乙型肝炎病毒核苷(酸)類似物耐藥的監(jiān)測(cè)

繆曉輝2009.5一、HBV耐藥的有關(guān)定義二、各種耐藥檢測(cè)技術(shù)的評(píng)價(jià)三、需要重視的幾個(gè)問題一、HBV耐藥的有關(guān)定義

病毒學(xué)突破（virologicbreakthrough）病毒反跳（viralrebound）生化學(xué)突破（biochemicalbreakthrough）HBV基因型耐藥（genotypicresistance）HBV表型耐藥（phenotypicresistance）臨床耐藥（clinicalresistance）HBV耐藥的有關(guān)定義

病毒學(xué)突破（virologicbreakthrough）指在核苷類藥物治療過程中，患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBVDNA水平與最低值相比上升或超過1個(gè)log10（10倍）。HBV耐藥的有關(guān)定義

病毒反跳（viralrebound）指核苷類藥物治療過程中患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBVDNA升高至＞2×104IU/mL或高于治療前水平。

HBV耐藥的有關(guān)定義

生化學(xué)突破（biochemicalbreakthrough）指在核苷類藥物治療過程中血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平一度復(fù)常，但在繼續(xù)治療中血清ALT水平又再次升高。肝臟生活指標(biāo)很多，但是在此僅指ALT。HBV耐藥的有關(guān)定義

HBV基因型耐藥（genotypicresistance）指HBV基因組中的某些位點(diǎn)發(fā)生改變，導(dǎo)致這種藥物對(duì)HBV的抑制作用下降或消失。這種HBV基因變異與HBV的耐藥性有直接因果關(guān)系，通過這些變異位點(diǎn)的檢測(cè)可判斷HBV有無(wú)耐藥性。HBV耐藥的有關(guān)定義

HBV表型耐藥（phenotypicresistance）通過體外細(xì)胞培養(yǎng)方法，直接測(cè)定HBV對(duì)某種藥物的敏感性，或者在體外直接測(cè)定HBV聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐藥，即表型耐藥。通常以IC50來(lái)評(píng)估IC50＜5倍:敏感IC50在5～10倍:部分耐藥IC50

＞10倍:耐藥HBV耐藥的有關(guān)定義

臨床耐藥（clinicalresistance）指臨床出現(xiàn)病毒復(fù)制不能被抑制，或HBV復(fù)制一度被抑制后又出現(xiàn)HBVDNA反跳，同時(shí)伴有ALT升高，或肝炎復(fù)發(fā)的其他臨床證據(jù)。二、各種耐藥檢測(cè)技術(shù)及評(píng)價(jià)病毒學(xué)反跳或突破的監(jiān)測(cè)HBV基因型耐藥監(jiān)測(cè)HBV表型耐藥檢測(cè)臨床耐藥監(jiān)測(cè)病毒學(xué)反跳或突破的監(jiān)測(cè)基于對(duì)血清HBVDNA載量的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)需重視以下三點(diǎn)：1.HBVDNA載量檢測(cè)手段的敏感性2.檢測(cè)技術(shù)的可靠性和穩(wěn)定性3.監(jiān)測(cè)的間隔時(shí)間HBV基因型耐藥監(jiān)測(cè)時(shí)機(jī)非必須不主張常規(guī)、廣泛應(yīng)用基因型耐藥相關(guān)變異的命名基因型耐藥相關(guān)變異

在HBV多聚酶序列中的位置HBV基因型耐藥的主要技術(shù)堿基序列分析法直接測(cè)序克隆測(cè)序聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)反向雜交分析技術(shù)（INNO—LiPA）基因芯片技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù)引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù)熔解曲線法基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)直接測(cè)序法末端終止法化學(xué)裂解法DNA測(cè)序自動(dòng)化使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)，用ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長(zhǎng)度僅相差1個(gè)核苷酸的ssDNA，從而完成測(cè)序的方法。用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長(zhǎng)度的短鏈，經(jīng)過PAGE放射自顯影可直讀DNA順序。類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標(biāo)記，計(jì)算機(jī)自動(dòng)讀出。優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)便、迅速、應(yīng)用廣泛。不需酶促反應(yīng)，可以對(duì)寡核苷酸測(cè)序。①簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確可靠。②安全、無(wú)放射性污染。③模板用量大大減少。④測(cè)序能力增強(qiáng)。HBVYMDD變異直接測(cè)序結(jié)果圖譜直接DNA測(cè)序的局限性1.設(shè)備貴、技術(shù)高、耗材、費(fèi)時(shí)。2.必須有充足目的基因片段。3.突變株比例小于20%時(shí)，由于競(jìng)爭(zhēng)抑制作用不能被擴(kuò)增。直接測(cè)序法檢測(cè)HBVYMDD變異1.JPG克隆測(cè)序法克隆測(cè)序法優(yōu)點(diǎn)：1.有助于發(fā)現(xiàn)混合株并可大致確定不同序列毒株之間的相對(duì)比。2.提高了檢測(cè)的靈敏度。局限性：1.技術(shù)難度較高。2.檢測(cè)周期更長(zhǎng)。3.檢測(cè)的費(fèi)用大大增加。

堿基變異可能導(dǎo)致：①原有位點(diǎn)消失②產(chǎn)生新的位點(diǎn)③識(shí)別位點(diǎn)移位

利用錯(cuò)配引物使PCR產(chǎn)物中產(chǎn)生特異的酶切位點(diǎn)結(jié)果:酶切片段長(zhǎng)、短變化和多、少變化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)限制性內(nèi)切核酸酶的作用它們能識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別序列內(nèi)或其旁切割雙鏈DNA。如：NdeI限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)：CA

TATGGTATACNlaIll限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)：CATGNNNGTACNNNPCR-RFLP檢測(cè)HBVYMDD變異PCR錯(cuò)配引物設(shè)計(jì)PCR-RFLP檢測(cè)HBVYMDD變異PCR-RFLP檢測(cè)HBVYMDD變異PCR-RFLP技術(shù)的評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、廣泛易開展。缺點(diǎn)：1.限制性內(nèi)切酶種類有限。2.錯(cuò)配引物將導(dǎo)致退火溫度降低、非特異條帶增多。3.引物非完全匹配，可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低、檢測(cè)敏感的下降。

反向雜交分析技術(shù)（INNO—LiPA）INNO—LiPA診斷HBVYMDD變異DNA芯片技術(shù)BiologicalSampleAnalyzedataScannermicroarray“Hybridize”arrayerMicroarrayfabricationSamplepreparationMolecularhybridizationDetectionandanalysisDNA芯片技術(shù)診斷HBVYMDD變異DetectionofYMDDMotifMutantsbyOligonucleotideChipsinLamivudine-UntreatedPatientswithChronicHepatitisBVirusInfection。JKoreanMedSci2004;19:541-546.DNA芯片技術(shù)優(yōu)點(diǎn)局限性大通量技術(shù)和設(shè)備的要求高快速檢測(cè)成本高靈敏度高可平行檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR在基因變異中的應(yīng)用探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù)Taqman-MGB探針引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù)高分辨熔解曲線法Taqman-MGB探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù)Taqman-MGB探針技術(shù)檢測(cè)YMDD變異HBVDNA>105copies/mlW:M=1:1HBVDNA>105copies/mlW:M=10:1HBVDNA<105copies/mlW:M=10:1：W：M探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù)

優(yōu)點(diǎn)不足

靈敏度高需要相對(duì)較貴的熒光PCR儀特異性好需要多條熒光探針，成本高費(fèi)時(shí)短影響因素多，存在一定誤判引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù)引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù)

檢測(cè)YMDD變異熔解曲線法檢測(cè)YMDD變異特異性探針，其Tm值不同溶解曲線分析基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)原理MALDI-TOFMS檢測(cè)

HBVYMDD變異的原理酶切分子量.JPG基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)優(yōu)點(diǎn)：高靈敏度、準(zhǔn)確度、分辨率能發(fā)現(xiàn)相對(duì)比例小于1%的變異株。局限性：設(shè)備昂貴，目前國(guó)內(nèi)難以用于臨床檢測(cè)。HBV耐藥不同檢測(cè)技術(shù)的比較AdvancesinMolecularDiagnosisofHBVInfectionandDrugResistance。Int.J.Med.Sci.20052(1)：8-161Sensitivityherereferstothelowestlevel(%)atwhichanassaycandetectmixturesofmutantandwild-typevirus.2Informationcontentisconsideredasameasureofatest’sabilitytoprovidebroad,relevantinformationaboutpossiblenewmutations.3Updateabilityassessestheeaseatwhichatestcanbedaptedtoincorporatethedetectionofanewmutation.na,notapplicable.nd,notdetermined.HBV表型耐藥檢測(cè)有兩種途徑：1.細(xì)胞外HBV聚合酶活性分析。2.細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞外HBV聚合酶活性分析目前常用的研究HBV聚合酶活性模型是將HBV基因組插入桿狀病毒載體，繼而轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞而表達(dá)HBV顆粒，應(yīng)用親和層析法純化HBV顆粒后，在細(xì)胞外評(píng)價(jià)藥物對(duì)聚合酶活性的影響。細(xì)胞外HBV聚合酶活性分析細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)該方法類似于細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn)。目前多采用病毒載體將含有被檢測(cè)的含HBV變異位點(diǎn)的全基因組導(dǎo)入肝細(xì)胞源性細(xì)胞株，然后將各種濃度的核苷類藥物加入培養(yǎng)液，經(jīng)過一定時(shí)間培養(yǎng)后檢測(cè)細(xì)胞上清中的HBVDNA含量。

細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)該技術(shù)在操作上非常繁瑣，目前僅限于研究之需，主要用于藥物開發(fā)研究，尚不能用于常規(guī)臨床分析。臨床耐藥監(jiān)測(cè)YMDD變異前后病毒載量和ALT的變化HBVMDD變異與病毒學(xué)突破判斷臨床耐藥時(shí)的建議1.結(jié)合核苷類藥物的應(yīng)用史、起始病毒載量、是否合并其他肝病等。2.注意甄別依從性不良。3.結(jié)合基因變異位點(diǎn)。三、需要重視的幾個(gè)問題慎重對(duì)待天然耐藥的結(jié)論。不要過分依基因型耐藥檢測(cè)技術(shù)。正確對(duì)待基因分型技術(shù)。

YMDD自然變異的幾組數(shù)據(jù)AkarsuM等采用InnoLipa法檢測(cè)71例未經(jīng)抗病毒的成年慢性乙肝攜帶者，結(jié)果有13例檢測(cè)到Y(jié)MDD變異株。LeeCZ等采用引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù)對(duì)28例拉米夫定治療前的CHB患者血清進(jìn)行了YMDD變異毒株檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有16例（57.1%）存在YMDD自然變異毒株。日本Kobayashi等檢測(cè)18例無(wú)癥狀HBV攜帶者,發(fā)現(xiàn)5例YMDD變異,占27.78%。本實(shí)驗(yàn)室關(guān)于YMDD自然變異

的2組數(shù)據(jù)196例CHB患者中，檢出存在YMDD變異毒株者共21例，檢出率為10.7%。其中YVDD陽(yáng)性20例，YIDD陽(yáng)性1例，YVDD和YIDD同時(shí)陽(yáng)性者0例。183例CHB患者中，檢出存在YMDD突變毒株者共40例，檢出率為21.86%。其中YVDD陽(yáng)性36例，YIDD陽(yáng)性3例，YVDD和YIDD同時(shí)陽(yáng)性者1例。VS不要過分依基因型耐藥檢測(cè)技術(shù)

基因型耐藥變異并非必須。目前我國(guó)尚無(wú)SFDA批準(zhǔn)的商品化試劑盒或被普遍認(rèn)可的檢測(cè)技術(shù)。

正確對(duì)待HBV基因型

與核苷類似物療效之間的關(guān)系

基因型是一種人為的分類方式。HBV的基因型與各種核苷類藥物的療效之間的關(guān)系還沒有確定的結(jié)論。P區(qū)基因的變異對(duì)S區(qū)基因的影響。

結(jié)語(yǔ)加深認(rèn)識(shí)適時(shí)監(jiān)測(cè)及時(shí)發(fā)現(xiàn)正確管理謝謝！9、青少年是一個(gè)美好而又是一去不可再得的時(shí)期，是將來(lái)一切光明和幸福的開端。。5月-255月-25Saturday,May10,202510、人的志向通常和他們的能力成正比例。14:25:2914:25:2914:255/10/20252:25:29PM11、夫?qū)W須志也，才須學(xué)也，非學(xué)無(wú)以廣才，非志無(wú)以成學(xué)。5月-2514:25:2914:25May-2510-May-2512、越是無(wú)能的人，越喜歡挑剔別人的錯(cuò)兒。14:25:2914:25:2914:25Saturday,May10,202513、志不立，天下無(wú)可成之事。5月-255月-2514:25:2914:25:29May10,2025