康水貂（水貂腸炎病毒HI抗體效價≤1∶4）4.2試劑——DEPC雙蒸水（雙蒸餾水1000mL、DEPC1mL，室溫放置28h以上，0.105MPa蒸汽高壓30min。1DB22/T2560—20164℃或室溫保存）——培養液（DMEM粉10g、碳酸氫鈉3.7g，溶于1000mL雙蒸水中，抽濾分裝，4℃保存）——營養液（DMEM培養液900mL、犢牛血清100mL，加青霉素、鏈霉素，使其濃度分別達到200IU/mL、200μg/mL抽濾除菌）——維持液（DMEM培養液980mL、犢牛血清20mL，加青霉素、鏈霉素使其終濃度分別達200IU/mL、200μg/mL，抽濾除菌）——胰蛋白酶溶液（胰酶2.50g、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）0.20g、無鈣鎂PBS1000mL，抽濾除菌，4℃保存備用）——新生犢牛血清——青霉素——鏈霉素——阿氏液（葡萄糖2.05g、拘椽酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.82g、雙蒸餾水二級水中溶解后，用鹽酸將pH值調至6.1，高壓蒸汽滅菌20min，最后用二級水定容至100mL，4℃保存備用。）——蛋白酶K（三羥甲基氨基甲烷（Tris）（pH7.8）1.20mg（0.01mmol/L）、乙二胺四乙酸（EDTA）1.86mg（0.005mmol/L）、SDS5.00g、三蒸水1000mL、加入蛋自酶K，使成為20mg/mL，即為貯存液；使用濃度為50μg/mL）——RNaseA（20μg/mL，10mmol/LTris-HCl（pH8.0）1.21g、15mmol/LNaCl0.89g、RNaseA0.02g，加去離子水使其終濃度為20μg/mL。分裝，－20℃保存備用）——Tris飽和酚——酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）——TE（pH8.0）（10mmol/LTris-Cl（pH8.0）1.21g、lmmol/LEDTA（pH8.0）0.37g、去離子水800mL，調節pH至8.0，用去離子水定容至1000mL）——TaqDNA聚合酶（5U/μL）——dNTPs（每種濃度均為10mmol/L）——50×Tris-冰乙酸（TAE）電泳緩沖液（Tris282.0g、冰乙酸57.10g、0.5mol/LEDTA（pH8.0）100mL，三蒸水定容至1000mL，0.105MPa蒸汽高壓30min，備用）——溴化乙錠溶液（10mg/mL）（三蒸水100mL、溴化乙錠1g，置棕色瓶中，磁力攪拌數小時以確保其完全溶解，然后用鋁箔包裹容器保存于室溫）——1%瓊脂糖凝膠（瓊脂糖1g、TAE電泳緩沖液（50倍）2mL、滅菌三蒸水98mL、微波爐中完全融化，加溴化乙錠溶液）——豬的紅細胞：1%豬紅細胞懸液（用20mL注射器先吸取5mL阿氏液，從健康豬耳靜脈采血10mL左右立即混勻，用pH值6.4的PBS洗滌，3000r/min離心5min，棄掉上清，反復洗滌3次，直至離心后的PBS無血色，棄上清，取出紅細胞泥1mL，加含1%BSA的pH值6.4的PBS稀釋液9mL，混勻后取1mL，稀釋液9mL，即為1%的豬紅細胞懸液）2DB22/T2560—2016——陽性抗原：由指定單位提供或將水貂腸炎病毒疫苗毒MEVB株通過F81傳代細胞培養，其培養物經過滅活制備而成——陰性抗原：由指定單位提供或將生長良好的F81傳代細胞，凍融2～3次，5000r/min離心10min，取上清液備用——陽性血清：由指定單位提供或用水貂腸炎病毒疫苗株的細胞培養物免疫水貂后分離血清制成，或采已知水貂腸炎病毒抗體陽性貂血分離而成——引物：根據MEV國際標準株Abashiri基因序列，在其保守基因序列內設計合成一對特異性引物：引物P1：5’–ACAAGCGGCAAGCAATCCTC–3’，引物P2：5'–CTGCCTCTATTTCGGACCAT–3'，配制成20pmol/μL。–20℃保存5設備——生物安全柜——CO2培養箱——倒置顯微鏡——高速冷凍離心機——組織勻漿器——4℃冰箱——超低溫冰箱——PCR擴增儀——電泳儀——移液器（20μL、200μL、1000μL）——8通道移液器（100μL）無菌取病貂的腸道組織或糞便2g，按1:10的比例用培養液制成勻漿，反復凍融三次，3000r/min離心20min，取上清液經0.22μm微孔濾膜過濾，加入抗生素至終濃度為青霉素2000IU/mL，鏈霉素2000μg/mL，37℃感作1h，冷藏備用。將處理過的樣品同步接種F81細胞，接種量為營養液量的10%，加入營養液，然后37℃恒溫培養箱中吸附24h后，傾去營養液加入維持液，置37℃的5%CO2恒溫培養箱中培養4d～6d，同時設置正常細胞對照。3DB22/T2560—2016接種24h后置顯微鏡下逐日觀察至4d～6d。正常細胞對照成立，接種病料的細胞出現細胞變圓、拉網、脫落等CPE，收獲細胞培養物，放入–80℃冰箱中保存備用。對照細胞與接種樣品細胞均無變化，應盲傳3代。盲傳過程中出現CPE，按上述原則，收獲細胞培養物，放入–80℃冰箱中保存備用；若盲傳3代未出現CPE，則按未分離到水貂腸炎病毒出具結果。6.4病毒鑒定取上述細胞培養物進行HA-HI試驗、PCR、熒光定量PCR和動物回歸試驗等鑒定。7HA-HI試驗7.1樣品采集與處理7.1.1組織與糞便無菌取病貂的腸道組織或糞便2g，按1:20的比例用培養液制成勻漿，反復凍融三次，3000r/min離心20min，取上清液經0.22μm微孔濾膜過濾，加入抗生素至終濃度為青霉素2000IU/mL，鏈霉素2000μg/mL，冷藏備用。7.1.2血清制備趾尖采血，室溫靜置1h后4℃冰箱過夜，吸出血清入離心管中，3000r/min離心5min，取上清液備用。7.2HA試驗在微量板上，從第1孔至10孔以及12孔，用移液器每孔加入pH6.410mM的PBS25μL，用移液器吸取7.1.1待檢樣品25μL，從第1孔起，依次作倍比稀釋，至第10孔，棄去移液器內25μL液體（稀釋倍數依次為2、4、8、16、32…1024），11孔為病毒對照，12孔為紅細胞對照。第1孔至12孔每孔補加pH6.4的PBS25μL，再加入1%豬紅細胞懸液50μL，立即在微量板振蕩器上搖勻后放置4℃靜置60min判定結果。加樣示意圖參見附錄A.1。使50％紅細胞凝集的最高稀釋度，作為病毒的HA效價；HA效價≥1:8則判定為HA陽性，反之則為陰性。7.3HI試驗病毒HA效價（如為1∶256），4個血凝工作單位=256/4=64（即1∶64），取pH6.4的PBS9mL，加血凝素lmL，即成1:10稀釋度，將1:10稀釋液lmL加入到生理鹽水5.4mL中，使最終濃度為1:64。將待檢血清用pH6.4的PBS進行2倍系列稀釋，加入含4單位血凝素的抗原液，并設紅細胞對照和病毒對照，充分振搖后，置37℃作用30min后，加入1%紅細胞懸液，4℃靜置60min，判定結果。加樣示意圖參見附錄A.2。4DB22/T2560—20167.3.3判定標準以使紅細胞凝集被完全抑制的血清最高稀釋度作為判定終點，該最高稀釋度即為被檢血清的HI效價。8PCR8.1DNA提取取6.1中處理樣品200μL，或取病毒細胞培養液200μL，–20℃/室溫反復凍融2～3次，12000r/min離心l0min；將上清液轉入另一離心管中，加入等體積的消化緩沖液及5μL蛋白酶K（20mg/mL）50℃消化2h，12000r/min離心10min；將上清液轉移到一新的離心管中，加入等體積的Tris飽和酚，充分振蕩混勻，12000r/min離心l0min；取上層水相轉移入一新的離心管中，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）混勻后，12000r/min離心l0min（重復此步驟一次）；取上層水相轉移入一新的離心管中，加入2倍體積預冷的無水乙醇，在–20℃放置1h～2h或室溫放置30min以沉淀病毒DNA；12000r/min離心l0min，棄去上清，用70%乙醇洗滌沉淀，自然風干；用10μL含RNaseA（20μg/mL）的TE（pH8.0）溶解沉淀，–20℃保存備用。或按照市售的DNA抽提試劑盒操作說明提取病毒DNA。8.2PCR擴增8.2.1反應體系10×PCRbuffer20mmol/LdNTPs20pmol/μL引物P11.0將PCR反應管置于PCR擴增儀。反應參數為：94℃預變性5min；再進行94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，31個循環；然后72℃延伸5min，最后4℃保存。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。用TAE電泳緩沖液配制成1%瓊脂糖平板（溴化乙錠終濃度0.5μg/mL）。將平板放入水平電泳槽中，加入1×TAE電泳緩沖液剛剛高出凝膠表面，將PCR擴增產物5μL與1μL6×上樣緩沖液混合，分5DB22/T2560—2016別加入樣品孔中，取5μLDNAMarkerDL2000加入到標準分子量對照孔內。5V/cm恒壓電泳30min~45min。8.4結果判定8.4.1用凝膠成像系統進行分析，在陰性和陽性對照成立情況下，如被檢樣品無條帶，則結果為陰性，如被檢樣品有條帶，大小為194bp，即判定為水貂腸炎病毒核酸陽性。必要時取PCR擴增產物進行序列測定，進一步確認待測樣品的結果。8.4.2如果出現與設計長度不同的條帶，為非特異性反應，需重復試驗，兩次試驗均為非特異性反應時，可判為陰性。9Real-timePCR9.1DNA提取按照6.1或按照DNA抽提試劑盒操作說明提取病毒DNA。9.2熒光PCR檢測9.2.1反應體系20pmol/μL引物P120pmol/μL引物P2PCR-gradewaterTotalVolume在檢測區進行，將9.2.1中加樣后的PCR管放入熒光定量PCR檢測儀內，記錄樣本擺放順序。反應參數設置見表36DB22/T2560—2016表3反應參數設置步驟階段預變性變性溫度（°C）時間（s）收集信號循環數129594305否否是是140復性擴增熔解5430360～95120019.3結果分析9.3.1擴增分析設置閾值：確認閾值線位于指數增長階段；設置基線：確定PCR擴增曲線的最小Ct值，然后將基線的范圍設定在最小Ct值減去3；保存設置，用樣品名作為文件名，將數據輸出為Excel文件。9.3.2熔點曲線分析熔點曲線：大多數實時熒光定量PCR儀，當在SYBR?Green模式下運行時，會自動進行熔點曲線分析；熔點曲線分析：每一反應孔的熔點曲線分析所得到的熔點溫度“Tm”值（參照資料性附錄B.2）。陰性對照無Ct值并且無擴增曲線和熔點曲線；陽性對照的Ct值應≤30.0，并出現特定的擴增曲線和9.3.4結果描述及判定無Ct值并且無擴增曲線和熔點曲線，表明樣品中無水貂腸炎病毒核酸；Ct≤30.0，且出現特定的擴增曲線和熔點曲線，表示樣品中存在水貂腸炎病毒核酸。選擇水貂腸炎病毒HI抗體效價≤1∶4的3月齡的健康水貂10只，分兩組每組5只，人工感染組5只經胃管灌服分離鑒定獲得的病毒液8mL/只，腹腔注射2mL/只。對照組5只，每只灌服注射相同體積的細胞培養物，分別隔離觀察飼養10d，每天觀察試驗及對照水貂的臨床癥狀，測定體溫；并于接種第3d開始收集水貂糞便，按照7中步驟進行MEV的HA檢測。10.2.1感染動物臨床觀察評分標準評分標準見表4。7DB22/T2560—2016表4評分標準臨床觀察項目發病死亡賦分值54111腹瀉，糞便稀軟、呈黃色、灰白色或粉紅色甚至煤焦油狀體溫升高至40℃以上，并持續2d以上精神沉郁，食欲減退或廢絕糞便HA效價≥1:810.2.2判定標準對照組動物無10.2.1描述的任何癥狀，試驗組動物