植物組織培養(yǎng)

參考教材：鞏振輝,申書興主編.植物組織培養(yǎng)（第二版）.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2013吳殿星,胡繁榮主編.植物組織培養(yǎng)（第二版）.上海:上海交通大學(xué)出版社,2009王蒂主編.植物組織培養(yǎng).北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2004劉振祥,廖旭輝主編.植物組織培養(yǎng)技術(shù).北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2008呂晉慧,孔冬梅主編.園藝植物組織培養(yǎng).北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)出版社,2008王家福主編.花卉組織培養(yǎng)與快繁技術(shù).北京:中國林業(yè)出版社,2006中國減排目標(biāo)：2020年單位GDP二氧化碳排放比2005年降低40%~45%；非化石能源占一次能源消費(fèi)15%；2020年森林面積比2005年增4000萬公頃；到2050年開始減少碳排放。0緒論0.1植物組織培養(yǎng)的簡介0.1.1植物組織培養(yǎng)的概念植物組織培養(yǎng)（planttissueculture）：是指在無菌和人工控制的環(huán)境條件下，利用人工培養(yǎng)基，對離體的植物胚胎、器官、組織、細(xì)胞及原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)，使其再生細(xì)胞或完整植株的技術(shù)。又稱為植物離體培養(yǎng)（plantcultureinvitro）。植物組織培養(yǎng)是一門研究植物離體培養(yǎng)的生物技術(shù)學(xué)科。基礎(chǔ)學(xué)科：植物生理學(xué)無菌：無真菌、細(xì)菌、病毒等微生物。人工控制的環(huán)境條件：光照、溫度、濕度、氣體等。離體生態(tài)學(xué)（invitroecology）：是指研究離體培養(yǎng)環(huán)境條件控制的科學(xué)，其研究對象是培養(yǎng)基、植物材料和人工環(huán)境條件。外植體（explant）：用于離體培養(yǎng)的那部分植物器官、組織或細(xì)胞。愈傷組織（callus）：是指外植體因受傷或在離體培養(yǎng)時，其細(xì)胞進(jìn)行活躍的分裂增殖而形成的一種無特定結(jié)構(gòu)和功能的組織。采用微生物學(xué)的實驗手段來操作植物離體的器官、組織和細(xì)胞。0.1.2植物組織培養(yǎng)的特點(diǎn)具體表現(xiàn)為以下方面：組培技術(shù)是無菌操作技術(shù)。組培材料處于完全的異養(yǎng)狀態(tài)。組培材料可以是離體狀態(tài)的器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體。組織培養(yǎng)物可以形成克隆（clone，無性繁殖系），也可以進(jìn)行莖芽增殖或生根。組培容器內(nèi)的氣體和環(huán)境氣體可通過封口材料進(jìn)行交換，相對濕度通常是幾乎100％，因此，組培苗葉片表面一般都無角質(zhì)層或蠟質(zhì)層，且氣孔保衛(wèi)細(xì)胞功能缺乏，氣孔始終都是張開的。組培的環(huán)境溫度、光照強(qiáng)度和時間都是人為設(shè)定的，其參數(shù)可調(diào)。0.1.3植物組織培養(yǎng)的研究類型和任務(wù)組織培養(yǎng)：分生組織、形成層組織、薄壁組織、韌皮部組織等。器官培養(yǎng)：根、莖、葉、花、果實、種子。胚胎培養(yǎng)：幼胚、成熟胚、胚乳、胚珠、子房等。細(xì)胞培養(yǎng)：單細(xì)胞或較小細(xì)胞團(tuán)，如性細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、根尖細(xì)胞、韌皮部細(xì)胞等。原生質(zhì)體培養(yǎng)研究任務(wù)：研究離體培養(yǎng)條件下，細(xì)胞、組織或器官所需營養(yǎng)條件和環(huán)境條件，細(xì)胞、組織或器官的形態(tài)發(fā)生和代謝規(guī)律，植物脫毒方法和機(jī)理，植物特別是一些難繁植物的大量快速繁殖方法，細(xì)胞融合方法和機(jī)理，再生個體的遺傳和變異，種質(zhì)資源的離體保存機(jī)理和方法等。0.2植物組織培養(yǎng)的形成和發(fā)展

開創(chuàng)階段（上世紀(jì)初－上世紀(jì)30年代末）1.Schleiden和Schwann

植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)源于德國植物學(xué)家Schleiden和動物學(xué)家Schwann于1838-1839年提出的細(xì)胞學(xué)說：一切生物都是由細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞是生物體的基本功能單位，細(xì)胞只能由細(xì)胞分裂而來。2.Haberlandt

德國植物學(xué)家Haberlandt被公認(rèn)為是植物組織培養(yǎng)之父，他于1902年發(fā)表的植物組織培養(yǎng)的第一篇論文：提出了植物細(xì)胞具有全能性，構(gòu)思了細(xì)胞培養(yǎng)的概念。Haberlandt選擇了柵欄組織細(xì)胞、髓部細(xì)胞、雄蕊絨毛以及氣孔保衛(wèi)細(xì)胞進(jìn)行實驗，將這些細(xì)胞培養(yǎng)在有機(jī)物豐富并含有葡萄糖的Knop培養(yǎng)液中，在無菌條件下進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞沒有分裂，但存活了幾個星期并有生長。失敗的主要原因：1）實驗材料高度分化。Haberlandt沒有意識到，由于可進(jìn)行光合作用的細(xì)胞相應(yīng)地已經(jīng)分化了，它們的分生組織潛能不容易表達(dá)。2）培養(yǎng)基過于簡單。Haberlandt不知道細(xì)胞脫分化成為分生組織狀態(tài)需要刺激物質(zhì)，植物生長調(diào)節(jié)劑當(dāng)時還未發(fā)現(xiàn)。3.KotteandRobbins

1922年，植物離體組織培養(yǎng)取得了一些進(jìn)展。德國人Kotte和美國人Robbins兩人同時分別獨(dú)立地將分生組織作為外植體。Kotte研究切下的根尖，如豌豆、玉米根尖，將它們放在含有Knop溶液鹽成分、葡萄糖、含氮化合物如天冬酰氨酸、丙氨酸以及肉汁的各種營養(yǎng)液中。Kotte觀察到根尖生長持續(xù)了2周，但他沒有進(jìn)行繼代培養(yǎng)。另一方面Robbins通過繼代，將玉米根尖離體培養(yǎng)了更長的時間，但隨著時間延長，生長量減少，最后消失。4.Hanning、Knudson和Laibach1904年，Hanning在無機(jī)鹽和蔗糖溶液中對蘿卜和辣根菜的胚進(jìn)行了培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)離體胚可以充分發(fā)育成熟，并提早萌發(fā)形成小苗。1922年，Knudson采用胚培養(yǎng)法獲得了大量的蘭花幼苗。1925年，Laibach培養(yǎng)亞麻種間雜交幼胚獲得成功，證明了胚培養(yǎng)在植物遠(yuǎn)源雜交中利用的可能性。在植物組織培養(yǎng)研究的開創(chuàng)時期，由于影響植物組織和細(xì)胞增殖及形態(tài)發(fā)生能力的因素尚不清楚，培養(yǎng)材料的選擇十分重要，在30多年的探索實驗中，植物組織培養(yǎng)幾乎沒有大的進(jìn)展。奠基階段

（上世紀(jì)30年代－上世紀(jì)50年代末）1.李繼侗和沈同1933年，他們首次報道了利用天然提取物成功進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的研究。利用加有銀杏胚乳提取物的培養(yǎng)基，成功培養(yǎng)了銀杏的胚。2.White、GautheretandNobecourt1934年，美國植物生理學(xué)家White用添加了酵母提取物（YE）的培養(yǎng)基進(jìn)行了番茄根的離體培養(yǎng)，建立了第一個活躍生長并能繼代增殖的無性繁殖系，從而使非胚器官培養(yǎng)首次獲得成功。同年，法國學(xué)者Gautheret在添加了YE和水解酪蛋白（CH）的固體培養(yǎng)基上，使山毛櫸和歐洲黑楊的形成層培養(yǎng)物連續(xù)增殖了幾個月，這是固體培養(yǎng)基在植物組織培養(yǎng)上的首次成功應(yīng)用。1937年，White又發(fā)現(xiàn)酵母提取物的作用可以被B-族維生素（硫胺素，VB6，煙酸）所取代，建立了第一個由已知化合物組成的培養(yǎng)基。1939年，White建立了連續(xù)生長的煙草雜種培養(yǎng)物。同時期，Gautheret在山毛櫸和胡蘿卜形成層、Nobecourt在胡蘿卜根和馬鈴薯塊莖上也建立了連續(xù)生長的培養(yǎng)物。WhiteGautheretNobecourtWhite和Gautheret獲得的愈傷組織，由含有大液泡的薄壁組織組成。3.Skoog和Miller1954年，Skoog于做了一個著名的實驗。在煙草愈傷組織培養(yǎng)中用了變質(zhì)的鯡魚精子DNA，發(fā)現(xiàn)它可促使愈傷組織加快生長。有效成分存在于變質(zhì)的DNA樣品或者經(jīng)高壓滅菌后的新鮮樣品中，他指出有效成分是降解的DNA產(chǎn)物。1955年，他把這種物質(zhì)命名為激動素（KT）。1956年，Miller首次從鯡魚精子中分離出激動素。Skoog

Skoog和Miller的煙草髓部愈傷組織培養(yǎng)實驗1957年，Skoog和Miller提出激素控制器官形成的觀點(diǎn)。在這篇著名的論文中，他們提到在煙草髓部愈傷組織培養(yǎng)中，根和芽的分化由生長素和細(xì)胞分裂素的比率決定，并且器官分化可以通過改變培養(yǎng)基中兩種激素的濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)。高濃度的生長素誘導(dǎo)生根，而高濃度的細(xì)胞分裂素促進(jìn)芽的形成。兩者濃度相當(dāng)時則傾向于未分化樣式的生長。這一對激素調(diào)節(jié)器官分化的觀點(diǎn)現(xiàn)在已在大多數(shù)植物種類中被證實。4.Muir、Steward和Reinert1953年，Muir利用往復(fù)式搖床的振蕩，在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行了萬壽菊和煙草愈傷組織的培養(yǎng)，獲得了單細(xì)胞或密集細(xì)胞的懸浮液，并可繼代增殖。這既是培養(yǎng)方法上的突破，也是Haberlandt培養(yǎng)單細(xì)胞設(shè)想的實現(xiàn)。1958年，英國學(xué)者Steward和Reinert幾乎同時在胡蘿卜根組織的韌皮部單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中誘導(dǎo)出胚狀體，并長成完整植株。證實了Haberlandt的細(xì)胞全能性理論。

建立和發(fā)展階段（上世紀(jì)60年代至今）從植物細(xì)胞全能性理論的提出到其被實驗科學(xué)地證實，植物組織培養(yǎng)研究領(lǐng)域走過了近60年的發(fā)展歷程。當(dāng)影響植物細(xì)胞分裂和器官形成的機(jī)理被揭示后，學(xué)者們對該領(lǐng)域進(jìn)行了全面研究，獲得的成果枝繁葉茂，發(fā)表的文章浩如煙海，形成了一套成熟的植物組織培養(yǎng)的理論體系和技術(shù)方法，擁有著極其廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域，從而在生物科學(xué)中建成了這門具有理論、技術(shù)和應(yīng)用的科學(xué)。1.Thimann和Wickson1958年，他們發(fā)現(xiàn)腋芽（當(dāng)頂芽存在時為休眠狀態(tài)）的生長，可以通過外源細(xì)胞分裂素的應(yīng)用而啟動。這樣，將莖段培養(yǎng)在含有細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上，就可以在一個具有完整頂芽的生長中的莖上誘導(dǎo)側(cè)芽的形成。這將消除頂端優(yōu)勢，得到大量不定芽。Thimann2.Morel－脫毒、快繁商業(yè)化1952年，

Morel和Martin提出了植物脫毒（virusfree）技術(shù)，通過分離已被病毒感染的大麗花個體的根尖，并將其離體培養(yǎng)，重新獲得了無病毒的大麗花。1960年，Morel利用蘭花莖尖培養(yǎng)，實現(xiàn)了脫毒和快速繁殖（rapidclonepropagation）的兩個目的。這一技術(shù)導(dǎo)致歐洲、美洲和東南亞許多國家“蘭花工業(yè)”的興起。Morel3.MurashingeMurashinge發(fā)展了一套標(biāo)準(zhǔn)的離體繁殖方法，將這一技術(shù)廣泛普及。與Skoog一起篩選出至今仍被廣泛應(yīng)用的MS培養(yǎng)基。4.Guha和Maheshwari等——花藥培養(yǎng)1964-1966年，印度學(xué)者Guha和Maheshwari成功地由曼陀羅花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株，開創(chuàng)了花粉培育單倍體的新途徑。1973年，Nitsch采用花藥預(yù)培養(yǎng)方法獲得了煙草花粉植株的純合二倍體。1974年，Sunderland建立了散落花粉系列培養(yǎng)法。1982年，Ghandimathi和Imamura直接分離花粉進(jìn)行培養(yǎng)成功，建立了一個適于深入研究雄核發(fā)育的實驗體系。MaheshwariNitschNitsch發(fā)展了培養(yǎng)煙草和曼陀羅小孢子的技術(shù)、單倍體染色體加倍的技術(shù)，并且在5個月之內(nèi)收集到二倍體純合子的種子（Nitsch,1974,1977）。5.Cocking等-原生質(zhì)體培養(yǎng)1960年，英國學(xué)者Cocking首次用酶解方法獲得了原生質(zhì)體，開創(chuàng)了植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的研究。1971年，日本學(xué)者Nagata和Takebe首次將煙草葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)出再生植株。1985年，F(xiàn)ujimura獲得首例禾谷類——水稻的原生質(zhì)體培養(yǎng)的再生植株。1986年，Spangenberg獲得了甘藍(lán)型油菜的原生質(zhì)體培養(yǎng)的再生植株。Cocking6.Carlson等——原生質(zhì)體融合1972年，Carlson利用硝酸鈉進(jìn)行了煙草種間原生質(zhì)體的融合實驗，獲得了首株體細(xì)胞種間雜種植株。1974年，Kao利用聚乙二醇（PEG）進(jìn)行了大豆和煙草科間原生質(zhì)體的融合，獲得了3％的異質(zhì)體。同年，Bonne和Eriksson利用PEG成功進(jìn)行了具有葉綠體的海藻和不具有葉綠體的胡蘿卜根原生質(zhì)體的融合。1978年，Melchers獲得了首個屬間雜種植株（馬鈴薯番茄）。1981年，Zimmerman提出了原生質(zhì)體融合的新方法——電融合。Melchers植物遺傳操作成功的前景引起了大眾的興趣。Melchers和他的同事（1978年）通過將馬鈴薯和番茄原生質(zhì)體融合，允許遺傳信息在兩個不同的有機(jī)體中移動，獲得了一個雜種植物。這一方法提供了獲得親緣相近但生殖隔離的種間雜種的機(jī)會。7.Kaul等——次生代謝物生產(chǎn)1969年，Kaul發(fā)現(xiàn)三角葉薯蕷懸浮培養(yǎng)物可以生產(chǎn)薯蕷皂苷配基。1973年，F(xiàn)uruya和Ishii發(fā)現(xiàn)人參培養(yǎng)細(xì)胞可以產(chǎn)生人參皂苷。Nickell組織培養(yǎng)的先驅(qū)，尤其是在培養(yǎng)中次生代謝物質(zhì)的生產(chǎn)方面。Street－培養(yǎng)設(shè)施化Street和他的助手開創(chuàng)了各種細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的程序（恒化器和恒濁器）。0.3植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用及展望快繁和脫毒育種次生代謝物生產(chǎn)種質(zhì)保存在遺傳、生理、生化、病理等研究上的應(yīng)用1.離體快繁（試管苗和人工種子）和脫毒1）試管苗在生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛、經(jīng)濟(jì)效益較大。特點(diǎn)：繁殖系數(shù)大、速度快，苗木整齊一致，周年生產(chǎn)。一個單株一年繁殖幾萬到幾百萬個植株。葡萄：3萬，蘭花：400萬，草莓：108。尤其適用于“名、優(yōu)、特、新、奇”品種、脫毒苗、優(yōu)良單株、瀕危植物和基因工程植株等的繁殖。目前園藝作物及經(jīng)濟(jì)林木等部分或大部分都用離體快繁提供苗木。美國Wyford國際公司年產(chǎn)花卉、蔬菜、果樹及林木的組培苗3000萬株。以色列Benzur苗圃年產(chǎn)觀賞植物組培苗800萬株。我國工廠化生產(chǎn)的組培苗有：香蕉、甘蔗、桉樹、葡萄、蘋果、脫毒草莓、脫毒馬鈴薯、非洲菊、蘆薈。Fig.1.Masspropagationofmultipleshoot

culturesof

Artemisiaannua

青蒿2）人工種子（artificialseed）人工種子的概念是1978年Murashinge首次提出的，它是指植物離體培養(yǎng)中產(chǎn)生的胚狀體或不定芽，被包裹在含有養(yǎng)分和保護(hù)功能的人工胚乳和人工種皮中，從而形成能發(fā)芽出苗的顆粒體。具有試管苗的優(yōu)點(diǎn)外，還具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）便于貯藏和運(yùn)輸、可直接播種和機(jī)械化操作；2）可在人工種子中加入抗生素、菌肥、農(nóng)藥等成分，提高種子活力和品質(zhì)。前途是光明的，道路是曲折的。人工種子3）脫毒苗木培育很多作物特別是無性繁殖作物都帶有病毒，影響產(chǎn)量和質(zhì)量，對生產(chǎn)造成極大損失。草莓主要病毒有4種，大蒜和馬鈴薯的病毒有10多種。感病植株并非每個部位都帶有病毒，生長點(diǎn)附近的病毒濃度很低甚至無毒。利用莖尖組培，再生植株就可脫毒，獲得脫毒苗。應(yīng)用：水果（甘蔗、菠蘿、香蕉、葡萄、草莓等）、蔬菜（馬鈴薯、大蒜、洋蔥等）、花卉（蘭花、菊花、唐菖蒲等）等。莖尖培養(yǎng)用于脫毒2.培育新品種或創(chuàng)制新物種單倍體育種離體選擇突變體培育遠(yuǎn)源雜種基因工程育種單倍體育種手段：花藥和花粉培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：所有基因均能表現(xiàn)，基因型可快速純合。成果：已育成大面積種植的品種。1974年我國育成第一個新品種——煙草單育1號，此后還育出水稻中花8號、小麥京花1號和大量花培新品系。單倍體植株單倍體加倍離體選擇突變體愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞易變異、細(xì)胞數(shù)量大，有利于突變體篩選。多用于抗性篩選。已選出一些抗病、抗鹽、高賴氨酸、高蛋白的突變體，有些已用于生產(chǎn)。體細(xì)胞變異突變體篩選培育遠(yuǎn)源雜種胚培養(yǎng)可克服受精后障礙導(dǎo)致的遠(yuǎn)源雜交不孕，產(chǎn)生遠(yuǎn)源雜交后代，育成新物種。已育成蘋果和梨、大白菜和甘藍(lán)、栽培棉和野生棉等雜交種。原生質(zhì)體融合可克服有性雜交不親和性，獲得體細(xì)胞雜種。已獲得馬鈴薯和番茄、煙草和