ICS07.080

CCSC04

DB4403

深圳市地方標準

DB4403/T122—2020

人源腫瘤細胞系建立技術規范

Technicalspecificationforestablishmentofhumantumorcelllines

2020-11-23發布2020-12-01實施

深圳市市場監督管理局發布

DB4403/T122—2020

人源腫瘤細胞系建立技術規范

1范圍

本文件確立了人源腫瘤細胞系建立過程中樣本獲取、細胞建系以及質量檢測的操作程序和一般原

則。

本文件適用于人源實體腫瘤細胞系相關研究。

2規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB18467獻血者健康檢查要求

YY/T0588流式細胞儀

SZDB/Z238短串聯重復序列基因分型法鑒定人源細胞系技術規范

ISCN2013人類細胞遺傳學國際命名體制

ASN—0003—2015基于線粒體細胞色素氧化酶亞基1（CO1）DNA條形碼鑒定動物細胞種屬(Species

—LevelIdentificationofAnimalCellsthroughMitochondrialCytochromeOxidaseSubunit1(CO1)

DNABarcodes）

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

供體donor

提供腫瘤樣本的捐贈者。

3.2

原代細胞primarycell

直接由獲取的人體組織或器官制備形成的細胞。

3.3

細胞系cellline

由原代細胞群經傳代培養獲得的細胞群。該細胞群通常是非均質的，且具有明確的特性，可供建庫

用。

1

DB4403/T122—2020

3.4

實體瘤solidtumor

機體在各種致瘤因素作用下，局部組織的細胞在基因水平上失去對其生長的正常調控，導致異常增

生而形成的新生物。

3.5

平衡鹽溶液balancedsaltsolution

組織細胞培養時常用的基本液體，可以維持細胞的滲透壓、調節pH值以及提供細胞生存所需的無機

離子成分。

注：常用于細胞、組織的洗滌。

3.6

密度梯度離心densitygradientcentrifugation

用一定的介質（如氯化銫、蔗糖和多聚蔗糖）在離心管內形成連續或不連續的密度梯度，將細胞混

懸液或勻漿置于介質的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離的方法。

3.7

倍增時間doublingtime

在細胞培養過程中，對數期中細胞數量增加一倍所需的時間。

3.8

成瘤性tumorigenicity

細胞接種動物后在注射部位和（或）轉移部位由接種細胞本身形成腫瘤能力。

3.9

染色體chromosome

遺傳信息的載體，由DNA、RNA和蛋白質構成的，其形態和數目具有種系的特性。

注：在細胞間期核中，以染色質絲形式存在。在細胞分裂時，染色質絲經過螺旋化、折疊、包裝成為染色體，為

顯微鏡下可見的具不同形狀的小體。

3.10

同工酶分析isoenzymeanalysis

具有相似或相同特異性的酶，利用瓊脂糖凝膠電泳技術，研究細胞裂解過程中同工酶的遷移規律，

以獲得具有物種特異性的同功酶譜的過程。

3.11

核型分析karyotypeanalysis

2

DB4403/T122—2020

將待測細胞的染色體按照固有的染色體形態特征和規定，進行配對、編號和分組，并進行形態分析

的過程。

3.12

聚合酶鏈式反應polymerasechainreaction

通過DNA互補雙鏈解鏈、退火和聚合延伸的多次循環來擴增DNA特定序列的方法。

3.13

流式細胞術flowcytometry

對懸液中的單細胞或其他生物粒子，通過檢測標記的熒光信號，實現高速、逐一的細胞定量分析和

分選的技術。

3.14

免疫熒光技術immunofluorescencetechnique

將免疫學方法(抗原抗體特異結合)與熒光標記技術結合起來研究特異蛋白抗原在細胞分布的方法。

3.15

細胞半數致瘤量50%tumorproducingdose

能使50%動物產生腫瘤的最低移植細胞量。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

BPV：牛細小病毒（Bovineparvovirus）

CMV：巨細胞病毒（Cytomegalovirus）

DMSO：二甲基亞砜(DimethylSulfoxide)

DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

EBV：人類皰疹病毒四型（Epstein—Barrvirus）

EDTA：乙二胺四乙酸（EthylenediaminetetraaceticAcid）

HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）

HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）

HIV：人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）

HTLV：人類嗜T細胞病毒（HumanT—lymphotropicVirus）

PBS：磷酸鹽緩沖溶液（PhosphateBufferSaline）

PCR：聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction）

PPV：豬細小病毒（PorcineParvovirus）

RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）

5樣本獲取

5.1倫理審批和知情同意

3

DB4403/T122—2020

5.1.1樣本采集前應進行相應的準備工作，嚴格設計樣本采集方案，并按照樣本采集方的倫理審查要

求對方案的生物安全、倫理以及科學性進行審查。

5.1.2樣本采集應遵循“知情同意、自愿”的原則。工作人員（包括醫生、樣本操作技術人員等）應

與捐贈者溝通，詳細講解項目背景、意義，采集的樣本量、用途、潛在風險以及捐贈的權利、義務

等，獲得捐贈者或者其法定代理人的知情同意。

5.2信息收集

5.2.1樣本采集前應收集捐贈者信息，包括但不限于姓名、年齡、性別、住院號、病歷號等基本信息

及既往病史、家族史、用藥史、過敏史等臨床信息。捐獻者基本信息表參見附錄A。

5.2.2樣本采集后應詳細記錄所采集的腫瘤樣本信息，包括但不限于樣本的采集時間、編號、大小、

數量、采集人員等。腫瘤樣本信息表見附錄B。

5.2.3應建立嚴格有效的樣本捐獻者信息保護制度，對捐獻者健康信息的隱私權加以保護。

5.3供體篩選

5.3.1用于腫瘤細胞分離培養的組織應進行篩選，宜排除下列情況的供體：

——病理類型為混合型；

——人源特定病毒檢測結果不符合GB18467的規定；

——有精神障礙；

——伴有其他免疫性疾病，或長期應用免疫抑制劑或激素；

——醫生認為其他不適合情況。

5.4樣本采集前準備

5.4.1采集前應對樣本進行編碼，打印合適數量不易脫落、標注清晰的標簽。仔細核對捐贈者信息，

確定無誤后將標簽粘貼在無菌的樣本采集容器上。

5.4.2采集前應先準備所需的儀器、試劑和耗材，并確認儀器可以正常使用。主要儀器耗材列表見附

錄C。

5.5樣本采集

5.5.1實體瘤樣本

5.5.1.1樣本應首先滿足捐贈者的診斷和治療需求，剩余樣本才能用于建立腫瘤細胞系。

5.5.1.2應采集具有典型生物學特征的腫瘤組織、癌旁組織和正常組織，實體瘤樣本的直徑宜不低于

5mm。

5.5.2胸腹水樣本

當胸腹水樣本中存在較多腫瘤細胞時，可在無菌條件下抽取胸腹水，采集量宜不低于20mL。

5.6樣本保存與運輸

5.6.1實體瘤樣本應保存于含400IU/mL抗生素的培養基中。胸腹水樣本可直接收集至樣本保存瓶。

5.6.2實體瘤樣本保存和運輸時間應不超過12h，運輸溫度4℃～10℃。胸腹水樣本處理保存與運輸

時間應不超過2h。

6細胞建系

4

DB4403/T122—2020

6.1細胞分離

6.1.1總則

實體瘤樣本宜選擇組織塊法或酶消化法進行原代細胞分離。

6.1.2組織塊法

6.1.2.1充分去除血液、脂肪、神經組織及壞死組織，加入4℃平衡鹽溶液清洗腫瘤組織。

6.1.2.2宜采用無菌眼科剪將腫瘤組織切成1mm3～2mm3大小的組織塊。

6.1.2.3將約20個組織塊轉移至T25細胞培養瓶中，輕輕翻轉培養瓶使其底部朝上，置于37℃、5%

濃度二氧化碳培養箱中培養2h～4h。

6.1.2.4將培養瓶輕輕平放，加入完全培養基，置于培養箱中繼續培養。

6.1.3酶消化法

6.1.3.1充分去除血液、脂肪、神經組織及壞死組織，加入4℃平衡鹽溶液清洗腫瘤組織。

6.1.3.2采用無菌眼科剪將腫瘤組織切成1mm3～2mm3大小的組織塊。

6.1.3.3加入1mL～3mL0.25%胰蛋白酶或200IU/mL膠原蛋白酶，37℃水浴震蕩消化0.5h～1h，或

4℃過夜消化。

6.1.3.4加入3mL～5mL完全培養基終止消化，采用孔徑100μm的細胞篩網過濾，收集細胞懸液并

計數。

6.1.3.5以4℃，200g～300g的轉速離心5min～10min后，除去上層清液，加入適量完全培養基，

調整細胞密度至0.5～1×106/mL，接種至培養瓶中，置于37℃，5%濃度二氧化碳培養箱內進行培養。

6.1.4胸腹水樣本宜采用直接離心法，以4℃，300g～500g的轉速離心5min～10min，收集腫瘤細

胞后直接進行培養。

6.2細胞培養

6.2.1腫瘤細胞培養初期，培養瓶應輕拿輕放，避免組織塊和細胞脫落。

6.2.2細胞培養12h～72h，待細胞貼壁后進行首次換液，去除脫落的組織塊和未貼壁細胞。

6.2.3每隔2天～3天換液，通過顯微鏡觀察記錄細胞生長狀態。待細胞融合度達到80%以上時，可進

行細胞純化和傳代。

6.3細胞純化

6.3.1腫瘤細胞的純化宜采用機械刮除法、反復貼壁法、消化排除法、密度梯度離心法中的一種或多

種方法聯合。

6.3.2機械刮除法

6.3.2.1顯微鏡下觀察細胞，采用標記筆在培養瓶背面標記具有典型生物學特征的腫瘤細胞生長區域。

6.3.2.2棄掉培養液，顯微鏡下采用無菌細胞刮刮除無標記區域的雜細胞；采用平衡鹽溶液清洗雜細

胞，加入培養液繼續培養。

6.3.3反復貼壁法

6.3.3.1參考附錄D細胞的傳代操作流程中的步驟E.3.1—E.3.6收集細胞，接種至新的培養瓶中培養

5min～20min。

5

DB4403/T122—2020

6.3.3.2收集未貼壁的腫瘤細胞懸液，接種至新的培養瓶中培養5min～20min。

6.3.3.3重復步驟6.3.3.21次～3次，收集最后一次腫瘤細胞懸液，接種至新培養瓶中培養。

6.3.4消化排除法

6.3.4.1針對不同類型的細胞，采用50IU/mL～200IU/mL不同亞型的膠原酶或0.05%～0.25%的胰蛋

白酶對細胞進行消化處理，顯微鏡下觀察，待雜細胞脫落后終止消化。

6.3.4.2采用平衡鹽溶液清洗處理后，更換完全培養基繼續培養，若雜細胞未被除凈，宜再次重復處

理。

6.3.5密度梯度離心法

6.3.5.1宜參考6.3.3.1步驟收集細胞，加入至比重1.025～1.085的細胞分離液中，以20℃，800g

的轉速離心10min。

6.3.5.2離心后收集比重1.050～1.085的腫瘤細胞層，清洗2次～3次后，加入完全培養基重懸細胞，

接種至新培養瓶中培養。

6.4細胞傳代

腫瘤細胞系傳代參見附錄D。

6.5細胞凍存

6.5.1細胞數目達到5×107～1×108后，進行細胞收集和計數（參見附錄D的步驟D.3.1～D.3.7）。

6.5.2加入含10%～15%二甲基亞砜(DMSO)的完全培養基，調整細胞密度至1×106/mL～1×107/mL。

6.5.3將腫瘤細胞按1mL/管分裝至細胞凍存管中，管壁粘貼唯一編碼標簽。

6.5.4凍存管宜放入程序降溫盒中，置于-80℃冰箱過夜。亦或遵循程序降溫原則采用程序降溫儀將

細胞梯度降溫至-80℃。亦或將細胞置于含速凍保存液的微毛細管中，直接放置于液氮保存。降溫完

成后應轉移細胞至液氮中長期存儲。

7質量檢測

7.1生物學屬性檢測

7.1.1細胞鑒別

7.1.1.1種屬鑒定

宜采用脫氧核糖核酸（DNA）條形碼分析或同工酶法。DNA條形碼分析宜參考ASN—0003—2015，同

工酶法檢測參見附錄E。

7.1.1.2細胞系特性鑒定

按照SZDB/Z238對細胞系間特性進行鑒定。

7.1.1.3細胞專屬特性

宜采用各腫瘤細胞系特異性的標記物，通過流式細胞術進行檢測，常見腫瘤細胞系特異性標記物列

表見附錄F。細胞流式分析前處理宜依據特異性抗體說明書進行，流式細胞儀操作宜參考YY/T0588。

7.1.2細胞存活率

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DB4403/T122—2020

7.1.2.1細胞存活率宜采用臺盼藍染色法，通過手動計數或自動細胞計數儀進行檢測。手動計數檢測

細胞存活率宜參考附錄G，自動計數儀檢測細胞存活率宜依據儀器檢測說明書進行。

7.1.2.2腫瘤細胞系凍存前的存活率應不低于90%。復蘇后的細胞存活率應不低于80%。

7.1.3細胞純度

細胞純度可采用流式細胞術或細胞免疫熒光染色法，通過檢測細胞特異性標記物的陽性表達率進行

檢測。流式細胞術檢測操作宜參考YY/T0588；細胞免疫熒光檢測操作宜依據熒光抗體使用說明書進行。

腫瘤細胞系任意單個標記物陽性率應不低于90%，任意雙標記物共陽性率應不低于80%。

7.1.4倍增時間

7.1.4.1新建腫瘤細胞系宜進行細胞倍增時間檢測。

7.1.4.2細胞倍增時間宜參考《中華人民共和國藥典（三部）》（2020年版）“生物制品生產檢定用

動物細胞基質制備及質量控制”關于群體倍增水平計算的規定進行檢測，并記錄于細胞生物學特征檔

案。

7.1.5凝集試驗

腫瘤細胞系凝集試驗宜參考附錄H。

7.1.6染色體核型分析

宜依據ISCN2013建立的G顯帶法或Q顯帶法對細胞染色體進行分析和描述，并記錄于細胞生物學特

征檔案。

7.1.7成瘤性試驗

7.1.7.1新建細胞系應進行成瘤性檢測。

7.1.7.2成瘤性檢測宜依據《中華人民共和國藥典（三部）》（2020年版）生物制品通則4實施。

7.1.7.3對檢測后具有成瘤性的腫瘤細胞，需釆用定量的方法進一步分析細胞成瘤性的大小，并計算

該細胞的半數致瘤量(TPD50)。

7.2安全性檢測

7.2.1無菌檢測

7.2.1.1細胞系在凍存前應進行無菌檢測。

7.2.1.2無菌檢測可依據《中華人民共和國藥典（三部）》（2020年版）通則1101中規定的方法實

施。

7.2.1.3腫瘤細胞系的無菌檢測結果應為陰性。

7.2.2支原體檢測

7.2.2.1細胞系在凍存前應進行支原體檢測。

7.2.2.2宜采用經批準的基于聚合酶鏈式反應（PCR）擴增原理的支原體檢測試劑盒，按照說明書對腫

瘤細胞系進行支原體檢測。

7.2.2.3細胞系的支原體檢測結果應為陰性。

7.2.3內、外源病毒因子檢測

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DB4403/T122—2020

7.2.3.1使用含牛源和豬源生物制品而新建的細胞系應進行人類EBV、HBV、HCV、HIV—1、HIV—2、

HTLV—1、HTLV—2、CMV、PPV和BPV的檢測。

7.2.3.2宜依據《中華人民共和國藥典（三部）》（2020年版）通則3306對人源病毒因子HIV—1/2、

HBV、HCV進行檢測；宜采用經批準的基于酶聯免疫法檢測的酶聯免疫試劑盒對HTLV—1/2、EBV、CMV

進行檢測。

7.2.3.3宜采用經批準的基于酶聯免疫法檢測的酶聯免疫試劑盒對豬細小病毒或牛細小病毒進行檢

測。

7.2.3.4除特殊研究要求外（如研究材料即為攜帶致病因子的細胞），細胞系內與外源病毒因子檢測

應均為陰性。A

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BA

附錄A

（資料性）

捐贈者基本信息表

表A.1給出了捐贈者基本信息表。

表A.1捐贈者基本信息表

姓名：住院登記號：病理號：

年齡：性別：

聯系地址：

聯系電話：郵編：

吸煙史（年）：吸煙（支/日）：

飲白酒史（年）：飲白酒（兩/日）：

病史：藥物過敏史：

家族疾病史：用藥史：

簡要病情及手術原因介紹:

術前治療：

手術名稱：

手術時間：年月日時分

切除部位：組織切除量：

手術情況記錄：

手術醫生簽名：隨同手術人員簽名：

家屬確認簽名：日期：年月日時

病理描述及拍照（附照片）：

病理醫生簽名：日期：年月日時分

組織樣本交接情況：

交接人：日期：年月日

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CB

附錄B

（資料性）

腫瘤樣本信息表

表B.1給出了腫瘤樣本信息表。

表B.1腫瘤樣本信息表

捐贈者基本信息

捐贈者姓名捐贈者ID

性別口男口女出生日期

樣本收集與處理信息

樣本類型樣本編號

采樣日期樣本采集人員

樣本采集量

處理方法（溫度、操作）：

處理開始時間處理完成時間

樣本信息

樣本編碼腫瘤類型（T或N）取材數量組織質量(A或B或C)

運輸保存

保存條件保存溫度

運輸方式運輸時間

備注

注1：捐贈者ID以腫瘤類別（兩位數）+年份（四位數）+流水號（四位數）+組成樣本編碼。

注2：樣本類型，根據NIH的病例檢索標準進行填寫。

注3：腫瘤類型，用T和N代表腫瘤及正常，T及N后面的數字表示取材份數。

注4：組織質量用A、B、C表示（A＝無明顯壞死、B＝散在壞死、鈣化，C＝大量壞死）。

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DB4403/T122—2020

DC

附錄C

（資料性）

主要儀器耗材列表

C.1主要儀器

表C.1給出了主要儀器列表。

表C.1主要儀器列表

階段儀器名稱用途

低溫標簽制作套裝打印標簽

樣本采集

冷藏冰箱（2℃～8℃）樣本暫存

冷藏冰箱（2℃～8℃）樣本暫存

低溫標簽制作套裝制作標簽

條碼掃描器掃描條碼

冷凍離心機（-20℃～40℃；最高離心力達

細胞建系樣本離心

15000g以上）

生物安全柜操作平臺

移液器（10μL、100μL、1000μL）細胞處理與轉移

凍存架放置凍存盒

細胞凍存-80℃冰箱部分樣本儲存

液氮罐部分樣本儲存

C.2主要耗材

表C.2給出了主要耗材列表。

表C.2主要耗材列表

階段耗材名稱用途

無菌醫用手套（無粉）個人防護

棉簽消毒

采血管采血容器

采血針穿刺

眼科剪組織樣本剪碎

樣本采集

組織剪組織樣本分離

組織鑷組織樣本分離

醫用無菌注射器胸腹水的抽取

手術刀組織切除

標簽樣本標識

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表C.2（續）

階段耗材名稱用途

樣本采集醫用口罩個人防護

離心管樣本細胞的收集

移液管細胞懸液及培養液的轉移

培養瓶細胞培養

細胞建系

細胞刮細胞的刮除和純化

眼科剪組織樣本剪碎

組織鑷組織樣本分離

凍存管儲存樣本

細胞凍存凍存盒放置凍存管

程序降溫盒樣本的程序性降溫

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ED

附錄D

（資料性）

細胞傳代操作流程

D.1儀器

倒置熒光顯微鏡、二氧化碳培養箱（溫度：5℃～65℃，容積不小于80L）、離心機（溫度：-20℃～

40℃，最高離心力達15000g以上）、生物安全柜、細胞計數儀、移液槍（10μL，100μL，1000μL）。

D.2試劑耗材

底面積75cm2的細胞培養瓶、細胞培養基、胎牛血清、青/鏈霉素、胰蛋白酶、平衡鹽溶液、離心管、

移液管、75%酒精、無塵布、棉球、封口膜、廢液缸。

D.3貼壁細胞工作程序

D.3.1用50mL離心管，收集細胞培養液，并用平衡鹽溶液清洗細胞1～2次，以免剩余培養液影響胰

蛋白酶活性。

D.3.2向瓶內加入1mL消化液（含0.05%～0.25%Trypsin—EDTA），置于37℃下進行消化1min～3mi

n，消化期后把培養瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當發現胞質回縮、細胞間隙增大后，立即終止消

化。

D.3.3向細胞培養瓶內用移液管加入等體積的收集的細胞培養液，混勻終止消化。

D.3.4使用吸管，吸取瓶內培養液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。

D.3.5用吸管轉移細胞懸液至離心管中，以300g～500g轉速離心5min。

D.3.6去掉細胞上清液，加入適量平衡鹽溶液清洗細胞2～3次，采用臺盼藍染色進行細胞計數和檢

活。

D.3.7去掉細胞上清液，在離心管中加入3mL完全培養液，并反復吹打細胞，制成細胞懸液。

D.3.8調整細胞密度，按照5000/cm2～6000/cm2密度接種細胞至細胞培養瓶，于37℃，5%濃度二氧

化碳培養箱中進行培養。

D.3.9根據細胞生長的狀態進行換液。一般2～3天后應換一次培養液。待細胞長至85%以上融合度，

可繼續傳代擴大培養。

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DB4403/T122—2020

FE

附錄E

（資料性）

同工酶分析操作流程

E.1儀器

二氧化碳培養箱（溫度：5℃～65℃，容積不小于80L）、高速冷凍離心機（溫度：-20℃～40℃；

最高離心力達15000g以上）、生物安全柜、細胞計數儀、凝膠電泳槽、漩渦混勻儀、多層濾紙、割膠

器、電子天平（0.1mg～220g）、4℃冰箱、pH計（分辨率：0.001pH；玻璃電極）、微波爐、多用電

泳儀（10V～300V）。

E.2試劑配制

E.2.1細胞裂解液

Tris0.303g，乙二胺四乙酸（EDTA）0.0186g，質量分數2%TritonX—100，加水定容至50mL，

鹽酸（HCl）調pH至7.5，4℃保存。

E.2.2巴比妥緩沖液

巴比妥鈉10.3g，巴比妥1.84g，加水定容至1000mL，4℃保存。

E.2.3乳酸脫氫酶（LDH）顯色底物

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）5mg，噻唑藍溴化四唑（MTT）2mg，吩嗪硫酸甲酯（PMS）0.4mg，

1mol/L乳酸鈉1mL，0.1mol/L氯化鈉（NaCl）0.5mL，0.5mol/L的三羥甲基氨基甲烷—鹽酸（Tris—

HCl）（pH8.0）1.5mL，加水定容至10mL。

E.2.4葡萄糖—6—磷酸脫氫酶（G6PD）顯色底物

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）3mg，噻唑藍溴化四唑（MTT）2mg，吩嗪硫酸甲酯（PMS）0.4

mg，葡萄糖—6—磷酸脫氫酶(G6PD)50mg，氯化鎂（MgCL2）10mg，0.5mol/L的三羥甲基氨基甲烷—鹽

酸（Tris—HCl）（pH8.0）2mL，加水定容10mL。

E.2.5核苷酸磷酸脫氫酶（NP）顯色底物

肌苷20mg，MTT2mg，PMS0.4mg，黃嘌呤氧化酶0.3unit，0.1mol/LNa2HPO41mL，0.5mol/LTris

—HC1（pH7.5）1mL，加水定容至10mL。

E.2.6瓊脂糖凝膠

瓊脂糖0.8g，EDTA0.035g，巴比妥緩沖液100mL加熱溶化。

E.3檢測程序

E.3.1細胞同工酶的提取

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DB4403/T122—2020

E.3.1.1將待檢腫瘤細胞系、人源標準參考細胞系分別在培養瓶中培養，當生長至鋪滿瓶底時，吸出

培養基。

E.3.1.2采用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗細胞單層，加1mL胰蛋白酶，37℃溫箱消化至細胞脫壁，加

2mL含10％小牛血清的細胞培養基終止胰蛋白酶的作用，并將其轉移至無菌離心管。

E.3.1.3300g離心10min，棄去上清，加1mLPBS吹打均勻，快速離心，吸干殘留PBS。

E.3.1.4估算細胞的體積，加等體積的細胞裂解液，室溫反應2min～3min，冰上反應30min，4℃，

5000g～8000g離心5min，吸出上清移至新的EP管，-20℃保存。

E.3.2瓊脂糖凝膠制備

E.3.2.1將2片0.175mm厚的市售透明膠片夾在兩塊膠槽中問，用文件夾將膠槽和膠片固定在一起。

E.3.2.2將瓊脂糖凝膠用注射器緩緩從膠槽上的小孔注入膠槽與膠片之間，注入凝膠時注意避免氣泡

的產生，并使凝膠均勻的分布在膠片上，待凝固后放4℃預冷后使用。

E.3.3電泳

E.3.3.1小心將凝膠剝離膠板，將載有凝膠的膠片放入電泳槽內，然后將細胞裂解上清液按照每孔1

μL～3μL/孔加到入樣孔中，靜置30s使樣品完全被凝膠吸收后，注入電泳液。

E.3.3.2乳酸脫氫酶電泳電壓為95V，電泳時間為1.5h；葡萄糖—6—磷酸脫氫酶電泳電壓為90V，

電泳時間為1h；核苷酸磷酸脫氫酶電泳電壓為85V，電泳時間為1h。為保證同工酶的活性，電泳過程

均在冰浴上進行。

E.3.4顯色

E.3.4.1停止電泳后，取出凝膠膠片，放置在暗盒內，注入3mL～5mL對應底物的顯色液，37℃反應

20min～25min。

E.3.4.2酶譜出現后，在清水中清洗膠片2～3次，用濾紙吸去膠片上的殘留水分即可拍照。

E.4判定標準

E.4.1若待檢細胞與標準參考細胞的三種同工酶條帶數目均相同，且條帶的遷移距離與標準參考細胞

相同，則判定待檢細胞系為同一種屬細胞系。

E.4.2若待檢細胞與標準參考細胞的三種同工酶條帶數目相同，但條帶的遷移距離與標準參考細胞不

同，判定待檢細胞系為不同種屬細胞系。

E.4.3若待檢細胞與標準參考細胞的三種同工酶條帶數目不同，判定待檢細胞系存在種屬間細胞交叉

污染。

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GF

附錄F

（資料性）

腫瘤細胞特異性標記物列表

表F.1給出了腫瘤細胞特異性標記物列表。

表F.1腫瘤細胞特異性標記物列表

腫瘤細胞系種類細胞特異性標記物

肺癌細胞CYFRA21—1、NSE、SCC、CEA、CA50均應表達

肝癌細胞AFP、AFU、CEA、CA19—9均應表達

結直腸癌細胞CEA、Ki67、CK20、CK7、CA19—9、CA50均應表達

乳腺癌細胞CA15—3、CEA、CA125均應表達

卵巢癌細胞CA125、CEA、CA72—4、β—HCG、AFP均應表達

宮頸癌細胞CEA、CA72—4均應表達

子宮癌細胞CEA、SCC、SF、β—HCG均應表達

胃癌細胞CEA、CA72—4、CA19—9均應表達

黑色素細胞S—100、NKI—C3、HMB—45均應表達

前列腺癌細胞PAP、PSA、F—PSA均應表達

胰腺癌細胞HCG、CEA、AFP均應表達

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HG

附錄G

（資料性）

臺盼藍染色標準流程

G.1儀器

顯微鏡、玻片、蓋玻片、滴管。

G.2試劑耗材

0.4%臺盼藍染液、生理鹽水、血細胞計數板。

G.3檢測原理

臺盼藍是組織和細胞培養中最常用的死細胞鑒定染色方法之一。正常的活細胞，由于胞膜結構完整，

能夠排斥臺盼藍，使之不能夠進入胞內。而喪失活性或細胞膜不完整的細胞，胞膜的通透性增加，可被

臺盼藍染成藍色。通常認為細胞膜完整性喪失，即可認為細胞已經死亡。因此，借助臺盼藍染色可以非

常簡便、快速地區分活細胞和死細胞。臺盼藍染色后，通過顯微鏡下直接計數或顯微鏡下拍照后計數，

就可以對細胞存活率進行比較精確的定量。

G.4檢測步驟

G.4.1對于懸浮細胞，離心收集細胞，充分清洗后，用適當緩沖液如PBS，重懸制成單細胞懸液。對

于貼壁細胞，先用胰酶消化細胞，再按照懸浮細胞的方法制備單細胞懸液。

G.4.2取0.5mL單細胞懸液，按照1:1比例與0.5mL濃度為0.4%的臺盼藍染色液充分混勻，室溫染色3

min～10min。

注1：因臺盼藍具有細胞毒性，染色時間過久會導致部分死細胞染色，干擾計數。

注2：若細胞密度比較高，可取0.2mL單細胞懸液，經適當緩沖液稀釋到0.5mL，之后再用0.5mL濃度為0.4%的臺

盼藍染色液染色。

G.4.3取少量上述染色細胞加入血細胞計數板，于顯微鏡低倍鏡下計數，分別計算著色細胞（即損傷

細胞和死細胞）和總細胞。

注1：用移液槍加染色細胞時，沿著蓋玻片的邊緣輕輕加液使其完全覆蓋住整個小室。

注2：1mm2方格內細胞數通常控制在20—50個，若細胞數超過200個，需重新調整稀釋倍數。

G.4.4細胞數目的計算見公式（G.1）。

N=C×V??????????（G.1）

其中：

C=M×D×104??????????（G.2）

式中：

N——細胞數目（個）；

C——細胞濃度（個/mL）；

V——細胞懸液體積（mL）；

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M——細胞計數板單個方格的平均細胞數（個）；

D——稀釋倍數。

G.4.5細胞活率的計算見公式（G.3）。

Vi=(N總—N著色)/N總×100%??????????（G.3）

式中：

N總——總細胞數（個）；

N著色——總著色細胞數（個）。

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IH

附錄H

（資料性）

凝集試驗操作流程

H.1儀器

二氧化碳培養箱（溫度：5℃～65℃，容積不小于80L）、離心機（溫度：-20℃～40℃；最高離

心力達15000g以上）、生物安全柜、細胞計數儀、凹孔板。

H.2試劑耗材

75cm2細胞培養瓶、腫瘤細胞培養基、胎牛血清、青/鏈霉素、胰蛋白酶、生理鹽水、刀豆蛋白。

H.3檢測程序

H.3.1腫瘤細胞系凝集試驗設計包括空包對照組、腫瘤細胞系的試驗組和人成纖維細胞的陰性對照

組。刀豆蛋白濃度梯度包括0μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL。

H.3.2取生長狀態良好的腫瘤細胞，采用傳統胰酶消化法收集細胞，調整細胞密度為1×105個/mL。

H.3.3向若干凹孔板凹中加細胞懸液，每凹孔加0.1mL，再分別加入刀豆蛋白—PBS溶液0.1mL，使刀

豆蛋白的最終濃度依次為：100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL和0μg/mL（對照）。

H.3.4置微型振蕩器上振蕩混勻，靜止5min～10min，觀察凝集現象。

H.4判斷標準

H.4.1若空白對照和陰性對照組在刀豆蛋白低濃度（小于50μg/mL）均無凝集現象產生，判斷該試驗

有效。

H.4.2在試驗有效的前提下，觀察腫瘤細胞系檢測組發生凝集反應的刀豆蛋白濃度，記錄試驗數據并

拍照保存。

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參考文獻

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[2]《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則（試行）—CFDA》,2015.

[3]《中國人類遺傳資源實體瘤永生細胞系建立技術規程》（討論稿），2007.

[4]郭建華,張吉才,李曉強,等.胸腹水細胞學前檢查各環節因素分析[J].國際檢驗醫學雜志,

2012,33(3):315—317.

[5]蔣敬庭,張學光.腫瘤細胞的分離與純化研究進展[J].醫學綜述,2009,15(4):522—524.

[6]楊永強,張巧玲.Ficoll密度梯度離心法分離腹水單個核細胞方法的優化[J].中外醫