山東青島山東山東山東青島茶園叢枝菌根真菌資源多樣性研究

20世紀初，首次發現茶樹可以形成假種（pm），一些科學家先后證實，am菌廣泛分布在茶園土壤（李名軍和蜀吉林，1984）。目前只有少數幾個亞洲國家如中國、印度、日本、泰國等種植茶樹,其中只有我國、印度和泰國等開展了有關茶樹菌根方面的研究。吳鐵航等(1995)從我國南方紅壤茶園中分離到AM真菌4屬7種,其中無梗囊霉屬(Acaulospora)分離頻度最高,Acaulosporadenticulata和A.laevis為優勢種;而北方豫南茶園黃壤和黃棕壤中的優勢種為Acaulosporalaevis、Glomusaggregatum和G.etunicatum(盧東升和吳小芹,2005)。這表明土壤與氣候條件可能影響AM真菌的種屬組成、優勢種群和多樣性(Lekbergetal.,2007;Wangetal.,2008)。茶樹起源于我國,在我國開展茶樹AM真菌研究具備得天獨厚的條件,然而與其他植物物種相比,有關茶樹根圍中AM真菌的群落結構、組成與分布的研究較少(Singhetal.,2008)。調查不同茶園土壤中AM真菌多樣性與資源分布狀況,對于今后進一步收集、篩選和保存AM真菌,研發茶樹專用AM菌劑具有實際意義。嶗山位于膠東半島西南端,其人工茶樹種植園是中國北方最具代表性的茶區,面積已達866.7ha。該區茶樹栽培已有半個多世紀的歷史,其獨特的栽培生產模式與生境條件對茶樹根圍AM真菌種屬構成和分布可能具有重要影響。本研究旨在調查嶗山茶區土壤中AM真菌種質資源、分布特征、生物多樣性狀況,以期為北方茶區土壤中AM真菌種質資源開發及應用提供依據。1材料和方法1.1樣品的采集和處理嶗山是山東半島的主要山脈,最高峰嶗頂海拔1,133m,是我國海岸線第一高峰。嶗山屬暖溫帶大陸性季風氣候,全區年平均降水量可達800–900mm。由于瀕臨黃海,形成半濕潤溫和區,表現出春冷、夏涼、秋暖、冬溫、晝夜溫差小、無霜期長和濕度大等海洋性氣候特點。嶗山茶區土壤大部分由花崗巖分化而來,屬砂質土壤,排蓄水性能良好,適宜茶樹的生長。作者于2007年9月從嶗山茶區沙子口、北宅、王哥莊等12個茶園采集根圍土樣:每份土壤樣取5點混合,去掉表土2cm,取茶樹根圍2–30cm土層的土壤和根系2kg左右,裝入塑料袋,注明采樣人、時間、地點等。風干樣品于低溫通風處保存。茶園基本情況及其土壤理化性質見表1。1.2子數和藥物分類取風干土樣100g,濕篩傾注—蔗糖離心法分離、鏡檢孢子,記錄孢子數和孢子分類特征(劉潤進和陳應龍,2007)。根據Schenck和Perez(1988)和INVAM()的鑒定資料等對AM真菌孢子進行分類鑒定。1.3各采樣點菌芽孢數和土壤樣本數種的豐度(speciesrichness,SR):指茶樹根圍100g土壤中含有的AM真菌種數,SR=AM真菌總種次數/土壤樣本數。孢子密度(sporedensity,SD):每100g土樣中的AM真菌孢子數。SD=AM真菌所有種的孢子數/土壤樣本數。分布頻度(frequency,F):F=AM真菌某屬或種的出現次數/土壤樣本數×100%。相對多度(relativeabundance,RA):RA=該采樣點AM真菌某屬或種的孢子數/該采樣點AM真菌總孢子數×100%。重要值(importancevalue,IV),即頻度和相對多度的平均值:IV=(F+RA)/2。本文定義優勢屬或種IV≥50%,常見屬或種10%<IV<50%和稀有屬或種IV≤10%。多樣性采用Shannon-Wiener指數(H)和Simpson指數(D)來測度:其中S為某樣地中AM真菌的種數,Pi為某AM真菌的孢子占該樣地所有孢子的百分比。1.4療效測定pH值采用PHSJ-3F型實驗室pH計,速效磷采用鉬銻抗比色法,速效鉀采用火焰光度計法,有機質采用重鉻酸鉀法,堿解氮采用堿解擴散法測定。1.5統計學處理過程計算采用DPS(杭州睿豐信息技術有限公司)統計軟件進行方差分析;采用SASV6.12(SASInstituteInc.)統計軟件進行群落結構分析。2結果2.1種病原菌的種類和優勢種從嶗山茶區12個茶園64個土樣中共分離3屬22種AM真菌,其中無梗囊霉屬13種,球囊霉屬(Glomus)8種,巨孢囊霉屬(Gigaspora)1種。所有采樣點中,以曉望村茶園(W-5)的AM真菌種類最多(15種);其次是萬來客茶園(W-7,11種);荷花村(W-1)的種類最少(6種)。光壁無梗囊霉(Acaulosporalaevis)在萬里江茶園(S-2)、萬里江有機茶園(B-3)、常家村茶園(W-2)、桑園村茶園(W-4)的頻度均為100%,而在曉峪春茶園(W-6)僅為16.7%,并且在各個采樣點都有發現。蜜色無梗囊霉(A.mellea)、尼氏無梗囊霉(A.nicolsonii)和大型無梗囊霉(A.colossica)在各個采樣點的出現頻度也較高。各樣點AM真菌重要值和優勢種不同。如波狀無梗囊霉(A.undulata)是萬里江有機茶園(B-3)、萬來客茶園(W-7)的優勢種;隱球囊霉(G.occultum)在櫻山春茶園(B-1)、曉望村(W-5)、萬來客茶園(W-7)中的重要值分別為74.8、73.8和59.4,表明它是這3個樣點的優勢種(表2)。2.2無梗囊霉屬和球囊霉屬的頻度所分離得到的AM真菌3個屬中,無梗囊霉屬的相對多度最高,可達99.0。無梗囊霉屬和球囊霉屬在曉望村茶園(W-5)的頻度最高,分別為69.2%和62.5%,而巨孢囊霉屬僅在萬里江茶園(S-2)和常家村茶園(W-2)中出現。這3個屬的重要值在不同茶園中也存在差異(表3)。2.3真菌菌的密度、種子數和多樣性指數2.4各代溶劑對全氧生物活性的影響選取的6個環境因子對嶗山茶區AM真菌群落組成都有一定程度的影響(圖1)。其中土壤速效磷含量的影響最大,速效鉀的影響較小。有機質和堿解氮與AM真菌群落組成呈正相關,其余因子為負相關。環境因子對嶗山茶區AM真菌群落組成的相關性大小為土壤速效磷含量>土壤有機質含量>種植年限>土壤堿解氮含量>土壤pH值>土壤速效鉀含量(圖1)。3氣調保鮮對am真菌物種多樣性的影響AM真菌具有豐富的物種多樣性(喬紅權等,2005;王淼焱等,2006;Stromberg&Stutz,2006)和遺傳多樣性(劉延鵬等,2008)。寄主植物在一定條件下影響著AM真菌的群落結構。Sykorová等(2008)利用分子生物學技術證實了AM真菌群落組成受到寄主植物種類的影響。例如,不同生長習性或起源、遺傳背景復雜的一些多年生木本植物影響AM真菌的多樣性(Munkvoldetal.,2004;郭紹霞等,2007)。而地上植物群落多樣性在一定程度上也決定了AM真菌的多樣性(劉潤進等,2002),植物種類越豐富,AM真菌物種多樣性就越高。嶗山茶區茶樹為南方引進品種,種類繁多,因而AM真菌物種多樣性就可能高于南方茶園(吳鐵航等,1995),本研究結果證實了這一推斷。調查發現,茶樹栽培年限或樹齡也會影響到AM真菌物種多樣性。12個茶園中,常家村茶園(W-2)和萬來客茶園(W-7)2–3年生茶樹根圍AM真菌Shannon-Wiener指數分別為2.04和2.03,顯著高于沙子口萬里江茶園(S-2),后者樹齡10年以上,是南茶北引最早的地區。隨著栽培時間增長,AM真菌優勢菌種不斷積累,非優勢菌種逐漸消失,物種多樣性降低。另外,栽培技術對AM真菌也有較大的影響。例如,Singh等(2008)在栽培條件下分離了27個AM真菌物種,自然條件下分離了35個AM真菌物種,后者的Shannon-Wiener指數更高,認為耕作措施對茶樹根圍AM真菌多樣性產生了消極的影響。連續種植單一作物,AM真菌優勢種會隨著寄主的種類而變化(劉潤進和陳應龍,2007)。嶗山茶區茶樹品種大多引自南方,遺傳背景復雜,加之采用矮化密植的“區田”栽培法,連年栽培不間作,這可能都是本次調查分離到的AM真菌優勢種與江西紅壤茶園、豫南茶園不同的原因。本研究首次證實AM真菌的群落組成與土壤有效磷含量呈最大負相關性,這與以往用高磷抑制AM真菌發育的實驗結果是相符合的。嶗山茶區土壤速效磷的含量一般在55.9–231.6mg/kg之間,長達50余年的高磷環境,使土壤中的AM真菌可能已適應了這一生態條件。是否有可能從中篩選到高效耐磷菌株,這一點有待進一步實驗。土壤有機質含量與AM真菌發育密切相關:在一定范圍內AM真菌的數量隨有機質含量的升高而增多(Wangetal.,2008);然而當有機質含量超過一定范圍,AM真菌的數量就會下降(蓋京蘋和劉潤進2003),本調查通過CCA分析表明有機質含量與嶗山茶區茶樹根圍AM真菌多樣性呈高度正相關,這一結果與該地區土壤有機質含量偏低(0.27–1.94%)有關。而在土壤有機質含量中等到高(2–15%)條件下這一相關性值得深入研究。土壤pH值是影響AM真菌多樣性的重要因子(張美慶等,1999)。本實驗采集土壤樣品的pH值在4.37–6.25之間,對嶗山茶區AM真菌的多樣性影響不大,這說明多數AM真菌對土壤pH值已經產生了一定的適應性。茶樹栽培過程中由于受不合理耕作制度及過量使用氮肥等影響,土壤質量和健康狀況持續下降,鮮葉的產量和品質受到影響,尤其不利于名優綠茶的生產。而AM真菌能夠促進植物對養分和水分的吸收與利用,改善土壤理化特性,促進植物生長,提高作物產量和品質(劉文科等,2006;Yamatoetal.,2008)。Karthikeyan等(2005)研究了6種土著AM真菌Acaulosporascrobiculata、Glomusaggregatum、G.fasciculatum、G.geosporum、Gintraradices和Scutellosporacalospora對苗圃茶樹實生苗生長的影響,認為AM真菌對茶樹生長的促進程度和茶樹對菌根的依賴程度因菌種不同而異以S.calospora的接種效果最好。本調查發現Alaevis、A.undulata與G.occultum與茶樹的親和力最強,可能與茶樹的生長發育密切相關，會進一步影響到茶樹生長發育和茶葉質量。通過進一步的實驗可以篩選到促進