《薰衣草蜂蜜植物源成分的檢測實時熒光PCR法》行業標準編制說明一、工作簡況《薰衣草蜂蜜植物源成分的檢測實時熒光PCR法》行業標準是根據《中華全國供銷合作總社辦公廳關于組織申報2023年供銷合作社歸口標準體系與行業品牌建設及維護項目的通知》(供銷廳科社[2023]38號)文件要求，中國計量大學牽頭負責《薰衣草蜂蜜植物源求，起草、編制了《薰衣草蜂蜜植物源成分的檢測實時熒光PCR法》行業標準(草案)。二、標準制定原則和主要內容說明潤腸通便，逐漸受到廣大消費者的青睞。由于薰衣草蜂蜜流蜜期短(6月中旬至7月初，以及8月末至9月初),且產地主要來自新疆，更顯珍貴稀少。部分蜂農和廠家混入雜花蜜1356-2021,建立了枇杷蜜植物源的檢測方法。以上標準均未涉及薰衣草等特有蜜源植物，因此，本項目擬利用real-timeqPCR(TaqM標準起草小組根據GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準的結構和編寫規則》2.2本標準適用于采用實時熒光PCR法測定薰衣草作為蜜源的蜂蜜中特有植物源DNA成分的三、主要試驗(或驗證)情況分析3.1測定案例樣品收集為市售不同規格的薰衣草蜂蜜共10份，其樣品信息和波美度、糖度、水分信息如表1所示。表1.薰衣草蜂蜜樣品信息3.1.1.2儀器設備實驗所涉及到的主要儀器有ThermoFisherscientific公司生產的ST16R冷凍離心機與Legendmicrol7小型離心機；ThermoFisherscientific公司生產的StepOnePlusReal-TimePCRSystem;上海一恒科技有限公司0.5g亞硫酸氫鈉和2g聚乙烯吡咯烷酮-40,充分振蕩混勻，制成100ml提取工作液。工表2.提取工作液所用試劑配制方法山梨醇23.3g2.4g至8.0,并定容至200mL至8.0,并定容至200mL容量瓶中5%十二烷基肌氨酸鈉聚乙烯吡咯烷酮-40分別取25g蜂蜜樣品，與30mL無菌水混合，振蕩混勻。8000r/min,4℃離心25min。棄上清，將沉淀溶解于1mL(3.1.2.1)現配的工作液中。充分混勻后，于37℃水浴過夜。次日，向樣品中加入等體積氯仿/異戊醇(體積比24:1),緩慢顛倒混勻10min,12000薰衣草(ITS基因)引物和探針詳見表3。表3.薰衣草ITS基因擴增引物及探針序列引物/探針序列(5'→3')產物長度(bp)薰衣草F:GCAGCGTTCGGGCTTAAR:CAACTTGCGTTCAAAGACTCP:FAM-GGGCAGCGGGCGTCTATCGAATGTCA3.1.4實時熒光PCR反應3.1.4.1反應試劑和儀器熒光定量PCR儀為ThermoFisherscientific公司生產的StepOnePlusReal-TimePCR實時熒光PCR反應體系配制見表4,所有樣品和對照重復2次，配制反應液時盡量避光表4.實時熒光PCR反應體系配制表終濃度熒光PCR反劑(2×)樣品總量3.1.4.3反應參數和條件預變性95℃30s,然后95℃5s、60℃30s,45個循環。試驗過程中觀察PCR熒3.1.4.4結果判定3.1.5薰衣草蜂蜜實時熒光PCR法子、芝麻、椴樹、荷、五倍子、石榴、玉米、荊條、棗、紫云英26種植物DNA作為陰性對照，以ddH?O作為空白對照，對薰衣草ITS基因進行實時熒光PCR擴增，均進行2個重復，3.1.5.2蜂蜜樣品實時熒光PCR檢測作為空白對照，均進行2個平行重復，檢測其植物源是否為薰衣草。3.1.6結果分析取情況如表5所示。表5.薰衣草蜂蜜DNA濃度及其純度對其他26種植物源成分及空白對照(以ddH?O代替模板)無擴增，表明薰衣草引物探針具圖1.薰衣草ITS基因引物探針特異性檢測實注：其中，①為薰衣草DNA(陽性對照組)擴增曲線，② (每一點的熒光強度)-R-n(基線熒光強度),即PCR過程中產物增加的量，橫軸為循環數。陽性對照出現典型的擴增曲線(圖1-①),若Ct值>30,試驗無效。陰性對照應無典型的擴增曲線(圖1-②),若出現擴增曲線，或相應Ct值<40,試驗無效。空白對照應無典型的擴增曲線(圖1-③),若出現擴增曲線，或相應Ct值<40,試驗無效。3.1.6.3薰衣草蜂蜜樣品實時熒光PCR結果描述及判定(1)在符合3.1.6.2的情況下，結果判定如下：a)Ct值≤35,則判定為陽性。b)Ct值≥40或無熒光對數增長和典型擴增曲線，則判定為陰性。c)35<Ct值<40,則重復實驗一次。再次擴增后Ct值<40,則判定為陽性；Ct值≥40,則判定為陰性。由圖2及表6可知，空白對照組無典型的擴增曲線，這表明制備PCRMix時使用的各類①②圖2.10份蜂蜜樣品實時熒光PCR擴增曲線注：其中，①為薰衣草蜂蜜樣品擴增曲線，②空白對照組(以ddH?O代替模板)擴增曲線。表6.薰衣草蜂蜜樣品實時熒光PCR檢測結果1空白對照3.2驗證案例委托黃埔海關技術中心對提供的4個薰衣草蜂蜜DNA樣品(編號1~4號),采用1個陽性對照(薰衣草葉片提取的DNA),1個空白對照(以ddH?O代替DNA模板),6個陰性對照 (油菜、枇杷、荊條、玉米、棗、荔枝的DNA),共12個樣品進行了熒光定量PCR盲樣檢測。檢測Ct結果和擴增曲線分別由表7和圖3所示，在所有12個樣品中，只有1個陽性參照和4個陽性樣品(樣品1~樣品4)有顯著擴增，其中陽性參照Ct值平均值為22.95,符合標準文本中的陽性參照Ct值應小于或等于30的規定，且所有陽性樣品Ct值均符合標準文本中的陽性樣品Ct值應小于或等于35的規定；而6個陰性參照和1個空白參照均未有熒光擴增，符合標準文本中的陰性參照及空白對照Ct值應無熒光對數增長或典型的擴增曲線或應大于或等于40的規定。綜上，表明所用薰衣草引物及探針特異性較強，這與本標準文表7.黃埔海關技術中心檢測樣品Ct值1#樣品12#樣品23#樣品35#空白對照6#陽性對照7#油菜8#枇杷10#玉米11#棗12#荔枝董衣草葉片樣品1圖3.黃埔海關技術中心樣品實時熒光PCR擴增曲線3.2.2天津海關動植物與食品檢測中心委托天津海關動植物與食品檢測中心對提供的4個薰衣草蜂蜜DNA樣品(編號1~4號),采用1個陽性對照(薰衣草葉片提取的DNA,編號6號),1個空白對照(以ddH?O代替DNA模板，編號5號),6個陰性對照(油菜、枇杷、荊條、玉米、棗、荔枝的DNA,編號7~12號),共12個樣品進行了熒光定量PCR盲樣檢測。檢測Ct結果和擴增曲線分別由表8和圖4所示，在所有12個樣品中，只有1個陽性參照和4個陽性樣品(編號1~4號)有顯著擴增，其中陽性參照的Ct值平均值為20.58,符合標準文本中的陽性參照Ct值應小于或等于30的規定，且所有陽性樣品Ct值均符合標準文本中的陽性樣品Ct值應小于或等于35的規定；而6個陰性參照和1個空白參照均未有熒光擴增，符合標準文本中的陰性參照及空白對表8.天津海關動植物與食品檢測中心檢測樣品Ct值123456789AmphificstionCurvesAmphificstionCurves65圖4.天津海關動植物與食品檢測中心樣品實時熒光PCR擴增曲線3.2.3杭州卓蘭生物科技有限公司委托杭州卓蘭生物科技有限公司實驗室對對提供的4個薰衣草蜂蜜DNA樣品(編號1~4號),采用1個陽性對照(薰衣草葉片提取的DNA),1個空白對照(以ddH?O代替DNA模板),6個陰性對照(油菜、枇杷、荊條、玉米、棗、荔枝的DNA),共12個樣品進行了熒光定量PCR盲樣檢測。檢測Ct結果和擴增曲線分別由表9和圖5所示，在所有12個樣品中，只有1個陽性參照和4個陽性樣品(樣品1~4)有顯著擴增，其中陽性參照的Ct值平均值為15.568,符合標準文本中的陽性參照Ct值應小于或等于30的規定，且所有陽性樣品Ct值均符合標準文本中的陽性樣品Ct值應小于或等于35的規定；而6個陰性參照和1個空白參照均未有熒光擴增，符合標準文本中的陰性參照及空白對照Ct值應無熒型的擴增曲線或應大于或等于40的規定。綜上，表明所用薰衣草引物及探針特異性較強，1#樣品12#樣品23#樣品35#空白對照6#陽性對照7#油菜10#玉米11#棗12#荔枝O2O-4其他植物及空白對照0五、預期達到的社會效益、對產業發展的作用等情況六、采用國際標準和國外先進標準的程度七、與現行法律、法規、規章及相關標準，特別是強制性標準的協調性目前有GBT23194-2008蜂蜜中植物花粉的測定方法、進出品行業標準SN/